左乙拉西坦對熱性驚厥大鼠治療作用的研究

李學(xué)超，王 淼，王建忠，盧凌凌

左乙拉西坦對熱性驚厥大鼠治療作用的研究

李學(xué)超1，王 淼1，王建忠1，盧凌凌2

目的 觀察左乙拉西坦對熱性驚厥大鼠的治療作用。方法 通過熱水浴建立熱性驚厥大鼠模型，將40只SD幼齡熱性驚厥大鼠隨機分為模型組及左乙拉西坦低、中、高劑量組[100、200、300 mg/(kg·d)]，分別于造模前灌胃，造模后進行47 ℃熱水浴試驗，每天驚厥1次，共驚厥5 d。觀察每組大鼠驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間、驚厥級別。采用TUNLE法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況。試劑盒法檢測海馬組織中含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶(Caspase 3)活性及谷氨酸(Glu)含量，Western blot檢測γ-氨基丁酸(GABA蛋白)表達量。結(jié)果 與模型組比較，左乙拉西坦低、中、高劑量組中大鼠驚厥潛伏期延長，驚厥持續(xù)時間縮短，驚厥嚴(yán)重程度降低，海馬神經(jīng)元凋亡率降低，Caspase 3活性及Glu含量降低，GABA表達量提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 左乙拉西坦對熱性驚厥大鼠具有顯著治療作用，可能與抑制神經(jīng)元凋亡及調(diào)節(jié)Glu與GABA表達量有關(guān)。

左乙拉西坦；熱性驚厥；海馬神經(jīng)元；谷氨酸；γ-氨基丁酸

0 引言

熱性驚厥是小兒時期最常見的驚厥性疾病，在小兒驚厥中占50%左右，在6歲以下兒童的發(fā)病率將近5%。熱性驚厥易于復(fù)發(fā)，并因為復(fù)發(fā)次數(shù)較多，可造成不同程度的腦損傷，引起腦組織病理學(xué)變化，從而導(dǎo)致幼兒智力發(fā)育障礙，甚至癲癇的發(fā)生[1-2]。研究表明,神經(jīng)元損傷、興奮性氨基酸遞質(zhì)與抑制性氨基酸遞質(zhì)失衡是熱性驚厥產(chǎn)生的原因之一[3-4]。左乙拉西坦是新型抗癲癇藥物，臨床及動物實驗均已證實其對小兒熱性驚厥即幼齡大鼠具有治療作用，但具體機制未知[5-6]。因此，研究左乙拉西坦與熱性驚厥導(dǎo)致的海馬神經(jīng)元損傷及氨基酸遞質(zhì)失衡的關(guān)系，對于進一步全面了解左乙拉西坦治療小兒熱性驚厥的具體機制具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 動物 28 d幼齡SD雄性大鼠40只，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證號：SCXK(滬)2012-0002，室內(nèi)溫度控制在(23±2)℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.2 藥物及試劑 BCA法蛋白定量試劑盒，ECL超敏發(fā)光液，小鼠抗GAPDH單克隆抗體，Caspase 3活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗GABA多克隆抗體(美國Abcam公司)；TUNEL試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器 LDZ5-2型臺式低速離心機(北京醫(yī)用離心廠)；電泳儀，轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；AF6000熒光顯微鏡(德國徠卡公司)；-80 ℃冰箱(美國Thermo公司)。

1.4 熱性驚厥大鼠模型建立、分組及觀察指標(biāo)[6-7]參考相關(guān)文獻，進行熱水浴試驗，溫度為47 ℃，在5 min內(nèi)大鼠發(fā)生驚厥即選為試驗大鼠。將選出的40只合適的大鼠隨機分為模型組及左乙拉西坦低、中、高劑量組[100、200、300 mg/(kg·d)]，分別于熱性驚厥試驗前灌胃，然后進行47 ℃熱水浴試驗，每天驚厥1次，共驚厥5 d。觀察每組大鼠驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間、驚厥級別。驚厥潛伏期指大鼠放入熱水中即刻至發(fā)生驚厥的時間，記錄單位為秒(s)。驚厥持續(xù)時間指大鼠由剛開始發(fā)生驚厥至驚厥停止的時間，記錄單位為秒(s)。驚厥級別能夠反映驚厥發(fā)生的嚴(yán)重程度，具體標(biāo)準(zhǔn)為：0級，沒有發(fā)生驚厥；Ⅰ級，點頭，眨眼等面部抽動行為；Ⅱ級，有節(jié)律性的點頭；Ⅲ級，前肢陣攣，抽搐；Ⅳ級，全身強直；Ⅴ級，全身強直，跌倒。

