迷迭香中抗氧化活性物質(zhì)的提取及其抑菌功效

鄭萍+余芳+蔣彩云+李婷

摘要：采用超聲提取法對迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，并研究了該提取液的抑菌效果。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了提取的最佳工藝條件：提取溶劑為50%乙醇，料液比1 g ∶[KG-3]22 mL，時(shí)間1.0 h，溫度40 ℃。此外，抑菌試驗(yàn)表明迷迭香提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌皆有良好的抑菌效果，其抑菌圈的平均大小分別為196、20.9 mm，最低抑菌濃度分別為0.782、0.391 mg/mL。

關(guān)鍵詞：迷迭香；抗氧化；抑菌圈；最低抑菌濃度

中圖分類號： R151.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0370-03

迷迭香是一種新型資源植物，所需生長條件特殊，在我國較少見，屬于稀有植物。因其全身都是寶的特點(diǎn)，被研究和應(yīng)用的也較為廣泛，迷迭香不僅具有抗氧化成分，還具有抑菌功效[1-3]。迷迭香已作為解熱、鎮(zhèn)痛、消炎的藥物投放市場，同時(shí)也可以作為開發(fā)抗血栓的新藥。迷迭香活性物已被廣泛提取，但提取方法仍須進(jìn)一步完善，以提高其應(yīng)用價(jià)值[4-5]。本研究采用超聲提取法對迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行了提取，同時(shí)對該提取物的天然抑菌功效進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1主要儀器

超聲波清洗器（FA2104N）、萬能高速粉碎機(jī)（FW100）、紫外分光光度計(jì)（UV-6300）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（PE3000）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（HG 303-4）。

1.2試劑與材料

迷迭香、無水乙醇、1，3-丁二醇、1，3-丙二醇、正丁醇、丙三醇（甘油）、甲醇、石油醚、異丙醇、1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、1，3-丁二醇，皆為分析純，試驗(yàn)用水為純凈水。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。

培養(yǎng)基（牛肉營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨10 g，牛肉膏 5 g，酵母浸粉2 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，水100 mL，調(diào)pH值至7.2～7.6。

菌種培養(yǎng)與純化：將供試菌種分別挑于無菌的培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，從中挑選單個(gè)菌落進(jìn)行試管斜面培養(yǎng)，備用。取活化的斜面菌種分別用接種環(huán)挑取菌苔，用無菌水制成含菌數(shù)為106 CFU/mL的菌懸液待用。

提取液的制備：將提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再用1，3-丁二醇溶解制備濃度為0.5 g/mL的迷迭香提取原液，經(jīng)高壓滅菌后備用。

濾紙片的制備：取直徑為6 mm的圓形高壓滅菌濾紙片若干，分別浸入迷迭香原液中，浸泡使其充分吸收，再烘至干燥備用。

1.3DPPH·法評價(jià)迷迭香提取液的抗氧化性

將提取液稀釋500倍后進(jìn)行以下操作：取3支比色管，精確量取提取溶劑2 mL和2 mL LDPPH·溶液到1號比色管，即為空樣溶液；精確量取2 mL提取液和2 mL DPPH·溶液到2號比色管，即為反應(yīng)溶液；精確量取2 mL提取液和2 mL無水乙醇溶劑到3號比色管，即為空白溶液。分別將振蕩搖勻后的上述溶液置于暗處避光反應(yīng)30 min后，于517 nm波長處測定吸光度（D）分別得到D空樣液、D反應(yīng)液、D空白液，按公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

DPPH·清除率=[1-（D反應(yīng)液-D空白）/D空樣液]×100%。[JY]（1）

1.4迷迭香中活性成分的提取

將烘干至恒質(zhì)量的迷迭香樣品用粉碎機(jī)粉碎后，稱取一定量的迷迭香粉分別放入相應(yīng)的提取劑中，在不同的條件下進(jìn)行提取，得到含迷迭香活性成分的提取溶液。

1.5抑菌試驗(yàn)

1.5.1抑菌活性取0.1 mL的菌懸液，均勻涂抹在平板培養(yǎng)基表面，制成含菌平板。用無菌鑷子小心取出干燥的濾紙片于各含菌平皿上，每皿5片（求其平均值），同時(shí)做無菌生理鹽水、無菌平皿、無菌空白濾紙、50%乙醇、1，3-丁二醇、純水和培養(yǎng)基對照試驗(yàn)。平行3次，然后將各平皿置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取出后測其抑菌圈直徑大小并比較抑菌活性。

1.5.2抑菌濃度固體平板培養(yǎng)基稀釋法[6]：取無菌試管10支，分別加入1 mL無菌蒸餾水，取迷迭香提取物原液 1.0 mL 移入1號試管，混勻后，取出1.0 mL混合液移入2號試管，依次操作。從9號管取出1.0 mL棄去。迷迭香提取物原液按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512的比例進(jìn)行稀釋。使1～8號管中均含有1 mL不同稀釋度的提取液，9號管為無提取物對照。然后在每支試管中加入融化至55 ℃的固體瓊脂培養(yǎng)基（9 mL）充分混勻，傾注平板（10 mL/平皿），形成12.5、6.25、3.15、1.563、0.782、0.391、0.195、0.098、0 mg/mL含迷迭香原液的普通培養(yǎng)基，平板凝固后，分別取大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的菌懸液（濃度均為106 CFU/mL ） 0.1 mL涂布于平板表面，同時(shí)做50%乙醇、1，3-丁二醇、蒸餾水及培養(yǎng)基的空白試驗(yàn)，置于37 ℃培養(yǎng) 18～24 h，平行3次，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

