苦參堿聯合胸腺五肽對卵巢癌腹腔熱化療大鼠免疫功能的影響

王興玲，于明新

苦參堿聯合胸腺五肽對卵巢癌腹腔熱化療大鼠免疫功能的影響

王興玲，于明新*

目的 探討苦參堿聯合胸腺五肽對經腹腔熱化療治療的卵巢癌大鼠免疫功能的影響。方法 將46只成功造模的卵巢癌大鼠隨機分為對照組和觀察組，每組23只，兩組大鼠均進行腹腔熱化療(順鉑)并同時給予胸腺五肽，觀察組大鼠在此基礎上給予苦參堿，共進行3周。比較兩組大鼠治療前后腹圍、體重、免疫功能、血清CA125水平變化情況。結果 治療后，兩組大鼠體重、腹圍增加(P<0.05)，觀察組大鼠體重、腹圍低于對照組(P<0.05)。治療后，兩組血清CD3、CD4、自然殺傷細胞(NK)、IgG、IgM、IgA濃度與CD4/CD8較治療前降低(P<0.05)，CD8較治療前升高(P<0.05)；觀察組患者血清CD3、CD4、CD4/CD8、IgG、IgM、IgA濃度明顯高于對照組(P<0.05)，CD8較對照組降低(P<0.05)。治療后，兩組大鼠IL-2、IL-4濃度降低(P<0.05)，且觀察組IL-2、IL-4濃度明顯高于對照組(P<0.05)；兩組IL-6、IL-12濃度較治療前升高(P<0.05)，且觀察組IL-6、IL-12濃度明顯低于對照組(P<0.05)；兩組大鼠CA125水平均較治療前降低(P<0.05)，且觀察組低于對照組(P<0.05)。結論 對行腹腔熱化療的卵巢癌大鼠給予苦參堿聯合胸腺五肽，有助于改善卵巢癌大鼠的免疫功能與一般狀態。

卵巢癌；苦參堿；胸腺五肽；腹腔熱化療；免疫功能；CA125

0 引言

卵巢癌早期臨床癥狀不明顯，一般到晚期才出現臨床癥狀，因此其早期診斷困難，而晚期卵巢癌死亡率高居婦科惡性腫瘤之首。臨床常采取綜合療法(手術結合放化療)治療卵巢癌，但是此方法控制腫瘤復發及轉移的效果仍然較差，因此需要探尋一種新的治療方案[1]。腹腔熱化療(Intraperitoneal hyperthermic chemotherapy，IPHC)作為近年來新出現的配合手術治療腹腔惡性腫瘤及其轉移瘤的綜合化療方案，目前在臨床實踐中廣泛使用[2-4]，卵巢癌腹腔內發生浸潤轉移率較高，針對其熱敏感這一特點，我們選擇了IPHC進行研究[5-6]。

苦參堿是由苦參中提取的一種具有抗腫瘤活性的物質，通過激活腫瘤凋亡基因的表達與提高自身抗腫瘤免疫活力來發揮抗腫瘤作用[7]。胸腺五肽是臨床中常用的腫瘤輔助化療藥物，能提高機體自身免疫力，在臨床上得到了廣泛應用[8]。我們通過建立大鼠卵巢癌實驗動物模型來研究IPHC的療效及輔助性的苦參堿與胸腺五肽的免疫調節作用，現總結如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物與卵巢癌細胞株的選擇 選用58只近交系健康雌性Fischer344大鼠(北京維通利華實驗動物科技有限公司)，周齡8～10周，體重120～150 g；NuTu19卵巢癌細胞株(上海紀寧生物科研有限公司)。選取造模成功的大鼠46只，按照隨機數字表法分為觀察組與對照組，每組23只。大鼠每4只一籠飼養，普通顆粒飼料喂養，自由飲水取食，人工控溫20～26 ℃，12 h光照，12 h黑暗，治療中共死亡5只(對照組2只，觀察組3只)，完成實驗的大鼠共41只(對照組21只，觀察組20只)。兩組大鼠的周齡、體重等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠治療前基本情況分析

