野生動物結核病檢測技術研究進展

植廣林 平曉坤 陳絢姣 趙 琰 梁玉珍 黃 勉 賈 坤*

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農業大學獸醫學院，廣州，510642；3.廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州，510642)

野生動物結核病檢測技術研究進展

植廣林1平曉坤2，3陳絢姣1趙 琰2，3梁玉珍1黃 勉1賈 坤2，3*

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.華南農業大學獸醫學院，廣州，510642；3.廣東省獸醫臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州，510642)

稿件運行過程

野生動物； 結核病； 分枝桿菌； 檢測方法

現今國內外關于野生動物結核病的檢測方法大致上可歸為3類：第一類是細菌學檢測，如涂片鏡檢、細菌培養、動物實驗等；第二類為免疫學檢測，常見的有皮內變態反應等；第三類是分子生物學診斷技術，常見的有PCR、核酸探針技術、LAMP等檢測技術。

中國城市化的進程讓更多的人進入城市，人們接觸野生動物的機會更多是在動物園里，這使得一旦在動物群體中爆發結核病，如果不能及時檢測出來，就有可能爆發大規模的感染。對于結核病的危害在集約化養殖的牧場中每年都會產生巨額的損失，野生動物帶菌狀況更是無法精確統計，所產生的損失和危害無法估計[1]。野生動物活動范圍廣，對人類的警惕性也更強，且具有一定的攻擊性，現行的檢測方法有著其本身的實際使用優勢，但同時由于檢測方法本身的限制，例如野生動物區別于集約化養殖動物，難以保定，采樣困難等，傳統的檢測技術在實際檢測過程中有一定難度。傳統的檢測手段以及現行的先進的實驗室檢測方法雖然都有著各種的限制條件及其本身的不足，但對于建立新的檢測方法具有重要的借鑒意義，同時提供了理論基礎。因此準確了解各種檢測方法的優缺點是很有必要的，本文就現行的對于動物結核病的檢測方法作一簡單的綜述，望能為新的檢測方法提供幫助。

1 細菌學檢測

1.1 抗酸染色法

由于分枝桿菌(Mycobacteriumspp.)的細胞壁內含有大量的脂質包圍在肽聚糖的外面，所以分枝桿菌一般不易著色，經過加熱和延長染色時間可使其固定著色。在分枝桿菌中的分枝菌酸與染料結合后，就可以不被酸性脫色劑脫色而呈現出肉眼可見的紅色，從而達到對病料進行染色的目的[2]。在普通光學顯微鏡油鏡下可檢出抗酸性桿菌。抗酸染色方法常用萋尼二氏染色法，也可用熒光抗酸染色法。如果鏡檢組織內有抗酸性染色的微生物，并且動物組織具有典型的組織學病變，就可以做出初步診斷。雖然抗酸染色法陽性檢出率比較低，但它作為一種傳統的檢測方法，具有假陽性率低、成本低廉、操作簡便快捷等特點[3]。在對于圈養野生動物的檢測上，筆者通過對疑似結核病感染動物進行采樣之后，進行涂片觀察，就可快速做出初步判斷，不需要其他復雜的檢測手段，此法在野生珍稀動物的結核病快速檢測和及時治療上尤為重要，所以該方法在實際應用中具有一定的實用價值。缺點是對于致病性分枝桿菌和非致病性分枝桿菌難以區分，對于菌株的種屬特異性也難以進行區分。

1.2 細菌分離培養法

細菌分離培養常用選擇性培養如羅氏培養基，改良羅氏培養基用來分離分枝桿菌，再通過培養所得菌落性狀和生化試驗來鑒定，也可結合核酸探針和聚合酶鏈式反應(PCR)方法進行鑒定，同時上述抗酸染色同樣可適用于分離培養后的細菌鑒定，本研究目前也建立了結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的PCR檢測技術，在對臨床樣品的檢測中發揮了重要的作用。但如果存在培養物污染或其他的特殊原因，也可通過接種豚鼠，再通過分離鑒定來檢出病原菌。不足之處是在上述培養基中，結核分枝桿菌需經過14～15 h才能分裂擴增一次，這使得整個病原學檢測所需時間較長，一般需10～30 d才能在培養基看到較為清楚的菌落[2]，對于病原菌的檢出陽性率也較低。且在細菌分離培養過程中，出于公共衛生安全以及對實驗人員的保護，一般都需要在生物安全柜中進行接種菌株操作，且需要專業人員在生物安全三級實驗室中進行培養細菌。該檢測方法所需的較長的檢測時間對于快速檢出病原菌的需要存在著先天條件上的不足。由于該方法在檢測時效性以及所需的較高的實驗條件等種種原因的限制，在對于野生動物結核病的檢測上有多種不足，所以在實際工作中很少被采用。

