麒麟菜提取物對HepG2、H22肝癌細胞的抗癌作用及機制研究

全香花，趙園園，崔萌納，隋忠國

麒麟菜提取物對HepG2、H22肝癌細胞的抗癌作用及機制研究

全香花，趙園園，崔萌納，隋忠國*

目的 從麒麟菜中提取天然海藻色素糖蛋白(NSPG)，并觀察其抗腫瘤作用。方法 應用溶劑浸提法從麒麟菜中提取NSPG，應用IR、UV、液相-質譜法、凝膠色譜法測定NSPG樣品的分子量及結構特征等。采用MTT比色法測定NSPG作用后HepG2人肝癌細胞、小鼠H22肝癌細胞的體外活性。結果 本研究建立了常溫下從麒麟菜中提取NSPG的方法，并測定其理化性質。人HepG2肝癌細胞體外實驗結果顯示，50、100 mg/L NSPG組培養48 h的細胞增殖活性分別為0.62±0.02、0.54±0.01，低于空白對照組(0.87±0.01)，差異有統計學意義(P<0.05)；小鼠H22肝癌細胞體外實驗結果顯示，NSPG對腫瘤細胞的增殖活性隨NSPG濃度的升高而逐漸降低，抑制率逐漸升高，低、中劑量組的增殖活性、抑制率與高劑量組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論 NSPG對HepG2人肝癌細胞、小鼠H22肝癌細胞表現出不同程度的腫瘤抑制作用。

天然海藻色素糖蛋白；肝癌細胞；體外抗腫瘤活性

0 引言

天然海藻色素糖蛋白(Natural seaweed pigment glycoprotein，NSPG)是從麒麟菜中提取的一種海藻多糖與藻膽蛋白的天然結合物。藻膽蛋白是紅藻和藍藻等藻類特有的捕光色素蛋白[1]，具有抗腫瘤、抗氧化等生物學功效[2-3]，但由于其含量低、性質不穩定、提取工藝復雜等問題，使其開發、利用受到限制。藻膽蛋白和海藻中的硫酸多糖均具有抗腫瘤作用[4-6]，因此，本研究從麒麟菜中提取了海藻多糖與藻膽蛋白呈天然結合狀態的海藻色素糖蛋白，并利用IR、UV、液相-質譜法、凝膠色譜法確定NSPG樣品的分子量及結構特征等。本研究采用體外細胞培養的方法，評價了麒麟菜NSPG對HepG2人肝癌細胞、小鼠H22肝癌細胞的腫瘤抑制作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要材料 麒麟菜干品：青島海隆達生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 濃硫酸(分析純)，乙醇(分析純)。紫外分光光度計(TU-1901型)：德國BRUKER公司；紅外光譜儀(TENSOR型)：德國BRUKER公司；離心機(TDL-5型)：上海安亭科學儀器廠產品；液相色譜-質譜儀(BrukermaXis UHR-TOF LC型)：德國BRUKER公司；凝膠色譜儀(DAWN HELEOS-Ⅱ與OptilabrEX型，配Waters515HPLC Pump)：美國Wyatt公司；CO2培養箱(BNP-310)：日本TABAI ESPEC 公司；酶標儀：瑞典RosysAnthos公司。RPMI-1640培養基、四甲基偶氮噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清：購自美國Gibco公司；環磷酰胺：購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1.1.3 細胞株 人HepG2肝癌細胞株：上海細胞庫；小鼠H22肝癌細胞：山東省實驗動物中心。

1.2 NSPG的制備與分析

1.2.1 NSPG制備 室溫下將洗凈的麒麟菜切為0.5～1.0 cm的長條，置于pH 3.0的鹽酸溶液中浸提，將上述酸性浸提液進行減壓抽濾，收集濾液調節pH值為4.5，再加入3倍體積的95%乙醇，攪拌，放置過夜，析出沉淀，真空抽濾得到濾紙上的沉淀部分，將沉淀分別用無水乙醇、丙酮洗滌，室溫干燥，得NSPG(圖1)。