1.1.2 主要試劑 苦參堿(粉末，純度>99%)由美國Sigma公司提供；胸腺五肽由深圳翰宇藥業股份有限公司提供(5 mg/支，白色粉末狀)；順鉑(20 mg/支，白色粉末狀)由齊魯制藥有限公司提供；酶聯免疫法檢測試劑盒(IL-2、IL-4、IL-6、IL-12)由美國Sigma公司提供；淋巴細胞分離液(Ficoll-hypque)由美國Sigma公司提供；IgGrl-FITC/IgGr2a-PE、CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE和FACS Lysing Solution溶血素為BD公司產品；IgG、IgM、IgA體液免疫指標檢測采用美國BD公司提供的雙色熒光試劑盒；RPMI-1640培養液由美國Gibco公司提供。

1.1.3 主要儀器 Model2300 CO2培養箱(美國Sheldon公司提供)；AxSYM型全自動免疫發光分度儀與FACSCalibur流式細胞儀(美國雅培公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養方案 將NuTu-19細胞接種于RPMI-1640培養液(含10%小牛血清)中，并置于37 ℃的CO2培養箱中。

1.2.2 建立Fischer344大鼠上皮性卵巢癌動物模型[6]用胰酶消化所培養出來的對數生長期NuTu-19細胞并調整細胞計數，將細胞(5×106/只)注射入大鼠腹腔中，然后SPF條件飼養，每周測1次體重與腹圍，觀察動物生長情況(體重增長與腹圍變化)，記錄一般狀態(毛發情況、行動速度、反應速度、飲食情況)，飼養3周后進行分組治療處理(采用隨機數字表法隨機分為觀察組與對照組)。

1.2.3 腹腔熱化療治療方案 根據NuTu-19細胞的生物學特征[9]及其體外細胞藥敏實驗證實對順鉑敏感性高[半抑制濃度(IC50)=0.83 μg/mL]，因此，可用生理鹽水將腹腔順鉑注射液濃度調整為0.83 μg/mL。兩組大鼠每日給予腹腔注射輔助性的免疫增強劑[胸腺五肽1 mg/(kg·d)]、20 mL順鉑(0.83 μg/mL)一次性腹腔灌注(每周三進行，每周1次)，灌注液利用電熱恒溫水浴箱一次性加熱，使藥液進入腹腔時溫度維持在43 ℃，連續進行以上給藥方案3周。觀察組在對照組的基礎上給予苦參堿注射液腹腔注射[3 mg/(kg·d)]。苦參堿、胸腺五肽均溶解于0.9%生理鹽水中(1 mg/mL)配成混懸液，現用現配。

1.2.4 免疫指標的測定 化療前后抽取靜脈血3 mL，注入玻璃試管中，靜置10 min，以3 000 r/min離心10 min，分離血清在-70 ℃超低溫冰箱內保存待測，采用流式細胞儀、細胞計數儀檢測外周血T細胞亞群(CD3、CD4、CD8)水平，用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離外周血有核細胞，外周血中有核細胞染色標記30 min，棄上清液，沖洗2次后上機檢測。免疫散射比濁法檢測免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)；酶聯免疫法測定血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12(檢測時按試劑盒說明進行)，所取標本均在1周內測定。

1.2.5 外周血清CA125的檢測 抽取尾緣靜脈血2 mL，將血清離心(1 000 r/min)20 min后抽取上清液置于試管中，利用電化學發光免疫分析法測定血清CA125水平(具體步驟依據試劑盒說明進行)。

2 結果

2.1 大鼠造模情況及一般狀態 58只大鼠成功造模46只，失敗12只，其中造模過程中死亡6只(50.00%)、造模后出現嚴重腹水導致惡病質4只(33.33%)、造模未達到實驗所需的卵巢癌模型2只(16.67%)。造模過程中大鼠均出現不同程度的腹圍增加、食欲減退、毛色暗淡、反應力降低，將造模成功的大鼠隨機分為觀察組與對照組，每組23只，治療中共死亡5只(對照組2只，觀察組3只)，治療過程中兩組死亡率比較差異無統計學意義(χ2=0.224，P=0.636)，41只大鼠完成試驗(對照組21只，觀察組20只)。