2 免疫學檢測

這類方法的原理主要是通過檢測特異性的抗原抗體免疫反應。通過檢測抗原特異性的T淋巴細胞在體外接受相應抗原刺激活化后分泌的T淋巴細胞活化標記分子，可以判斷機體對某種病原的致敏情況，從而間接反映是否被該病原感染。它是一種快速、簡便的檢查技術，并且在多種疾病的診斷中得到廣泛應用。目前，報道研究最多的免疫學診斷技術主要有γ-干擾素(IFN-γ)診斷法、ELISA(酶聯免疫吸附劑測定)法，ELISPOT(酶聯免疫斑點檢測)法，白細胞介素診斷法等。與PPD皮內試驗相比，上述具有出現反應早相比于PPD皮內試驗所需要的20 d以上的要求，利用類似于γ-干擾素診斷等方法在動物被感染后2～3周即可得到陽性結果，具有快速、靈敏的優點。

2.1 結核菌素(PPD)皮內試驗

結核菌素皮內反應屬于遲發型細胞過敏反應。結核菌或卡介苗進入機體使機體的免疫T淋巴細胞致敏，并在機體內大量分化增殖。當已致敏的機體再次遭受到抗原入侵時，已致敏的淋巴細胞就會與之結合，引起機體被注射部位出現硬塊甚至發生水泡、壞死等變態反應性炎癥。通過對動物注射結核菌素后所出現的一系列炎癥反應來判斷機體是否感染結核桿菌。

通過接種結核菌素一方面可以檢測機體是否感染分枝桿菌。另一方面，通過結核菌素試驗可以判斷接種卡介苗是否接種成功。此方法在長期的生產實踐中被證明是檢測動物結核病的可靠的篩選試驗，在實際的生產生活中被廣泛采用。但該方法的不足之處在于，對因感染其他非致病性分枝桿菌而致敏的動物檢測結果同樣呈陽性，無法通過所出現的免疫反應來判斷為何種致病菌，且在那些因病情嚴重而導致免疫反應低下的動物易出現假陰性。此外，結核菌素皮內試驗需要消耗大量人力，檢驗周期較長，所以有一定的滯后性。由于DTH(遲發型變態反應)的滯后效應，此方法不能在30 d內重復進行。在對已經進行BCG(卡介苗)免疫的動物群體，由于BCG疫苗中含有與PPD相同的抗原成分，因而PPD皮內試驗不能鑒別免疫動物與感染動物[4]。同時對于野生動物來說，野生動物的不穩定性對動物的保定、注射結核菌素以及后期的對注射部位的觀測以確定是否有分枝桿菌感染都是需要顧及到的因素，PPD的質量和劑量，結果判定標準及操作方法等因素均能影響檢測結果，故需嚴格進行質量控制。在一些國家，使用比較結核菌素試驗，即比較皮內試驗(SICTT)，在動物頸部一側的不同部位，同時注射兩種PPD，根據出現的不同反應，能夠提示被檢動物是結核桿菌感染還是非特異的DTH反應[4]。

2.2 γ-干擾素(IFN-γ)檢測

該檢測方法由Wood等人于1990年建立，其原理為致敏的外周血淋巴細胞在體外培養的條件下，接受特異抗原(如PPD)刺激后被活化，表達并分泌IFN-γ，通過一定的技術手段對培養上清中的IFN-γ進行檢測(如ELISA)，或者對IFN-γ mRNA的表達進行定量或者半定量(如RT-PCR)檢測，還可通過ELISPOT技術對分泌IFN-γ的淋巴細胞進行計數(形成的斑點數)及對單個細胞分泌的IFN-γ進行定量(形成的斑點大小)檢測，其結果與淋巴細胞增生試驗具有很好的相關性[5]。具體操作，將1mL的肝素抗凝血液和PPD在37℃培養過夜，第二天收集血漿樣品并以夾心ELISA檢測IFN-γ[6]。用作全血培養刺激物的抗原是Mycobacteriumbovis的PPD和Mycobacteriumavium的PPD(后者用于檢查交叉反應)。該測定系統簡便、快速，便于用作疫情監測時大量樣品的測試。與皮內變態反應相比，該方法減少了操作中的主觀性，其敏感性和特異性更高，在皮內試驗進行后再進行IFN-γ試驗，其靈敏度和特異性未有顯著影響(分別為85%和93%)，因此可以作為皮內試驗理想的補充試驗[7]。γ-干擾素釋放對淋巴細胞轉化試驗的主要技術障礙是在采血后需盡快處理血液樣品，且實驗費用高昂，限制了該方法從研究到臨床的實際應用。

