丹皮酚、丁香酚、胡椒堿經皮微透析體內外回收率的研究

楊暢++白潔++杜守穎++崔雅華++張勤帥++馬軍明

[摘要] 建立活血止痛膏中有效成分丹皮酚、丁香酚、胡椒堿微透析體內外回收率校正方法，為其經皮藥動學研究提供依據。利用高效液相色譜法測定透析液中丹皮酚、丁香酚、胡椒堿的濃度，并計算微透析探針回收率；研究濃度、校正方法對3種成分微透析探針回收率的影響，并考察探針吸附性、體內外回收率的穩定性和重復性。結果表明，以30%乙醇生理鹽水作為灌流液時，探針對3種成分均無明顯的吸附，短時間內即可從探針上被完全洗脫下來；在8 h 內，3種成分體內外回收率均能保持穩定；交替用含藥溶液和空白灌流液灌流探針3次，3種成分體內外回收率基本不變。不同質量濃度丹皮酚（2.46～53.64 mg·L-1）、丁香酚（4.26～32.15 mg·L-1）和胡椒堿（5.75～45.87 mg·L-1）體外回收率分別為（45.7±4.66）%，（41.3±3.96）%，（27.82±2.95）%，即3種成分的探針回收率對濃度沒有依賴性；在相同條件下，零凈通量法、透析法和反透析法所測得的探針體外回收率幾乎相等。因此，采集部位藥物的濃度可用體外測得的回收率或在體回收率進行校正。同時也證明了該研究建立的微透析方法可用于活血止痛膏的經皮藥動學研究。

[關鍵詞] 微透析； 探針回收率； 丹皮酚； 胡椒堿； 丁香酚

In vitro and in vivo recoveries of cutaneous microdialysis probe of paeonol， eugenol and piperine

YANG Chang， BAI Jie*， DU Shouying*， CUI Yahua， Zhang Qinshuai， Ma Junming

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To establish a method for detecting microdialysis recovery of paeonol， eugenol and piperine in Huoxue Zhitong patch， in order to provide the basis for further percutaneous pharmacokinetics studies. The concentrations of paeonol， eugenol and piperine in dialysates were determined by HPLC， and probe deliveries were calculated respectively. The effects of concentration and calibration approaches on the microdialysis probe deliveries of the three components were investigated， and their probe absorbability， in vitro and in vivo probe stability and repeatability were also studied.The results indicated that little paeonol， eugenol and piperine were observed in probes with 30% alcohol as the perfusate， and could be cleaned from probe in a short time. And the in vivo and in vitro probe deliveries of three components were stable within 8 h， drugcontaining solution and blank perfusate were alternatively used for three times， and the in vivo and in vitro probe deliveries of three components were basically unchanged. The in vitro recoveries of paeonol， eugenol and piperine with a range of concentration were respectively （45.7±4.66）%， （27.82±2.95）%， （41.3±3.96）%， which indicated no concentration independent. Under the same conditions， the similar delivery was observed by dialysis， retrodialysis and nonet flux. Therefore， the concentrations of analyses of the collected fraction could be calibrated by in vitro or in vivo recoveries. Meanwhile， this also proved that the microdialysis method built by this study is applicable to the study on percutaneous pharmacokinetics of Huoxue Zhitong patch.

[Key words] microdialysis； probe delivery； paeonol； eugenol； piperine

doi：10.4268/cjcmm20162226

活血止痛膏應用歷史悠久，能夠活血止痛、舒筋通絡，臨床上廣泛用于筋骨疼痛、肌肉麻痹、痰核流注、關節疼痛等的治療。其中牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.為方中君藥，與當歸、川芎等配伍能夠活血化瘀止痛，胡椒Piper nigrwm L.，丁香Eugenia caryophyllata Thunb.等辛溫之品，加強散寒止痛之功。丹皮酚（paeonol，Pae）、丁香酚（eugenol，Eug）和胡椒堿（piperine，Pip）分別是牡丹皮、丁香和胡椒的主要活性成分，均為活血止痛膏中的有效成分[1]。通過檢測局部給藥后有效成分的吸收，來判斷在一定時間內組織、器官中藥物的濃度是否達到治療量，可以指導經皮藥用輔料、載藥體系及給藥方法的優選及應用。

