基于離子選擇性微電極的黃瓜細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽測量

胡靜??毛罕平+胡圣堯??溫貽芳??于霜??+韓綠化+儲建華+高新浩

摘要：描述了能夠測量黃瓜葉片細(xì)胞內(nèi)硝酸根離子活度和膜電位的雙管微電極的制作和使用情況。掃描電鏡顯示電極尖端不易受黃瓜表皮毛的損壞并通過微操縱器的步幅來控制電極進(jìn)入細(xì)胞的程度。硝酸根電極的標(biāo)定曲線顯示硝酸根離子選擇性微電極對硝酸根離子有很好的敏感性，數(shù)據(jù)可靠。用雙管電極測得的黃瓜葉片表皮細(xì)胞的硝酸根活度為165 mmol/L。結(jié)果證實(shí)之前用于大麥葉片的離子選擇性電極也能成功地用于黃瓜葉片，因此可以用微電極技術(shù)來診斷黃瓜營養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：黃瓜；硝酸鹽；選擇性微電極；營養(yǎng)診斷

中圖分類號： TS207.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0373-03

在20世紀(jì)的最后幾十年，科技發(fā)達(dá)國家的溫室園藝呈現(xiàn)出創(chuàng)新和技術(shù)高速發(fā)展的特點(diǎn)。技術(shù)應(yīng)用不僅僅在大范圍和高產(chǎn)量上，還主要在溫室產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性上。可持續(xù)發(fā)展的焦點(diǎn)主要在產(chǎn)品的質(zhì)量改進(jìn)和對環(huán)境影響的大大減少上。但是在溫室園藝上經(jīng)常會出現(xiàn)氮、磷、鉀、鈣的失調(diào)，氮是限制植物生長和產(chǎn)量的主要因子，氮也是作物中許多重要有機(jī)物如蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素、酶、維生素、生物堿和一些激素的主要成分。硝態(tài)氮是絕大多數(shù)植物的主要氮素來源，由于硝態(tài)氮重要的營養(yǎng)作用，因此細(xì)胞內(nèi)硝態(tài)氮的測量就顯得尤為重要。微電極是一種能夠直接刺入植物細(xì)胞的微小探針，通常參考電極置于外部測量溶液中，測量電極既能置于植物表面也能直接刺入單個細(xì)胞，離子選擇性微電極能用于在體內(nèi)估計細(xì)胞內(nèi)的鉀離子[1-3]、硝酸根離子活度[4]和pH值[5-7]等。微電極技術(shù)能在體內(nèi)測量細(xì)胞內(nèi)的離子活度，然而絕大多數(shù)的測量在根部[8-9]，因為葉片是相對薄的，并且葉片表面特性更復(fù)雜，微電極用于葉片測量的植物主要有大麥和小白菜[10-13]。黃瓜是最常見的溫室作物，本研究制備了雙管硝酸鹽離子選擇性微電極，并用它第一次測量了黃瓜葉片的細(xì)胞內(nèi)硝酸鹽濃度，以量化溫室作物的營養(yǎng)需求并建立精確的溫室管理模型。量化產(chǎn)品改進(jìn)并減少環(huán)境污染是非常重要的。

1材料與方法

1.1植物材料

供試黃瓜品種為津優(yōu)1號，在20～25 ℃下的濕紗布上對黃瓜種子催芽4 d后，把大小一致的苗移栽到盆里，盆的開口徑為22 cm，高度為20 cm，種植基質(zhì)為珍珠巖。黃瓜苗生長在溫室里，保持濕度（70±10）%，用山崎配方種植黃瓜，黃瓜長至7葉1心時用微電極方法進(jìn)行葉片測量。

1.2黃瓜葉片表面特性

黃瓜葉片（5 mm×6 mm）清洗后用4%戊二醛溶液固定，經(jīng)過脫水處理后用單面刀片進(jìn)行徒手切片，切成2 mm左右厚的橫斷面。將制備好的樣品粘在導(dǎo)電膠上，離子濺射鍍膜，噴[CM（25]金厚度為20[KG3]nm，然后將其粘貼在掃描電鏡樣品臺上，在[CM）]〖LM〗 15 kV 加速電壓下進(jìn)行觀察、拍照。