2.3 白細胞介素檢測

感染分枝桿菌后的機體多呈現以細胞免疫為主的免疫反應，IL-2主要由刺激活化后的T淋巴細胞分泌，可以作為T淋巴細胞介導的免疫反應的指標。由于IL-2具有刺激成淋巴細胞增生的特性，通過測定牛外周血淋巴細胞(PBL)經抗原刺激培養后的上清中IL-2的生物活性，以重組人IL-2建立的標準曲線作對照，可以IL-2活性進行半定量測定。以此來檢測機體是否感染結核分枝桿菌。結核分枝桿菌能夠通過刺激機體單核巨噬細胞來合成并釋放IL-6[8]。結核分枝桿菌的內毒素脂多糖(LPS)可刺激單核細胞釋放IL-6增多[9]。IL-6的水平與結核病的感染有重要關系，是結核病診斷的潛在標志物，IL-6水平檢測可輔助診斷結核病。對于IL-6的檢測常用方法如ELISA法，放射免疫檢測法，酶聯免疫斑點法等方法[10]。IL-6的最低檢測量可達3pg/mL[11]，靈敏度較高。聯合IL-2，IL-6，IFN-γ不但可以更加準確的檢測出機體感染分枝桿菌的情況，而且還可以在檢測活動性結核病與潛伏性結核感染鑒別診斷中提供有力依據[12]。

2.4 ELISA檢測技術

ELISA技術是利用抗原抗體專一性鍵結合的特性進行抗原或抗體檢測。在多種動物疾病診斷中發揮著重要作用，近年來深受動物疫病篩查工作者的喜愛。結核分枝桿菌感染后由于細胞免疫起決定作用，因此對于結核桿菌感染后所產生的血清抗體有限，如何發現這些抗體并建立有效的ELISA檢測技術，給科研工作者帶來了挑戰，目前本項目篩選了多個基因片段，開展ELISA檢測技術的研究，以期獲得特異性好、靈敏度高的ELISA檢測技術來提高結核病的檢出率。

3 分子生物學診斷

3.1 聚合酶鏈反應(PCR)技術

PCR技術在生命科學領域經過數年的努力積累了大量的資料和經驗，使這一方法不斷完善，其反應靈敏、特異、快速的特性在多數報告中得到肯定[13]。該檢測方法首先要選擇合適的DNA片段，其次引物設計要符合一定的原則，這直接關系到臨床樣本檢測的敏感性和特異性，通過對不同的特異區段設計相應引物，能夠鑒別各種分枝桿菌。再者要注意結核桿菌DNA的處理。結核桿菌的細胞壁具有特殊性，能否有效的破裂其細胞壁而使DNA釋放，是提高臨床樣品中結核桿菌檢出率的關鍵，可以采用經典法、煮沸法、超聲粉碎法等。PCR自20世紀80年代問世以來，被大量用于結核病實驗室研究及臨床診斷，但由于很多問題如易污染、假陽性高、使用致癌物(溴化乙啶)、操作繁瑣等曾一度被質疑，為此研究人員正在不斷開發出新的高靈敏度和高特異性的PCR方法，如反轉錄PCR法、套式PCR法、單管套式反轉錄PCR法、實時熒光PCR、酶聯PCR等[14-15]，本實驗室根據不同類型分枝桿菌的特異片段，建立了結核分支桿菌的PCR分類鑒定技術，在對臨床病例的檢測中，能夠準確區分結核分支桿菌、牛分支桿菌及非結核分枝桿菌。

由于PCR方法檢測的是核酸，故一般PCR方法無法鑒定死菌和活菌，不能區別活動型和靜止型結核病，更不能給臨床治療提供有效的監測手段。反轉錄PCR雖然能檢測活菌，但其對樣本處理要求較高而目前仍難以在臨床上推廣應用。綜上所述，PCR方法在結核病分子診斷中己展現了巨大的應用價值。但臨床實驗室必須在充分了解PCR測定具有不確定性基礎上，采取相應質控措施，才能確保試驗結果的準確性，而不致出現重大判斷失誤。因為PCR擴增可得到極大的檢測靈敏度，但同時其對檢測中的錯誤也有極大的放大作用。因此，對于PCR檢測結果的報告必須慎重。必須有相應嚴格質量控制措施，如內質控、陰性和陽性質控的情況下重復測定，才可報告檢測結果，并對檢測做出實事求是的解釋[16]。