本研究建立丹皮酚、丁香酚、胡椒堿體內外微透析回收率的測定方法，考察將微透析技術應用于活血止痛膏經皮藥動學研究的可行性，為活血止痛膏經皮藥動學評價提供依據。

1 材料

Waters e2695高效液相色譜儀（2998 PDA檢測器，四元梯度泵，控溫自動進樣器，柱溫箱，溶劑脫氣機，Empower工作站）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；微透析系統，包括Pump 11 Elite 型微量注射泵（HARVARD APPARTUS），2.5 mL 玻璃注射器（Hamilton），CMA 30 線性微透析探針（CMA，半透膜長度為1 cm，截留相對分子質量6 000）；KQ5200DA數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；1 mL 一次性注射器（常州悅康醫療器材有限公司）；津騰尼龍66孔徑0.45 μm微孔濾膜；TK20B型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；MP5002型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

丹皮酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110708201407）；丁香酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110725201414）；胡椒堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110775201405）；丹皮酚藥品（成都曼斯特生物科技有限公司和中國科學院成都生物研究所研制，批號MUST15020401）；丁香酚藥品（SigmaAldrich公司，批號STBC6086V）；胡椒堿藥品（成都曼斯特生物科技有限公司和中國科學院成都生物研究所研制，批號MUST15071310）。甲醇（Fisher公司，色譜純）；純凈水（娃哈哈集團有限公司）；乙酸（Fisher公司，色譜純）；無水乙醇（北京化工廠，分析純），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 透析液中Pae，Eug及Pip 含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件與系統適用性 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇酸水（乙酸調節pH至2.8），梯度洗脫，洗脫梯度見表1，流速1.0 mL·min-1；檢測波長Pae 274 nm，Eug 280 nm，Pip 343 nm[1]；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。

2.1.2 對照溶液的制備 精密稱定Pae對照品5.41 mg，Pip對照品5.11 mg，Eug對照品54.38 mg于10 mL量瓶中，用無水乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，配成質量濃度分別為541，511，5 438 mg·L-1的對照品儲備液。將各對照品儲備液用30%乙醇溶液稀釋，分別得到低（Pae，Eug，Pip質量濃度分別為2.45，6.45，1.42 mg·L-1）、中（Pae，Eug，Pip質量濃度分別為12.75，35.20，13.50 mg·L-1）、高（Pae，Eug，Pip質量濃度分別為53.64，96.10，32.14 mg·L-1）的對照品溶液。

2.1.3 方法的專屬性 將空白灌流液，Pae，Eug，Pip 混合對照品溶液，以及透析液樣品注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下，Pae，Eug，Pip的峰形良好，無雜質峰干擾，對稱因子、理論塔板數、分離度均符合要求，說明本方法具有較好的專屬性，見圖1。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密移取一定量的對照品儲備液，以30%乙醇

分別稀釋成不同濃度的混合對照品溶液。按2.1.1項下色譜條件檢測，以待測成分質量濃度C （mg·L-1）為橫坐標，以待測成分峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，得到Pae， Eug，Pip的標準曲線。Pae在0.865 6～108.2 mg·L-1線性關系良好，標準曲線回歸方程為A=52 868C-23 645，r=0.999 6；Eug在0.852 4～106.55 mg·L-1線性關系良好，標準曲線回歸方程為A=9 705.7C-5 303.9，r=0.999 5；Pip在0.817 6～102.2 mg·L-1線性關系良好，標準曲線回歸方程為A=70 932C-38 598，r=0.999 2。

2.1.5 穩定性試驗 分別取低、中、高3種濃度Pae，Eug，Pip混合30%乙醇溶液于2，4，6，8，10，12，24 h進樣，測定3種成分的峰面積，計算RSD。Pae從低濃度到高濃度RSD分別為1.2%，0.62%，0.34%；Eug從低濃度到高濃度RSD分別為1.6%，0.53%，0.35%；Pip從低濃度到高濃度RSD分別為1.1%，0.48%，0.36%，說明在此條件下，3種成分24 h內穩定性良好。