1.3硝酸根離子敏感劑（nitrate sensor）的配制

用0.000 1 g的電子天平依次精確稱取0.006 0 g甲基-N，N，N-三十二烷基銨硝酸根離子（methyltride-docylammonium-nitrate，MTDDA-NO3-，Sigma公司生產(chǎn)），0.001 0 g溴化甲基-三苯基磷酸銨（methyltriph-enylphosphomium bromide，F(xiàn)luca公司生產(chǎn)），0.065 0 g 2-硝基苯基-辛烷基乙醚（2-nitrophenyl octyl ether，F(xiàn)luca公司生產(chǎn)），0.023 0 g聚乙烯（PVC，F(xiàn)luca公司生產(chǎn)）和0.005 0 g硝化纖維素（nitrate celluclose），然后加入0.45 mL四氫呋喃溶解[14]。由于四氫呋喃會溶解塑料，配制硝酸根離子敏感劑所用的器械用具應(yīng)避免使用塑料制品。配制好的硝酸根離子敏感劑應(yīng)封存在玻璃容器中，第一次使用之前充分振蕩后再使用。

1.4雙阻微電極的制作

采用PMP-107型編程多管拉制儀，拉制微電極通過設(shè)置熱值水平（heat level）、加熱時間（time）和拉力（pull）使雙管玻璃管拉制成理想的微電極。所使用雙管玻璃管由管徑不同的2根單管玻璃管粘合而成，其內(nèi)徑分別為0.800 mm和0.400 mm，外徑分別為1.000 mm和0.600 mm，粗管和細(xì)管中粘合有纖維絲，以使溶液能夠迅速地進(jìn)入電極尖部，其直徑分別為0.100 mm、0.080 mm。根據(jù)我們的測定，理想的微電極針尖直徑為0.8～1 μm，加熱溫度過高，針尖過長或過軟都不適合插進(jìn)葉片細(xì)胞中。

1.5雙孔硝酸根離子選擇性電極的制備及測量

在通風(fēng)櫥中，將拉制好的雙孔玻璃管置于140 ℃下烘烤30～60 min，除去殘存在玻璃管內(nèi)的水蒸氣和雜質(zhì)，然后用 1 mL 注射器在雙孔玻璃管中粗管的尾部滴入1～2滴2%的二甲基二氯硅烷（DCMS，F(xiàn)luca公司生產(chǎn)）進(jìn)行硅化，使二甲基二氯硅烷的蒸氣進(jìn)入玻璃管的尖部，目的是在粗管尖部形成一層疏水層，以利于硝酸根離子敏感膜的形成和作用。硅化后，在140 ℃下繼續(xù)烘烤1～1.5 h，使過量的二甲基二氯硅烷蒸發(fā)掉。然后，將已配制好的硝酸根離子敏感劑（nitrate sensor）灌入雙阻玻璃微管的粗管中，放入硅膠干燥的密閉容器中保存48 h以上以使多余的四氫呋喃蒸發(fā)。制備好的雙阻硝酸根離子選擇性微電極，用1 mL的注射器在雙孔玻璃管的細(xì)管中注入100 mmol/L KCl，用作測定膜電位，在粗管中注入100 mmol/L KCl和100 mmol/L KNO3的混合溶液，用于測定由于硝酸根離子敏感膜的存在使硝酸根離子跨膜運(yùn)動而產(chǎn)生的膜電位[9]。細(xì)胞內(nèi)測量由MultiClamp 700B 放大器和數(shù)模轉(zhuǎn)換器（Digidata 1322）獲得（Axon Instruments，USA），采樣頻率為10 Hz。pClamp 9.2（Axon Instruments）軟件用來采集和分析數(shù)據(jù)。