本試驗(yàn)采用二苯基苦基苯肼（簡稱DPPH）分光光度法評價(jià)迷迭香提取物的抗氧化活性，該方法是評價(jià)自由基清除效果和挑選天然抗氧化劑最常用的方法[7]。通過比較紫外可見分光光度計(jì)檢測DPPH·與提取液反應(yīng)后的吸光度的變化，從而建立了評價(jià)提取液的清除率體系，在該評價(jià)體系的基礎(chǔ)上，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，從而確定最佳提取工藝。

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同提取劑對迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱1.5 g迷迭香粉末于45 mL溶劑中，溶劑分別采用純水、無水乙醇、50%乙醇、75%乙醇、1，3-丁二醇、1，3-丙二醇、正丁醇、丙三醇（甘油）、甲醇、石油醚、異丙醇，在40 ℃下超聲 1 h，抽濾得到樣品的提取液。計(jì)算提取液對DPPH的清除率，結(jié)果見圖1。

因?yàn)橐掖嫉奶崛⌒Ч己?，考慮到經(jīng)濟(jì)節(jié)約的原則，又分別采用純水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、無水乙醇作為溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

從圖2中可以看出，對于相同的迷迭香粉量，用50%乙醇提取時(shí)，得到的提取物抗氧化能力最強(qiáng)，75%乙醇次之，純水的提取效果最差。考慮到經(jīng)濟(jì)，選用50%乙醇最為合適。

2.1.2不同提取方式對迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱1.5 g迷迭香粉加入到45 mL的50%乙醇中，于40 ℃下分別采用水浴振蕩、攪拌、超聲波輔助、微波（2 min）、靜置5種提取方式進(jìn)行提取，提取時(shí)間為1 h，抽濾得到提取液。從圖3可知，超聲提取效果最佳，水浴振蕩次之，微波的效果最差。

2.1.3料液比對迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱 1.0 g 迷迭香粉，在提取溫度為40 ℃，提取液濃度為50%乙醇，提取時(shí)間1 h的條件下，依次在料液比為1 ∶[KG-3]10、1 ∶[KG-3]15、1 ∶[KG-3]20、1 ∶[KG-3]25、1 ∶[KG-3]30、1 ∶[KG-3]35（g ∶[KG-3]mL）的條件下進(jìn)行提取。從圖4中可以看出，隨著料液比的增加，提取效果先增強(qiáng)后降低，當(dāng)原料一定時(shí)，溶劑用量越多原料顆粒周圍濃度越低，細(xì)胞壁內(nèi)外濃度差越大，這樣有利于有效成分的溶出，但當(dāng)溶劑用量繼續(xù)增加時(shí)，因溶劑揮發(fā)帶來的損失會增大，導(dǎo)致提取率有所減小，故最佳提取料液比為1 g ∶[KG-3]20 mL。

2.1.4不同提取時(shí)間對迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱1.0 g迷迭香粉在20 mL 50%乙醇溶液中，溫度為40 ℃的條件下，依次在0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 h的時(shí)間下進(jìn)行超聲提取，測定其抗氧化能力，隨著時(shí)間延長，提取液的抗氧化率有所增加。隨著時(shí)間的延長，一方面，抗氧化物浸出率增加；另一方面，抗氧化物被氧化的程度也相應(yīng)增加。綜合考慮，提取效果較佳的時(shí)間為1.0 h（圖5）。

2.1.5不同提取溫度對迷迭香中抗氧化物提取效果的影響稱迷迭香粉1.0 g，于20 mL提取液濃度為50%的乙醇溶液、提取時(shí)間為1 h條件下，依次在溫度為30、40、50、60、70、80、90 ℃下進(jìn)行提取，提取效果隨著溫度的增加，也有小幅度的上升趨勢， 但是，提取溫度升高，不僅會影響活性成分的穩(wěn)

通過分析表明，4因素對抗氧化率的影響順序?yàn)樘崛囟?gt;料液比>提取時(shí)間>乙醇溶液濃度。最佳的提取工藝條件是提取溫度為40 ℃，料液比 1 g ∶[KG-3]22 mL，提取時(shí)間為1.0 h，提取劑為50%乙醇。

根據(jù)正交試驗(yàn)中的最佳提取條件，稱1.0 g取3份迷迭香樣品，分別加入22 mL的50%乙醇，并在溫度為40 ℃下，超聲輔助提取1.0 h得到迷迭香提取液，分別測定每克清除率為90.15%、93.0%、91.45%。即平均每克清除率 91.53%，驗(yàn)證了正交試驗(yàn)的結(jié)果是可靠的。

2.3抑菌試驗(yàn)

2.3.1抑菌活性圖7是迷迭香提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性情況，試驗(yàn)結(jié)果表明迷迭香提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑菌作用，抑菌圈的平均大小分別為19.6、20.9 mm。對比抑菌圈的大小可以得出，迷迭香提取液對金黃色葡萄球菌的抑制作用高于對大腸桿菌的抑制作用。

3結(jié)論

通過超聲提取法對迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，考查了不同因素（如提取劑濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等）對迷迭香抗氧化成分提取效果的影響，其影響主次為提取溫度>料液比>提取時(shí)間>提取溶劑。確定了迷迭香中的抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝條件為提取溶劑50%乙醇，料液比1 g ∶[KG-3]22 mL，提取時(shí)間10 h，溫度40 ℃。

此外，采用濾紙片法，研究了迷迭香提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用，研究結(jié)果顯示迷迭香活性提取物對上述2種細(xì)菌皆有良好的抑菌效果，其抑菌圈大小分別為大腸桿菌19.6 mm、金黃色葡萄球菌20.9 mm；最低抑菌濃度分別為大腸桿菌0.782 mg/mL、金黃色葡萄球菌0.391 mg/mL。

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