一氧化氮及其衍生物在缺血性腦血管病中的作用

黃語悠 房亞蘭 劉克建 趙詠梅

(首都醫科大學宣武醫院 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100053)

· 腦血管病、認知障礙的基礎及臨床研究 ·

一氧化氮及其衍生物在缺血性腦血管病中的作用

黃語悠 房亞蘭 劉克建 趙詠梅*

(首都醫科大學宣武醫院 北京市老年病醫療研究中心 神經變性病教育部重點實驗室 腦血管病轉化醫學北京市重點實驗室，北京 100053)

缺血性卒中是導致死亡的主要原因，也是世界上最常見的致殘原因之一。腦缺血損傷能促進一氧化氮(nitric oxide， NO)的形成。過量的NO在缺血性腦損傷的發展過程中起著至關重要的作用。NO可能通過直接攻擊蛋白質和脂質等生物大分子、破壞線粒體功能，或間接影響細胞信號轉導通路和基因調控，從而加重缺血性腦損傷。過量的NO可能具有神經毒性，導致興奮性神經毒性級聯反應、炎性反應和細胞凋亡。然而，NO也可能在腦缺血過程中發揮神經保護作用。本文擬對NO及其衍生物在腦缺血損傷中的作用進行綜述。

一氧化氮；缺血性腦血管病；過氧亞硝基陰離子；三氧化二氮

一氧化氮(nitric oxide， NO)是一種無負荷、自由基性質的小分子，作為生物信使分子，在動物體內發揮著重要作用。其化學結構非常簡單，半衰期極短，性質極為不穩定。

因NO相對分子質量小，且帶有不成對電子，親脂性強，因而能夠以自由擴散的方式通過細胞膜，進而能夠特異地參與機體的生理及病理過程，是極為重要的信息分子。NO既能導致炎性反應、興奮性毒性和凋亡，發揮神經毒性作用，又能抑制血小板聚集、白細胞黏附，舒張血管，維持血流量[1]。

1 NO在體內的來源及作用

1.1 體內NO的來源

1.1.1 經NOS途徑產生的NO

根據NOS的來源和表達方式不同，NOS可分為3種類型：內皮細胞型NOS(endothelial NOS， eNOS) 、神經元型NOS(neuronal NOS， nNOS)和誘導型NOS(inducible NOS， iNOS)。

神經組織內nNOS和血管內皮細胞中的eNOS在生理條件下即可廣泛表達，產生的NO作為生物信使分子和血管活性因子，介導信息傳遞、記憶形成、調節腦血流等。而在病理條件下，炎性細胞、巨噬細胞和膠質細胞等表達的iNOS大量增加，產生過量的NO，進而在中樞神經系統發揮神經毒性作用，所以iNOS被認為是一種“病理型”的酶[1]。

1.2 NO在體內的作用

NO在體內的作用可分為直接作用和間接作用[4]。當NO的局部濃度低于μmol/L水平時，可迅速與鳥苷酸環化酶等反應，發揮生理作用，即NO的直接作用。而NO的“毒性作用”是指病理條件下，局部NO濃度劇升，與周圍的氧自由基等反應生成活性氮氧化合物，再由活性氮氧化合物發揮細胞毒性作用，造成組織損傷[5-6]。

1.3 介導NO間接作用的衍生物的生成

1.4 ONOO-與N2O3的氧化作用

1.4.1 ONOO-介導的氧化應激

ONOO-是一種強氧化劑，可使許多重要的蛋白質或酶失活，破壞線粒體結構，影響細胞代謝，并使DNA鏈斷裂，誘發脂質過氧化，最終導致組織損傷[9]。3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)是ONOO-氧化的穩定產物，目前已在多種疾病中被檢測到，3-NT的多少與組織損傷成正相關，故3-NT也可作為檢測組織內NO及其衍生物含量的有效指標。

1.4.2 N2O3及其衍生物介導的亞硝基化應激

N2O3性質不穩定，能夠與氨基、巰基等發生反應，產生亞硝基胺和亞硝基硫醇等[10]。其中，亞硝基胺可破壞某些蛋白質對于DNA的修復功能，導致DNA突變、受損，最終引起細胞死亡。而亞硝基硫醇的作用廣泛，它能生成NO，使血管舒張；也能通過對氧化態的NO基團進行轉移，進而調控基因轉錄。并且亞硝基硫醇能夠抑制某些酶和蛋白的活性，干擾細胞代謝，誘導細胞死亡。

N2O3與不同的底物反應，導致不同的亞硝基化應激，可以損傷細胞，也可以保護細胞。如脂多糖/干擾素-γ誘導小鼠原代巨噬細胞產生的氧化應激并不強，但會造成強烈的亞硝基化應激，使蛋白質亞硝基化水平顯著升高，造成細胞死亡[11-12]。此外，研究[13]顯示，NMDA引起神經細胞損傷，但氧化態NO基團可使NMDA受體亞硝基化，從而降低該受體活性，保護神經元。

2 NO及其衍生物的檢測

NO及其衍生物的測定對理解疾病的病理、生理過程有著重要的意義。但是由于細胞內NO釋放量低，且釋放后的NO能夠迅速擴散并與體內其他分子發生反應，因此體內NO的測定比較困難。

作為目前比較常見的NO熒光探針，DAF需要與氧化的NO產物進行反應。因此，DAF在缺氧條件下對NO的檢測效果不理想[18]。魯米諾法[19]測定NO則是通過將體內NO氧化生成ONOO-后與魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰肼)反應發出強光，此法的缺陷在于易受到體內還原性物質的影響。