1.6硝酸鹽選擇微電極的標(biāo)定

在使用雙阻離子選擇性微電極測定膜電位之前應(yīng)該進(jìn)行標(biāo)定（表1）[14]，以確保：（1）硝酸根離子敏感劑對硝酸根離子的敏感性，來驗證硝酸根離子敏感劑配制質(zhì)量的好壞。（2）硝酸根離子敏感劑對硝酸根離子敏感的程度，用經(jīng)計算機(jī)軟件計算得到的3個參數(shù)（P1、P2、P3）來表示。P1為微電極參比電位；P2為電位差對-lg（aNO3-）作圖所得曲線的斜率，即標(biāo)定溶液中硝酸根離子活度每改變1個數(shù)量級，所產(chǎn)生的電位的差值；P3為選擇性離子電極的檢出限濃度。理想的P2在48～58 mV之間，P3<1.0 mmol/L。P2大于58 mV，說明電極尖部被破壞；小于48 mV，微電極對硝酸根離子的敏感度不高，檢測限較高。在測定之后，也應(yīng)該對微電極進(jìn)行標(biāo)定，以證實(shí)在測定過程中沒有破壞微電極的尖部和所充灌形成的[JP3]硝酸根離子敏感膜。測定前后所計算得到相近的P1、P2、P3才作為可靠的數(shù)據(jù)保留。測定之后將不能進(jìn)行標(biāo)定的電極棄掉。

1.8數(shù)據(jù)分析

計算硝酸根離子活度參數(shù)P1、P2、P3，用Sigmaplot繪圖軟件計算，根據(jù)公式E=P1-P2×[-lgaNO3- ]+P3[15]計算得到硝酸根離子活度。

2結(jié)果與分析

2.1葉片表面特性

從圖1-A上看表皮毛的間隔500～800 μm，電極尖端小于1 μm，因此只要足夠小心，表皮毛就不會破壞電極尖端，表皮細(xì)胞見圖1-B。表皮細(xì)胞的平均寬度是7 μm，在電極尖端碰到葉片時，電勢差會有一個劇烈的變化，微操縱器的單個步幅是0.2 μm或者0.04 μm，因此在電極尖端碰到葉片時，通過微操縱器的步幅來控制電極進(jìn)入細(xì)胞的程度。

2.2微電極的標(biāo)定

硝酸根離子選擇性電極在刺入植物葉片細(xì)胞前后都應(yīng)該對微電極進(jìn)行標(biāo)定，以證實(shí)在測定過程中微電極的尖部和所充灌形成的硝酸根離子敏感膜沒有受到破壞。測定前后所計算得到相近的P1、P2、P3才作為可靠的數(shù)據(jù)保留，測定之后不能進(jìn)行標(biāo)定的電極及其數(shù)據(jù)放棄。

圖2所示為測定前后硝酸根電極的標(biāo)定曲線。從圖2上可以看出，硝酸根離子選擇性電極的測定點(diǎn)電位及標(biāo)定曲線在測定前后的重疊性都很高，測定前標(biāo)定所得到的P1=-77.8 mV，P2=-54.0 mV，P3=0.000 122 1 mmol/L，測定后標(biāo)定所得到的P1=-78.6 mV，P2=-53.3 mV，P3=0.000 148 4 mmol/L。 P1為微電極參比電位，本研究中所制備硝酸根離子選擇性電極的參比電位在-78 mV左右，P2為標(biāo)定溶液中硝酸根離子活度每改變1個數(shù)量級，所產(chǎn)生的電位的差值。 理想的P2絕對值在48～58 mV之間，P2大于 58 mV，說明電極尖部被破壞；小于48 mV，說明微電極對硝酸根離子的敏感度不高，檢測限較高。本研究中所制備硝酸根離子選擇性電極的P2絕對值在53～ 54 mV之間，說明微電極對硝酸根離子的敏感度很好，滿足使用的要求。P3為選擇性離子電極的檢出限濃度，P3<1.0 mmol/L。本研究中所制備硝酸根離子選擇性電極的檢出限濃度在10-4 mmol/L量級，檢出限精度非常高。本研究標(biāo)定前后3個參數(shù)值相近，說明硝酸根離子選擇性微電極對硝酸根離子有很好的敏感性，且在整個測定過程中一直保持良好的選擇性，沒有因為插入葉片而被影響。