3.2 核酸探針技術

PCR-熒光探針技術是采用雙重PCR技術和Taqman探針技術相結合，通過在臨床患病動物的痰標本中提取分枝桿菌核酸進行定性檢測，分別針對結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的特異性序列設計引物和探針，探針分別標記不同的熒光發光基團，通過監測不同熒光通道的熒光信號變化，檢測結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌感染，該技術具有特異性強、靈敏度高、簡便易行等優點[17]。應用PCR-熒光探針法在臨床標本中進行大樣本快速檢測和鑒別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，這一點對于群居性動物的結核病快速檢測具有很高的應用價值，目前國內的博奧生物有限公司生產的分枝桿菌核酸檢測試劑盒可以快速檢測和區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，1 d可以完成診斷檢測，國內已經有研究報道這一技術[18]，這一技術對于快速分檢出結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，為臨床治療提供了有力的幫助。

4 小結

綜上所述，現行的對于結核病原菌的檢測方法都有著自己本身的優缺點，細菌分離培養方法雖然實驗方法簡單且可以準確進行結核病的診斷及病原的分析，但是由于在傳統培養基培養結核桿菌方法中對于培養過程中的實驗條件要求過高，出于生物安全方面的考慮所需要的條件并不適合于野生動物的結核病菌檢測，且培養過程中結核桿菌生長緩慢，不利于對疑似感染動物進行快速處置及采取相應防控措施，隨著科研方面的發展近年來出現了一系列的快速培養系統，這些快培系統的共同點是均使用液體培養基，培養過程中細菌生長于一個相對密閉安全的環境中，在這些培養基中由于培養基內所添加的營養物質，分枝桿菌在培養基中初代分離率高于L-J法，得到檢測結果所需要的時間也少于L-J法[15]，隨著培養方法的進步，結合PCR技術極大的檢測靈敏度，兩者結合會是一個適合快速準確判斷機體是否感染結核桿菌的檢測方法。

現行的免疫學檢測雖然簡單易行，但由于目前試劑昂貴，導致大規模實施的成本過高，落實推廣尚有待時日。分子生物學檢測方面，目前應用ELISPOT方法檢測細胞因子(尤其是IFN-γ)，PCR檢測技術特別是核酸探針技術已經在醫學領域得到了廣泛應用。這些先進的檢測技術具有傳統檢測方法所不具有的快速性、準確性。經過改良過后在野生動物結核病檢測上將具有廣闊的應用前景。因此，將現行的醫學領域已經成熟的檢測方法進行改良將會成為野生動物結核病檢測的研究熱點。

[1] Cousins D V.Mycobacteriumbovisinfection and control in domestic livestock[J].Revue Scientifique et Technique(International Office of Epizootics)，2001，20(1)：71-85.

[2] 陸承平.獸醫微生物學[M].南京：中國農業出版社，2001：331-336.

[3] 常曉輝.臨床5種檢測結核分枝桿菌方法的比較研究[J].上海醫學檢驗雜志，2002，17(4)：226-229.

[4] 劉金曄，郝永清.牛結核病檢疫方法研究進展[J].中國畜牧獸醫，2011，38(5)：146-151.

[5] Anthony D D，Lehmann P V.T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach[J].Methods，2003，29(3)：260-269.

[6] Ng K H，Aldwell F E，Wedlock D N，et al.Antigen-induced interferon-γ and interleukin-2 responses of cattle inoculated withMycobacteriumbovis[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，1997，57(1/2)：59-68.

[7] Ryan T J，Buddle B M，De Lisle G W.An evaluation of the gamma interferon test for detecting bovine tuberculosis in cattle 8 to 28 days after tuberculin skin testing[J].Research in Veterinary Science，2000，69(1)：57-61.

[8] 孫永紅，劉瀟瀟，郭梅，等.白細胞介素-6基因多態性與肺結核易感性的關系研究[J].現代預防醫學，2008，35(19)：3796-3798，3802.

[9] 陳家福，殷志偉.SLE患者外周血單個核細胞分泌IL-6的研究[J].上海免疫學雜志，1993，13(5)：294-295.