1.5 標(biāo)本采集 大鼠用10%水合氯醛注射麻醉后，斷頭取腦，于冰浴上鈍性分離大鼠雙側(cè)海馬腦組織，在液氮罐中保持。

1.6 Caspase 3活性及Glu含量測定 海馬組織勻漿后，取上清液，分別根據(jù)試劑盒說明書進行測定。

1.7 TUNEL法檢測海馬神經(jīng)元凋亡 取海馬組織標(biāo)本，按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。每個標(biāo)本海馬組織切片，在200倍顯微鏡目鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)，其中陽性細胞呈棕色或棕褐色，分別計數(shù)細胞總數(shù)及陽性細胞數(shù)，取其平均值，細胞凋亡指數(shù)(Apoptotic index，AI)=每個視野TUNEL染色后陽性的細胞數(shù)/每個視野細胞總數(shù)×100%。

1.8 Western blot檢測GABA蛋白表達 取海馬組織標(biāo)本，按比例加入RIPA(10 μg/mL)裂解液和蛋白酶抑制劑裂解，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s，40 min后離心，吸取上清液，獲得總蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品熱變性后上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，接著濕法轉(zhuǎn)膜30～50 min。5%脫脂奶粉進行封閉1 h，一抗溶液(GABA，稀釋濃度為1∶100)孵育，4 ℃冰箱過夜；二抗室溫搖床中孵育1 h后，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。最后用“Quantity one”軟件統(tǒng)計各抗體條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間比較 與模型組比較，左乙拉西坦低、中、高劑量組驚厥潛伏期顯著延長，驚厥持續(xù)時間顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間比較(s)

注：與模型組比較，**P<0.01

2.2 各組大鼠驚厥程度比較 與模型組比較，左乙拉西坦低、中、高劑量組中大鼠驚厥程度顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠5 d驚厥程度比較(只)

注：與模型組比較，**P<0.01

2.3 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡程度比較 與模型組比較，左乙拉西坦低、中、高劑量組中神經(jīng)元凋亡率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

2.4 各組大鼠海馬組織中Caspase 3活性及Glu含量的比較 與模型組比較，左乙拉西坦低、中、高劑量組中Caspase 3活性及Glu含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.5 各組大鼠海馬組織中GABA蛋白表達的比較 與模型組比較，左乙拉西坦低、中、高劑量組中GABA表達量均顯著提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡程度的比較

圖2 各組大鼠海馬組織中Caspase 3活性及Glu含量比較

圖3 各組大鼠海馬組織中GABA蛋白表達比較

3 討論

左乙拉西坦是一種新型的抗癲癇藥物，能夠解除鋅離子和β-咔啉對GABA和谷氨酸門控通道的抑制作用，從而起到抗驚厥及癲癇作用[8-9]。大量臨床實驗結(jié)果表明，左乙拉西坦對小兒熱性驚厥具有顯著療效[5]。動物實驗也證實，左乙拉西坦對熱性驚厥大鼠具有顯著的治療作用[6]。我們的研究通過熱水浴建立大鼠熱性驚厥模型，觀察大鼠驚厥潛伏期、驚厥持續(xù)時間、驚厥嚴(yán)重程度，結(jié)果表明，與模型組比較，左乙拉西坦低、中、高劑量組大鼠驚厥潛伏期延長，驚厥持續(xù)時間縮短，驚厥嚴(yán)重程度降低，與程敏等[6]的研究結(jié)果一致，充分說明了左乙拉西坦對熱性驚厥大鼠具有顯著的治療作用。