2.2 大鼠治療前后體重、腹圍變化情況比較 大鼠治療后處死，解剖腹部，肉眼觀察見兩組大鼠腹腔內均有大量腹水，大網膜增厚并粘連，腹膜、腸管等處均有直徑約1～3mm粟粒狀結節，兩組均未發現肝、肺轉移。觀察組大鼠腹水多于對照組，且發生腸粘連嚴重程度較對照組高。兩組大鼠治療后體重、腹圍均高于治療前(P<0.05)，但觀察組低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠治療前后體重、腹圍情況比較

注：*與對照組比較，P<0.05

2.3 兩組大鼠治療前后免疫指標比較 治療后，兩組大鼠血清CD3、CD4、自然殺傷細胞(NK)、IgG、IgM、IgA濃度與CD4/CD8降低(P<0.05)，CD8升高(P<0.05)；觀察組大鼠血清CD3、CD4、CD4/CD8、IgG、IgM、IgA濃度明顯高于對照組(P<0.05)，CD8低于對照組(P<0.05)。治療后兩組大鼠IL-2、IL-4濃度降低(P<0.05)，且觀察組高于對照組(P<0.05)；治療后兩組大鼠IL-6、IL-12濃度較治療前升高(P<0.05)，且觀察組低于對照組(P<0.05)，結果見表3～表5。

2.4 兩組大鼠治療前后血清CA125水平比較 治療后兩組大鼠CA125水平降低(P<0.05)，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表6。

3 討論

約90%的卵巢惡性腫瘤來源于上皮細胞，早期臨床癥狀不明顯，發現時已進入晚期，因此腹腔轉移率高，5年生存率(約30%)較低。腫瘤的分化程度、病理類型是影響其惡性程度的重要原因[10]。近年來IPHC受到了國內外學者的廣泛關注，Ⅱ期以上卵巢癌行減瘤術后常用該方法。盆腔種植轉移與播散是卵巢癌的主要轉移途徑，因早期不易被發現，故就診時已經發生腹腔內廣泛轉移，給手術帶來了較大困難，且對患者創傷較大。IPHC在治療術后復發患者中有著較好的臨床療效[11]。順鉑臨床效果較好，但其不良反應(骨髓抑制、胃腸反應為主)較多，臨床使用受到限制[12]。苦參堿是從苦參的干燥根中提取的一類具有抗腫瘤作用的生物活性物質，研究顯示，苦參堿具有多種抗腫瘤活性，主要通過誘導腫瘤細胞分化凋亡來達到抗腫瘤目的。此外，還能通過抑制腫瘤新生血管的形成來抑制腫瘤的浸潤與遠處轉移，有一定的止痛效果，在降低其他化療藥物不良反應的同時，能增強機體自身免疫功能，臨床上常常用于腫瘤的預防性化療[13]。胸腺五肽是人工合成的免疫調節劑，是胸腺生成素Ⅱ第32～36位的氨基酸片段，具有胸腺生成素活性，通過誘導T淋巴細胞分化來促進并激活淋巴細胞的活性，調節T淋巴細胞亞群的分化比例，達到正常比例[14]。

表3 兩組大鼠治療前后細胞免疫功能比較

注：*與對照組比較，P<0.05

表4 兩組大鼠治療前后體液免疫功能比較(g/L)