[10] 趙琰楓，趙秀萍，馮曉燕，等.白細胞介素6與結核分枝桿菌感染和診斷的研究進展[J].生物技術通訊，2015，26(2)：294-297.

[11] Chowdhury I H，Ahmed A M，Choudhuri S，et al.Alteration of serum inflammatory cytokines in active pulmonary tuberculosis following anti-tuberculosis drug therapy[J].Molecular Immunology，2014，62(1)：159-168.

[12] Tsao T C Y，Hong J，Huang C，et al.Increased TNF-α，IL-1β and IL-6 levels in the bronchoalveolar lavage fluid with the upregulation of their mRNA in macrophages lavaged from patients with active pulmonary tuberculosis[J].Tubercle and Iung Disease，1999，79(5)：279-285.

[13] Miller J M，Jenny A L，Payeur J B.Polymerase chain reaction detection ofMycobacteriumtuberculosiscomplex andMycobacteriumaviumorganisms in formalin-fixed tissues from culture-negative ruminants[J].Veterinary Microbiology，2002，87(1)：15-23.

[14] Tanaka I I，Anno I S，Leite S R，et al.Comparison of a multiplex-PCR assay with mycolic acids analysis and conventional methods for the identification of mycobacteria[J].Microbiology and Iimmunology，2003，47(5)：307-312.

[15] 周華.結核病檢測技術研究進展[J].現代預防醫學，2013，40(8)：1492-1494.

[16] 楊偉洪，陳罡，羅殿中.PCR檢測結核桿菌的優越性及局限性分析[J].國際醫藥衛生導報，2006，12(10)：141-144.

[17] 梁建琴，李洪敏，高華方，等.應用PCR-熒光探針法快速檢測耐多藥結核分枝桿菌基因型[J].中華醫院感染學雜志，2013，23(21)：5140-5142.

[18] 梁建琴，高華方，李洪敏，等.PCR熒光探針法快速檢測結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌[C]//中華醫學會結核病學分會.中華醫學會結核病學分會2011年學術會議論文匯編，2011：20-22.

Wild animal； Tuberculosis； Mycobacteria； Testing

結核病(Tuberculosis，TB)是一種人獸共患的慢性消耗性傳染病，該病感染宿主廣泛，可以交互傳染，很難根絕。近年來野外和圈養野生動物的結核病疫情呈現增高的趨勢，不但造成重大經濟損失，而且影響到公共衛生安全。野生動物的結核病主要是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)所引發，其感染宿主譜很廣，并具有或潛在具有傳播給人類的能力。因此，建立快速準確的結核病檢測方法意義重大。現在較為廣泛使用的結核病檢測方法主要分為3大類，分別是細菌學檢測、免疫學檢測以及分子生物學診斷，但是這些檢測方法仍存在許多問題。目前對于野生動物結核病檢測迫切需要新的快速、靈敏、特異的動物結核病診斷方法。本文就現行的檢測技術研究進展作一簡要概括。

The Progress in Testing Technology ofTuberculosis in Wild Animal

Zhi Guanglin1Ping Xiaokun2，3Chen Xuanjiao1Zhao Yan2，3Liang Yuzhen1Huang Mian1Jia Kun2，3*

(1.Guangzhou Zoo，Guangzhou，510070，China；2.College of Veterinary Medicine，South China Agriculture University，Guangzhou，510642，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Prevention and Control for Server Clinical Animal Diseases，Guangzhou，510642，China)

Tuberculosis(TB)is a progressive wasting disease which is a zoonosis.In recent years，the frequency of TB epidemics in wild and captive wildlife has been increasing due to the infection ofMycobacteriumtuberculosisandMycobacteriumbovis.This disease has caused enormous economic loss and affects human public health over the long-term because of the potential risks of the transmission of the disease to humans.The rapid and accurate detection of TB is important.Based on our literature review，contemporary TB testing technologies include microbiological detection，immunological assay，and molecular biological diagnosis.However，because there are still some problems with these methods，new rapid，sensitive and specific animal TB diagnosis methods are needed.This paper briefly summarizes the progress of TB diagnosis and quarantine technologies.

植廣林，男，37歲，碩士，獸醫師；從事野生動物疾病研究。E-mail：zhiguanglin@163.com

*通訊作者：賈坤，E-mail：jiakun@scau.edu.cn

2016-08-15

S855.2 S858.9

A

修回日期：2016-08-29

發表日期：2017-02-10

2310-1490(2017)01-148-05