圖1 NSPG的制備過程

1.2.2 NSPG組成與結構分析 以葡萄糖為標準物質，用硫酸-苯酚法測定NSPG中多糖的含量。以牛血清白蛋白為標準物質，用考馬斯亮藍法測定NSPG中蛋白質的含量。用紫外、紅外光譜法測定多糖和蛋白質的特征吸收峰。根據β-消除反應和液-質譜法確定糖苷鍵的類型，用凝膠色譜分析法測定NSPG的分子量。

1.3 NSPG體外抗腫瘤活性的測定 采用MTT比色法測定海藻色素糖蛋白對HepG2人肝癌細胞、小鼠H22肝癌細胞的抑制率。在無菌條件下，取HepG2人肝癌細胞和小鼠H22肝癌細胞懸液，配成瘤細胞密度為5×105/mL的細胞懸液，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基配制。高、中、低劑量組加入的NSPG濃度分別為100、50、10 mg/L，對照組加入等量雙蒸水，每組設3個平行樣，每孔加入100 μL。在37 ℃、5%CO2培養箱中HepG2人肝癌細胞培養12、24、48 h，小鼠H22肝癌細胞組培養24 h。

用酶標儀測定在490 nm處的吸光度值A，以此表示各組的細胞增殖活性，并按下列公式計算各組細胞的增殖抑制率(Inhibition rate，IR)。IR(%)=(腫瘤細胞對照組A值-實驗組A值)÷細胞對照組A值×100%。采用SPSS 17.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 NSPG的制備與結構分析 利用等電點沉淀法建立從麒麟菜中提取NSPG的方法，制備足量的實驗樣品。

NSPG外觀為棕紅色粉末，溶于水，不溶于乙醇乙醚等有機溶劑，其提取得率為8.3%。經凝膠色譜分析，NSPG相對分子量為213.8 kDa。NSPG紫外光譜分析(圖2)其特征吸收峰，得吸收值為1.834，在280 nm處蛋白質的吸收值為0.417，但吸收峰不明顯，說明蛋白質的含量較低。用考馬斯亮藍染色法測定麒麟菜NSPG中蛋白質的含量為2.04%，采用苯酚-硫酸法測定麒麟菜NSPG中多糖含量為93.3%。

NSPG紅外光譜(圖3)顯示，1 651 cm-1處有酰胺鍵的特征吸收。根據1 034 cm-1附近有吸收峰，確定NSPG的糖苷類型為吡喃型。

NSPG經β-消除反應前后紫外吸收有變化，提示NSPG中存在O-連接糖苷鍵。液-質譜圖中(圖4)相鄰峰m/e有規律遞減，各峰之間相差均為115，說明其為天冬氨酸。證明NSPG中N-糖基化出現于“AsnX-Thr/Ser”三肽順序中的Asn(天冬氨酸)殘基的氨基氮上，所以NSPG同時存在N-連接糖苷鍵。

圖2 NSPG紫外光譜圖

圖3 NSPG紅外光譜

2.2 NSPG體外抗腫瘤活性研究

2.2.1 人HepG2肝癌細胞體外實驗結果 培養48 h后，50 mg/L NSPG組和100 mg/L NSPG組的細胞增殖活性分別為0.62±0.02、0.54±0.01，較空白對照組(0.87±0.01)降低，各組間差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

圖4 NSPG液相-質譜圖

組別只數12h增殖活性(A)抑制率(%)24h增殖活性(A)抑制率(%)48h增殖活性(A)抑制率(%)對照組100.40±0.01—0.55±0.01—0.87±0.01—10mg/L組100.37±0.016.980.51±0.01#7.410.80±0.01*#7.4950mg/L組100.36±0.04*10.970.44±0.01*11.100.62±0.02*#28.11100mg/L組100.34±0.01*14.460.43±0.01*21.880.54±0.01*37.56

注：*與對照組比較，P<0.05；#與100 mg/L組比較，P<0.05

2.2.2 小鼠H22肝癌細胞體外實驗結果 由表2可見，高劑量(100 mg/L)NSPG組細胞增殖抑制率為25.87%。不同劑量NSPG對腫瘤細胞的增殖活性隨濃度的增加而降低，抑制率依次增高，低、中劑量(10、50 mg/L)組的增殖活性和抑制率與高劑量組比較差異有統計學意義(P<0.05)，顯示NSPG對腫瘤細胞的增殖活性具有抑制作用，且呈劑量-效應趨勢。