注：*與對照組比較，P<0.05

表5 兩組大鼠治療前后免疫相關細胞因子水平比較

注：*與對照組比較，P<0.05

表6 兩組大鼠治療前后外周血CA125水平比較

注：*與對照組比較，P<0.05

機體的T淋巴細胞(包括CD3、CD4、CD8亞群等)主要負責機體的特異性免疫應答，而惡性腫瘤患者由于腫瘤細胞浸潤與化療手術的創傷造成其免疫功能低下，外周血清表現為淋巴細胞與白細胞濃度降低。臨床研究證實，惡性腫瘤患者外周血清T淋巴細胞亞群(CD3、CD4、CD8)濃度降低[15]。B淋巴細胞通過分泌抗體(IgG、IgM、IgA)來發揮機體非特異免疫應答，其免疫應答強弱主要體現為濃度的高低[16]。本研究表明，化療后，兩組大鼠的細胞免疫與體液免疫均降低，對觀察組大鼠給予苦參堿，能很好地提高大鼠的免疫(細胞、體液免疫)功能，且T淋巴細胞各個亞群對應的細胞因子也發生相應的升高與降低，進一步證實化療對大鼠機體細胞免疫與體液免疫功能均有一定損傷，從而導致相關細胞因子降低，而苦參堿能明顯改善其免疫功能降低。CA125在臨床中廣泛用于卵巢癌治療后的臨床療效評價[17]。本研究結果表明，治療后，兩組大鼠CA125水平均降低，且觀察組低于對照組。而觀察組大鼠腹水少于對照組，且發生腸粘連嚴重程度低于對照組，與尹艷英[5]所得結果相同。此外，治療后兩組大鼠體重、腹圍均增加，且觀察組高于對照組，說明卵巢癌大鼠腹水增加，而免疫調節劑能延緩腹水增加，化療藥物能抑制瘤體增生，進一步證實苦參堿與胸腺五肽具有良好的調節免疫與改善卵巢癌大鼠一般狀態的功能，是很好的化療輔助性用藥。

本研究通過建立大鼠卵巢癌動物模型來證實卵巢癌腹腔熱化療的重要性，并采用苦參堿與胸腺五肽兩種免疫調節劑輔助腹腔熱化療，證實了其有較好的免疫調節能力，能夠彌補化療藥物對自身免疫功能的損傷，同時還有一定的抑制腫瘤生長的作用。此外，機體營養狀態也直接影響了抗腫瘤免疫力，今后我們將進一步研究免疫調節劑與營養狀態的關系，以更好地指導臨床實踐。

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Effects of matrine combined with thymopeptide-5 on immune function of rats with ovarian carcinoma treated by intraperitoneal hyperthermic chemotherapy

WANG Xing-ling,YU Ming-xin*

(Cancer Hospital of China Medical University,Liaoning Cancer Hospital & Institute,Shenyang 110042,China)

Objective To study the effects of matrine combined with thymopeptide-5 on immune function of rats with ovarian carcinoma treated by intraperitoneal hyperthermic chemotherapy.Methods Totally 46 rats which were successfully modelled asovarian carcinoma were randomly divided into two groups:observation group (n=23) and control group (n=23).All the rats were given intraperitoneal hyperthermic chemotherapy (cis-platinum) and thymopeptide-5,and the rats in observation group were added with matrine,the course of treatment lasted for 3 weeks.The waist circumference,weight,index of immune function,and the level of CA125 in the two groups were compared before and after treatment.Results After treatment, the waist circumference and weight of rats increased (P<0.05), and those in observation group were lower (P<0.05).After treatment, the levels of CD3, CD4, NK, IgG, IgM, IgA, IL-2, IL-4, CD4/CD8 and CA125 decreased significantly (P<0.05), while the levels of CD8, IL-12, and IL-6 increased (P<0.05), and there were significant differences in the above indexes between the two groups (P<0.05).Conclusion Matrine combined with thymopeptide-5 can improve the general state and the immune function in rats with ovarian carcinoma treated by intraperitoneal hyperthermic chemotherapy.

Ovarian carcinoma;Matrine;Thymopeptide-5;Intraperitoneal hyperthermic chemotherapy;Immune function;CA125

2016-06-12

中國醫科大學腫瘤醫院遼寧省腫瘤醫院，沈陽 110042

遼寧省自然科學基金項目(2013225021)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701002

*通信作者