熱性驚厥使得大腦處于缺氧缺血狀態(tài)，使細胞ATP能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致維持細胞內(nèi)外離子平衡的通道失衡受損，特別是ATP依賴性的Ca2+通道受損嚴(yán)重，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，引起細胞內(nèi)Ca2+超載，從而引起自由基及興奮性氨基酸大量釋放，最終導(dǎo)致神經(jīng)元壞死凋亡[10-12]。Caspase是細胞凋亡的執(zhí)行者，其中Caspase 3處在Caspase級聯(lián)反應(yīng)的中下游，是細胞凋亡過程中主要效應(yīng)因子和凋亡途徑的匯聚點[13]。研究證實，熱性驚厥引起大鼠神經(jīng)元凋亡及Caspase 3活性升高，扭轉(zhuǎn)此變化能在一定程度上減輕熱性驚厥引起的大鼠腦損傷[4,14-15]。因此，我們通過TUNLE法檢測了各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況，結(jié)果表明，左乙拉西坦低、中、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率顯著低于模型組，左乙拉西坦各劑量組中Caspase 3活性顯著降低，說明左乙拉西坦能通過抑制海馬神經(jīng)元凋亡，進而減輕熱性驚厥大鼠腦損傷，從而達到其治療效果。

研究表明，興奮性氨基酸遞質(zhì)與抑制性氨基酸遞質(zhì)失衡是熱性驚厥發(fā)病的機制之一[3,15-16]。在熱性驚厥發(fā)生過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抑制性氨基酸遞質(zhì)水平顯著降低，而興奮性氨基酸遞質(zhì)水平顯著提高。其中Glu是最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，能使中樞神經(jīng)系統(tǒng)起到興奮作用，動物實驗研究表明，熱性驚厥大鼠海馬及皮層組織中Glu水平顯著提高，并對海馬神經(jīng)組織具有病理損傷作用[16]。GABA是主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起保護作用，具有鎮(zhèn)靜及抗焦慮作用，其主要來源于Glu，是通過GABA轉(zhuǎn)運體及轉(zhuǎn)氨酶的作用而相互轉(zhuǎn)化。在各種驚厥類型中，發(fā)現(xiàn)GABA水平顯著下調(diào)，并與驚厥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[3,17]。因此，通過調(diào)節(jié)GABA與Glu的平衡，能在一定程度上減輕熱性驚厥所導(dǎo)致的腦損傷。我們通過檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元組織中GABA及Glu的表達，結(jié)果表明，與模型組比較，左乙拉西坦組中GABA表達量顯著上升，Glu表達量顯著降低，說明左乙拉西坦能通過提高抑制性氨基酸遞質(zhì)GABA水平，降低興奮性氨基酸遞質(zhì)Glu水平，減輕熱性驚厥大鼠腦興奮作用對海馬神經(jīng)的毒性作用，從而減輕腦損傷。

綜上所述，左乙拉西坦通過延長熱性驚厥大鼠驚厥潛伏期，縮短驚厥持續(xù)時間，減輕驚厥嚴(yán)重程度，抑制海馬神經(jīng)元凋亡，并調(diào)節(jié)GABA與Glu水平，從而達到治療熱性驚厥的目的。

[1] 袁萍，蔣莉.再談熱性驚厥預(yù)后與防治研究進展[J].中國實用兒科雜志，2014，29(2)：101-103.

[2] Khair AM,Elmagrabi D.Febrile seizures and febrile seizure syndromes:an updated overview of old and current knowledge[J].Neurol Res Int,2015,2015:849341.

[3] Witsch J,Golkowski D,Hahn TT,et al.Cortical alterations in a model for absence epilepsy and febrile seizures:in vivo findings in mice carrying a human GABA(A)R gamma 2 subunit mutation [J].Neurobiol Dis,2015,77:62-70.

[4] 邵巧燕，戴錦泉，吳斌，等.長托寧對熱性驚厥幼鼠海馬神經(jīng)元的保護作用[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，48(4)：232-236.

[5] 張前明，黃志，李勁松.左乙拉西坦預(yù)防復(fù)雜性熱性驚厥的療效及不良反應(yīng)的臨床研究[J].中國藥物與臨床，2015，15(8)：1126-1128.