配位化合物MNIP-Cu在富氧和缺氧條件下均可快速且特異性地與NO反應，產生具有藍色熒光的產物[20]。Horn等[21]通過自行合成的MNIP-Cu探針檢測冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)病人血漿中NO濃度；將自行合成的MNIP-Cu溶液注入活體大鼠腦室，可于大腦切片中觀察到藍色熒光信號，且信號強度與腦中NO濃度成正比[22]。

3-NT是ONOO-使酪氨酸等氨基酸硝基化的產物，因此可以通過檢測3-NT來間接反映體內ONOO-的水平。本課題組前期研究[24]通過檢測腦組織中3-NT，發現常壓高濃度氧可降低腦缺血后腦組織中的NO。用免疫組織化學法檢測SD大鼠胸主動脈的3-NT表達，發現老年鼠血管中3-NT的表達較年輕大鼠明顯升高[25]。減少過氧化氫誘導的NO和3-NT產生，對神經細胞具有保護作用，可以減輕腦缺血再灌注損傷[26-27]。

3 NO與缺血性腦損傷

3.1 腦缺血性損傷過程中NO的來源

在缺血超早期，eNOS產生的NO的毒性作用可被側支循環的增加抵消，故對缺血再灌注產生的影響很小。雖然nNOS和iNOS生成的NO均可導致神經毒性損傷，但由于nNOS半衰期短，產生的NO較少，對神經組織的損傷作用較小，因此在缺血再灌注后期影響甚微。用nNOS抑制劑—7-硝基吲唑對大鼠進行預處理可將NOx產生峰延遲至30 min并減弱NOx的總量，說明缺血超早期主要通過上調nNOS表達產生NO[24]。病理條件下經48 h方可誘導iNOS mRNA的表達，產生大量的NO，且iNOS mRNA的半衰期很長，一經誘導合成，即可持續翻譯合成iNOS，進而促使大量的NO產生，引起遲發性腦損傷，因此在缺血再灌注中的作用至關重要[1，29]。使用iNOS基因敲除鼠制備大腦中動脈梗死(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型或在小鼠MCAO模型中使用iNOS抑制劑，均可顯著減輕缺血半暗帶區的神經損傷，減少梗死體積[30]。

3.2 缺血-再灌注過程中NO的變化規律

有研究[5，30]顯示，腦缺血后，nNOS和eNOS介導NO迅速升高，于5～15 min達到高峰，之后60 min內下降至缺血前水平。若缺血繼續，則NO繼續下降。到再灌注時NO又逐漸升高，至再灌注24 h達到高峰，再灌注7 d時NO仍高于缺血前水平。如果缺血時間超過6 h，炎性反應細胞表達的iNOS可使NO再次升高[5，30]。研究[1，31]表明，不同的缺血方式引起iNOS表達的時間也不同。iNOS mRNA在永久性MCAO后6 h開始表達，2 d達到高峰；而短暫性MCAO后，iNOS mRNA在再灌注后12 h即達到高峰，4 d左右恢復至缺血前水平。

3.3 缺血-再灌注時NO的作用及機制

研究[1，32]顯示，使用eNOS基因缺陷小鼠制備MCAO模型，其梗死體積比野生型小鼠增大，說明eNOS合成的NO具有保護腦缺血損傷的作用。局灶性腦缺血2 h再灌注早期(15 min)，半暗帶區的神經細胞及血管eNOS表達上調，但未見iNOS表達，說明此時腦內的NO主要來源于eNOS，其可能通過抑制血小板聚集、白細胞黏附，舒張血管等功能增加側支循環、防止微血管堵塞，維持腦血流，減輕腦損傷。此外，NO也能抑制Ca2+通過NMDA受體內流，進而抑制谷氨酸的神經毒性[33]。

4 總結

NO及其衍生物在腦缺血損傷中發揮了重要作用，明確其在缺血性腦血管病中的作用機制，對探明腦缺血再灌注過程的病理生理變化具有重要意義，并可能為腦損傷與腦保護劑的研究開辟新視野。已有研究[30-35]表明，在腦缺血再灌注過程中，給予選擇性iNOS抑制劑或促進eNOS活性，可以減少缺血再灌注損傷，保護半暗帶神經元，這為缺血性腦血管病的治療提供了新思路。但關于NO及其衍生物，目前還有許多問題沒有闡明。NO及其衍生物在腦缺血損傷中的作用值得深入探索與研究。

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編輯 慕 萌

Role of nitric oxide and its derivatives in ischemic cerebrovascular disease

Huang Yuyou， Fang Yalan， Liu Kejian， Zhao Yongmei*

(XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity，BeijingGeriatricMedicalResearchCenter，KeyLaboratoryofNeurodegenerativeDiseasesofMinistryofEducation，BeijingKeyLaboratoryofTranslationalMedicineforCerebrovascularDiseases，Beijing100053，China)

Ischemic stroke is the major cause of death and remains as one of the most common causes of disability worldwide. It is well known that cerebral ischemic injury enhances the formation of nitric oxide (NO). It is believed that excessive NO production plays an important role in the development of ischemic brain injury. NO probably contribute to ischemic injury by attacking macromolecules directly, including proteins and lipids, and disrupting mitochondrial function, or indirectly affecting cellular signaling pathways and gene regulation. Excessive production of NO may be neurotoxic, which leads to cascade reactions of excitotoxicity, inflammation and apoptosis. However, NO may also play a neuroprotective role in brain ischemia processes. In this paper, the role of NO and its derivatives in cerebral ischemic injury are reviewed.

nitric oxide (NO); ischemic stroke; peroxynitrite；N2O3

國家自然科學基金(8161001163)，北京市自然科學基金(7122036)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (8161001163)， Natural Science Foundation of Beijing (7122036).

時間：2017-01-17 23∶54

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170117.2354.054.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.01.014]

R 743.31

2016-11-28)

*Corresponding author， E-mail：yongmeizhao@hotmail.com