2.3黃瓜葉片細(xì)胞內(nèi)硝酸根離子活度的測定

當(dāng)在其中一根玻璃管中灌入100 mmol/L的KCl，另一根玻璃管中灌入硝酸根離子敏感劑后，插入黃瓜葉片細(xì)胞內(nèi)所得的膜電位和硝酸根離子的活度（圖3）。圖3-A表示記錄到的細(xì)胞內(nèi)的膜電位-163 mV，圖3-B表示硝酸根離子選擇電極所記錄到的膜電位-198 mV，計算得到膜電位A與B之間的差值為-35 mV，應(yīng)用 Simaplot 軟件模擬 Nicolsky-Eisenman 校正曲線和計算離子活度的方法，得到的細(xì)胞內(nèi)硝酸根離子的活度，大約為165 mmol/L（圖3-C）。

3討論

本研究第一次報道了溫室內(nèi)作物的離子選擇性微電極的細(xì)胞內(nèi)記錄。離子選擇性微電極主要用在測量根上，很少有關(guān)于葉片的報道，主要原因是葉片很容易振動，很難穩(wěn)定記錄。而且葉片表皮細(xì)胞的蠟質(zhì)層也是很難刺穿的，電極很容易斷掉，但是只要優(yōu)化電極的尖端和電極的形狀，以上這些困難就可以克服?？偠灾?，本研究證實(shí)了先前用于大麥葉片的離子選擇性微電極也能成功地測量黃瓜葉片，因此可以用微電極技術(shù)來診斷黃瓜的營養(yǎng)，這種技術(shù)也可能成為診斷作物營養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]MacRobbie E，Lettau J .Ion content and aperture in isolated guard cells of Commelina communis[J]. J Membr Biol，1980，53：199-205.

[2]Rona J P，Cornel D，Grignon C，et al. The electrical potential difference across the tonoplast of Acer pseudoplutanus cells[J]. Physiol Veg，1982，20：459-463.

[3]Maathuis F，Sanders D. Energization of potassium uptake in Arabidopsis thaliana[J]. Planta，1993，191：302-307.

[4]Miller A J，Zhen R G.Measurenent of intracellular nitrate concentrations in chura using nitrate-selective microelectrodes[J]. Planta，1991，184：47-52.

[5]Felle H H，Bertl A.The fabrication of H+-selective liquidmembrane microelectrodes for use in plant cells[J]. J Exp Bot，1986，37：1416-1428.

[6]Reid R J，Smith F A.Measurements of the cytoplasmic pH of Churu corullina using double-barrelled pH microelectrodes[J]. J Exp Bot，1988，39：1421-1432.

[7]Miller A J，Smith SJ.The mechanism of nitrate transport across the tonoplast of barley root cells[J].Planta，1992，187：554-557.

[8]Miller A J，Walker D J，Smith S J. Nitrate and potassium compartmentation in nitrogen and potassium starved barley root cells [M]. EU Commission Press，1995：263-268.

[9]Walker D J，Smith S J，Miller A J.Simultaneous measurement of intracellular pH and K+or NO-3 in barley root cells using triple-barreled，ion-selective microelectrodes[J]. Plant Physiology，1995，108：743-751.[ZK）]

[10]Walker D J，Leigh R A，Miller A J.Potassium homeostasis in vacuolate plant cells[J]. Proc Natl Acad. Sci，1996，93：10510-10514.

[11]Miller A J，Cookson S J，Smith S J，et al.The use of microelectrodes to investigate compartmentation and the transport of metabolized inorganic ions in plants[J].Journal of Experimental Botany，2001，52（359）：541-549.

[12]Cuin T A，Miller A J，Laurie S A，et al.Potassium activities in cell compartments of salt-grown barley leaves[J]. Journal of Experimental Botany，2003，54（383）：657-661.

[13]賈莉君，范曉榮，尹曉明，等. 雙阻離子選擇性微電極測定活體不結(jié)球小白菜葉片細(xì)胞中硝酸根離子的活度[J]. 土壤學(xué)報，2005，42（3）：447-452.

[14]Jia L J，F(xiàn)an X R，Yin X M，et al. Measurement of nitrate activity in leaf cells of Chinese cabbage in vivo using doubled-barreled nitrate selective microelectrode[J].Acta Pedologica Sinica，2005，42（3）：447-452.

[15]Miller A J，Zhen R G. Measurement of intracellular nitrate concentrations in Chara using nitrate-selective microelectrodes[J]. Planta，1991，184：47-52.