[6] 程敏，黃志，李思秀.左乙拉西坦預(yù)防動物熱性驚厥的實驗研究[J].兒科藥學(xué)雜志，2009，15(4)：16-18.

[7] 許先科，邵征洋，葉育雙，等.防驚湯對熱性驚厥大鼠驚厥復(fù)發(fā)的影響[J].中醫(yī)雜志，2015，56(4)：332-334.

[8] 晏玉奎，王莊.左乙拉西坦基礎(chǔ)研究進展[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30(5)：565-570.

[9] Molokwu OA,Ezeala-Adikaibe BA,Onwuekwe IO.Levetiracetam-induced rage and suicidality:two case reports and review of literature [J].Epilepsy Behav Case Rep,2015,4:79-81.

[10]江鵬,羅惠玲,黃惠儀,等.驚厥患兒腦脊液激活素 A 水平變化及臨床意義[J].中國小兒急救醫(yī)學(xué),2015,22(7):505-507.

[11]Syndi SD,Pellock JM.Recent research on febrile seizures:a review [J].J Neurophysiol,2013,4(165).

[12]盧嘉銘,劉光明,聶述山,等.975例兒科急診驚厥病因分析[J].中國小兒急救醫(yī)學(xué),2016,23(3):178-185.

[13]Chen H,Yang X,Feng Z,et al.Prognostic value of Caspase-3 expression in cancers of digestive tract:a meta-analysis and systematic review[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(7):10225-10234.

[14]吳星，王艷.熱性驚厥患兒血清及腦脊液腎上腺髓質(zhì)素及神經(jīng)元特異性烯醇化酶水平與腦損傷的關(guān)系[J].中華實用診斷與治療雜志，2015，29(5)：476-477.

[15]Chen J,Qin J,Liu X,et al.Nitric oxide-mediated neuronal apoptosis in rats with recurrent febrile seizures through endoplasmic reticulum stress pathway [J].Neurosci Lett,2008,443(3):134-139.

[16]張煉，羅小平.熱性驚厥對大鼠海馬齒狀回谷氨酸受體功能的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011,40(2):156-159.

[17]Koyama R,Tao K,Sasaki T,et al.GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy[J].Nat Med,2012,18(8):1271-1278.

Treatment effect of levetiracetam on febrile convulsion in rats

LI Xue-chao1,WANG Miao1,WANG Jian-zhong1,LU Ling-ling2

(1.Maternity and Child Hospital of Qinhuangdao,Qinhuangdao 066100,China;2.Center for Disease Control and Prevention of Qinhuangdao,Qinhuangdao 066100,China)

Objective To explore the therapeutic effect of levetiracetam on febrile convulsion in rats.Methods The model of febrile convulsion in rats was established by hot water bath.Forty SD young febrile convulsion rats were randomly divided into model group and low,medium and high dose levetiracetam group [100,200 and 300 mg/(kg·d)].Before modeling,the rats were given intragastric administration,then received hot water bath experiment once daily,for a total of five days.The rats′ latency,seizure duration and seizure level were observed.The apoptosis of hippocampal neurons was examined by TUNEL method.The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (Caspase 3) and level of glutamate (Glu) was examined.The expression of gamma aminobutyric acid (GABA) was examined by Western blot.Results Compared with model group,the convulsant latency in levetiracetam groups was prolonged (P<0.01),the duration of convulsion was shortened (P<0.01);the severity of convulsion was alleviated (P<0.01);the rate of apoptosis of hippocampal neurons,the activity of Caspase 3 and the level of Glu were decreased (P<0.01),the expression of GABA was increased (P<0.01).Conclusion Levetiracetam has significant therapeutic effect on febrile convulsion in rats,which is related to inhibiting of neuronal apoptosis and regulating the expression of Glu and GABA.

Levetiracetam;Febrile convulsion;Hippocampal neurons;Glutamate;Gamma aminobutyric acid

2016-06-12

1.秦皇島市婦幼保健院,河北 秦皇島 066100；

2.秦皇島市疾控中心，河北 秦皇島 066100

10.14053/j.cnki.ppcr.201701007