2.1.6 精密度試驗 分別取低、中、高濃度的Pae，Eug，Pip混合30%乙醇溶液，按2.1.1項下的色譜條件在1 d內各連續進樣3次，記錄峰面積，計算RSD。Pae從低濃度到高濃度RSD分別為2.3%，0.37%，1.3%；Eug從低濃度到高濃度RSD分別為0.65%，0.80%，1.2%；Pip從低濃度到高濃度RSD分別為2.0%， 0.57%，1.3%，說明在此條件下，該儀器精密度良好。

2.2 線性微透析探針體外回收率方法的建立

2.2.1 透析法 將線性探針有效滲析窗完全浸沒在空白灌流液中，持續加熱攪拌[（32.5±0.2） ℃，350 r·min-1] [2]。用空白灌流液灌流探針1 h，流速1.5 μL·min-1。隨后將透皮池內溶液換成含一定濃度藥物的溶液，繼續灌流，每20 min收集1次微透析樣品（每次30 μL）。

2.2.2 反透析法 將線性探針有效滲析窗完全浸沒在空白灌流液中，持續加熱攪拌[（32.5±0.2） ℃，350 r·min-1]。用空白灌流液灌流探針1 h，流速1.5 μL·min-1。隨后用上述相同濃度藥液灌流探針，每20 min收集1次微透析樣品（每次30 μL）。

2.2.3 探針吸附性考察[3] 分別采用透析法和反透析法考察探針吸附性，收集6次微透析樣品后，將含藥溶液換成空白灌流液，繼續灌流，間隔20 min，共收集12次微透析樣品，用HPLC測定樣品中藥物含量。以取樣時間為橫坐標，吸附率為縱坐標，繪制吸附率時間曲線（吸附率=該點透析液濃度/各時間點透析液最高濃度×100%）。Pae，Eug，Pip在30%乙醇生理鹽水作為灌流液的條件下，微透析探針吸附率隨時間的變化見圖2。

虛線處為將灌流液由含藥溶液更換為空白灌流液時間；A.透析法； B.反透析法（圖3同）。

從圖2可以看出，當探針外Pae，Eug，Pip濃度高于探針內部時，將藥液更換成空白溶劑后，透析液中3種成分的濃度迅速降低，20 min 后Pae，Eug，Pip的吸附率分別為9%，4%，13%，從探針上完全洗脫下來的時間分別為40，20，60 min；當探針外Pae，Eug，Pip濃度低于探針內部時，將藥液更換成空白溶劑后，透析液中3種成分的濃度迅速降低，40 min 后Pae，Eug，Pip的吸附率分別為11.5%，7.3%，12.8%，從探針上完全洗脫下來的時間分別為60，40，80 min。

2.2.4 探針日內穩定性考察[5] 分別采用透析法和反透析法，連續收集樣品480 min，利用HPLC測定透析液中藥物濃度，計算探針的回收率，考察線性探針在480 min內回收率的穩定性。Pae，Eug，Pip在體外微透析環境下，探針穩定性見圖3。

由圖可知，在8 h內，透析法測得的Pae，Eug，Pip的微透析探針回收率分別為（40.93±0.68）%，（32.07±2.29）%，（22.91±1.20）%；反透析法測得Pae，Eug，Pip的微透析探針回收率分別為（36.9±2.33）%，（32.84±1.97）%，（38.52±2.61）%，3種成分在測定時間內探針體內外回收率均能保持穩定。

2.2.5 探針日內重復性考察[5] 采用透析法測定探針的日內重復性，收集6次樣品后將含藥溶液換成空白灌流液，繼續用空白灌流液灌流，收集6次透析樣品；重復上述步驟3次。利用HPLC測定透析液中的藥物濃度，按透析法計算微透析探針的回收率，見圖4，Pae，Eug，Pip線性微透析探針的日內回收率分別為（40.52±0.45）%，（33.84±0.51）%，（25.96±2.42）%，日內重復性良好。