表2 不同劑量NSPG對腫瘤細胞增殖活性的影響

注：*與對照組比較，P<0.05；#與高劑量組比較，P<0.05

3 討論

本研究首次建立了常溫下從麒麟菜中提取NSPG的方法，經過對提取樣品分析測定，確定NSPG的相對分子量為213.8 kDa，多糖含量為93.3%，蛋白質含量為2.04%。多糖和蛋白質的連接方式為O-連接糖苷鍵，同時存在N-連接的糖苷鍵，樣品提取得率為8.3%。該方法與傳統的單純提取藻膽蛋白相比，具有提取工藝簡便、成本低、產品穩定性高、提取得率高等特點，適于大規模生產。

在對NSPG進行HepG2人肝癌細胞增殖活性影響的體外實驗結果顯示，50 mg/L和100 mg/L劑量組在12 h、24 h、48 h 時與對照組比較均有顯著差異，并且隨NSPG濃度增加和作用時間延長，對腫瘤細胞增殖活性的抑制作用呈增強趨勢。與王源等[7]報道藻膽蛋白濃度>30 mg/L時，對SMMC-7721細胞存在抑制作用，且隨蛋白濃度增加和作用時間延長呈增強趨勢結果一致。小鼠H22肝癌細胞體外實驗結果顯示，高劑量NSPG組細胞增殖抑制率為25.87%，不同劑量組NSPG對腫瘤細胞增殖活性隨濃度的增加依次降低，而抑制率依次增高，且低、中劑量組的增殖活性和抑制率與高劑量組有顯著差異，表明NSPG對小鼠H22肝癌細胞的增殖活性具有抑制作用，且呈劑量-效應的趨勢。

本研究顯示，100 mg/L NSPG對人HepG2肝癌細胞和小鼠H22肝癌細胞的抑制率分別為37.56%和25.87%，高劑量組人HepG2肝癌細胞和小鼠H22肝癌細胞的細胞增殖活性較中、低劑量組顯著降低。與王勇等[8]研究結果(藻蛋白對體外培養HeLa細胞的生長有抑制作用，隨著藻膽蛋白的劑量從10 mg/L增高至80 mg/L，抑制率逐步提高)一致。

通過對NSPG進行體外抗腫瘤活性測試，證實NSPG對人HepG2肝癌細胞和小鼠H22肝癌細胞具有較好的細胞抑制作用，表明NSPG同樣具有藻膽蛋白抑制腫瘤的生物活性特征。同時，NSPG具有提取工藝簡單、得率高、穩定性好等特點，適于大規模生產，為藻膽蛋白的開發應用和抗腫瘤藥物的篩選提供了一個重要的研究方向，目前進一步的研究仍在進行中。

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Inhibitory effect of eucheuma abstracts on hepatoma HepG2 and H22 cells and its mechanisms

QUAN Xiang-hua,ZHAO Yuan-yuan,CUI Meng-na,SUI Zhong-guo*

(Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China)

Objective To extract the natural seaweed pigment glycoprotein (NSPG) fromEucheuma,and evaluate the anti-tumor activity.Methods NSPG was extracted fromEucheumaby using isoelectric precipitation method,and the molecular weight and structural characteristics were determined by IR,UV,liquid chromatography mass spectrometric method and gel permeation chromatography.The cytotoxicityinvitroof HepG2 cells and H22 cells was assayed by MTT assay.Results The extraction method of NSPG fromEucheumaat room temperature was established and the physiochemical properties were elucidated.The proliferation activation of HepG2 in 50 mg/L NSPG group (0.62±0.02) and 100 mg/L NSPG group (0.54±0.01) were lower than that of control group (0.87±0.01) after being cultured for 48 hinvitro(P<0.05).The proliferation activity of H22 cellsinvitrodecreased gradually with the increase of dosage of NSPG (P<0.05).Conclusion NSPG exhibits different inhibitory activities on HepG2 cells and H22 hepatoma cellsinvitro.

Natural seaweed pigment glycoprotein(NSPG);Hepatoma cells;Anti-tumor activityinvitro

2016-06-06

青島大學附屬醫院，青島 266003

青島市科技發展資金項目(2014-14-046-SW)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701006

*通信作者