2.2.6 藥物濃度對探針體外回收率的影響[5] 采用反透析法考察濃度對探針回收率的影響，用一系列含有不同濃度Pae，Eug，Pip的混合溶液灌流探針，流速1.5 μL·min-1，每20 min收集1次微透析樣品（每次30 μL），收集6次。每次更換灌注液前需用灌注液平衡1 h。利用HPLC測定透析液中藥物濃度，分別繪制濃度回收率曲線，見圖5。由結果可知，Pae，Eug，Pip的回收率分別為（45.7±

2.2.7 校正方法對探針回收率的影響[7] 采用反透析法測定校正方法對探針回收率的影響，以一系列含不同濃度Pae，Eug，Pip的灌流液進行灌注，灌注液濃度見表2。每次更換灌注液前需用空白灌注液平衡1 h，每20 min收集1次樣品，重復收集6次。利用HPLC測定透析液中藥物濃度，以滲析液（Cd）和灌注液（Cp）中藥物濃度差（即滲析液中藥物濃度的凈增加值）對灌注液中的藥物濃度作圖，直線與橫軸交點處的濃度即為探針周圍濃度中藥物的濃度，直線的斜率為探針的回收率，方程擬合結果見表3。

2.3 線性微透析探針在體回收率方法的建立

2.3.1 微透析探針的植入[7] 取SD大鼠[5周齡，（200±10） g]，用0.2 g·mL-1烏拉坦按體重（1.5 g·kg-1， ip）麻醉后，固定于鼠板上，小心剃去腹部毛發；利用引導針穿刺將微透析探針（半透膜長度為10 mm）植入大鼠皮下后，將引導針小心抽回，微透析探針膜留于大鼠皮下組織中；在樣品收集前用空白灌流液排除探針內氣泡，并以1.5 μL·min-1灌注速率平衡1 h，以修復組織損傷，用紅外燈給大鼠取暖。

2.3.2 微透析探針在體回收率穩定性考察[4] 線性微透析探針植入后，用空白灌流液平衡1 h后，用含有一定濃度Pae，Eug，Pip混合溶液灌流探針，流速1.5 mg·L-1，每20 min收集1次微透析樣品（每次30 μL），收集480 min，利用HPLC測定透析液中藥物濃度，按反透析法測定探針的回收率，考察線性探針在體回收率480 min內的穩定性，結果見圖6。

由圖所知，Pae微透析探針在480 min內的在體回收率保持在（46.80±1.66）%，Eug為（45.06±1.66）%，Pip為（34.15±2.06）%，表明在480 min內3種成分微透析探針的在體回收率穩定。

2.3.3 微透析探針在體回收率重復性考察[5] 線性微透析探針植入后，交替用一定濃度Pae，Eug，Pip混合溶液和空白灌流液灌流探針，流速1.5 mg·L-1。樣品收集前平衡1 h，每20 min收集1次微透析樣品（每次30 μL），重復收集6次后用空白灌流液灌流1 h，交替3次。利用HPLC測定透析液中藥物的濃度，按反透析法計算探針的回收率，考察探針回收率在體日內重復性。Pae，Eug，Pip線性微透析探針的在體回收率分別為（45.79±1.89）%，（44.00±1.52）%，（35.83±2.38）%，日內重復性良好。

3 討論

活血止痛膏是安徽安科余良卿藥業有限公司自主研發的一種橡膠膏劑，年銷售額過億元，為國家醫保目錄品種、國家中藥保護品種，現收載于2015年版《中國藥典》第一部[1]。其處方主要由干姜、山柰、丁香、陳皮、牡丹皮、沒藥、乳香、胡椒、樟腦、冰片等20多味藥組成，雖已有文獻對其透皮性能進行報道，但對其有效成分的體內過程卻鮮有研究。

微透析技術[1011]是應用于經皮藥動學研究的重要方法。由于灌流液的不斷流動，所測得的藥物濃度為探針植入部位藥物實際濃度的一部分，所以探針回收率校正是微透析技術應用于經皮藥動學研究的前提。鑒于此，本研究以Pae，Eug，Pip為指標，建立活血止痛膏經皮微透析體內外回收率測定方法，考察微透析技術應用于活血止痛膏經皮藥動學研究的可行性，為其體內藥動學的研究、基質優選以及制備工藝優化提供理論依據。由結果可知，體內局部藥物濃度可以用體外或體內測得的回收率進行校正，微透析技術用于活血止痛膏的經皮藥動學研究是可行的。

微透析探針對脂溶性成分具有一定的吸附性，導致探針體內外回收率較低[4]。本課題組前期對灌流液進行了篩選，由于滲透壓和避免探針的吸附性不可兼得，為保證后續試驗的順利進行，本研究選擇探針吸附性最小的30%乙醇生理鹽水為灌流液。從吸附性試驗結果可以看出，以30%乙醇生理鹽水為灌流液，探針對Pae和Eug無明顯吸附，對Pip略有吸附，3種成分在探針上均不存在死吸附現象，短時間內均可被灌流液洗脫下來。

在微透析探針體外回收率研究中，透析膜兩側溶劑相同，滲透壓相同；而在體內試驗中，由于30%乙醇溶液滲透壓高于體液，使得灌流液中成分更多地進入組織細胞中，流出液濃度減小，導致本研究中所測的在體回收率與體外回收率有較大差別，胡椒堿的結果尤其如此。多數研究[1011]常用反透析法測得的微透析探針體內回收率來校正所測得的局部藥物濃度，本課題組后續將比較不同劑型的體內藥動學差異，用體外所測得的回收率或者反透析測得的回收率進行濃度校正對結果沒有較大影響，因此，兩者均可用于采集部位的濃度校正。

[參考文獻]

[1] 中國藥典. 一部[S]. 2015：1294.

[2] 于娟，杜茂波，劉淑芝，等. 活血止痛凝膠體外釋放和經皮滲透性研究[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（24）：4778.

[3] Whitaker G， Lunte C E. Investigation of microdialysis sampling calibration approaches for lipophilic analytes： doxorubicin[J]. J Pharm Biomed Anal， 2010， 53（3）：490.

[4] Sasongko L， Williams K M， Ramzan I， et al. Assessment of in vitro and in vivo recovery of gallamine using microdialysis[J]. J Pharmacol Toxicol Methods， 2000， 44（3）：519.

[5] MartíNez M S M，Hurtado B G，Gandarillas C I C，et al. In vitro study of experimental factors affecting the microdialysis results [J]. Anal Chim Acta， 2002， 459（1）：143.

[6] Song Y， Lunte C E.Comparison of calibration by delivery versus no net flux for quantitative in vivo microdialysis sampling[J]. Anal Chim Acta，1999，379（3）：251.

[7] Ward K W， Medina S J， Portelli S T，et al. Enhancement of in vitro and in vivo microdialysis recovery of SB265123 using Intralipid and Encapsin as perfusates[J].Biopharm Drug Dispos， 2003， 24（1）：17.

[8] Azeredo F J， Dalla Costa T， Derendorf H. Role of microdialysis in pharmacokinetics and pharmacodynamics： current status and future directions [J]. Clin Pharmacokinet， 2014， 53（3）： 205.

[9] Abrahamsson P， Aberg A M， Wins O， et al. Surface microdialysis sampling： a new approach described in a liver ischaemia model[J]. Clin Physical Funct Imaging， 2012， 32（2）：99.

[10] Song Y， Lunte C E.Calibration methods for microdialysis sampling in vivo： muscle and adipose tissue[J]. Anal Chim Acta， 1999， 400（1）：143.

[11] 俞安安，袁芳，楊智承，等. 拉莫三嗪微透析體內外回收率及其影響因素的研究[J]. 中國生化藥物雜志，2015，35（10）：122.

[責任編輯 曹陽陽]