SLE結合GC-MS法測定葡萄酒中氨基甲酸乙酯

張萬利，梁新紅*，冉軍艦，孫俊良，莫海珍

（河南科技學院食品學院，河南新鄉453003）

SLE結合GC-MS法測定葡萄酒中氨基甲酸乙酯

張萬利，梁新紅*，冉軍艦，孫俊良，莫海珍

（河南科技學院食品學院，河南新鄉453003）

建立了固液萃取（SLE）結合氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法測定葡萄酒中氨基甲酸乙酯（EC）含量的檢測方法。以硅藻土為吸附劑，二氯甲烷為萃取溶劑，對葡萄酒中氨基甲酸乙酯進行萃取。結果表明，二氯甲烷用量為70 mL，酒樣中乙醇體積分數低于12%，萃取效果最佳。EC在200～1 600 μg/L范圍內線性關系良好（R2=0.997 9）。加標回收率為91.30%～99.90%，相對標準偏差（RSD）為1.26%～1.98%，方法的精密度RSD值為1.61%～3.06%。表明該方法準確度高、重現性和精密度良好，適合用于葡萄酒樣品中EC含量的檢測。

固液萃取；氣相色譜-質譜聯用法；葡萄酒；氨基甲酸乙酯

葡萄酒釀造過程中，瓜氨酸和尿素等物質和乙醇自發反應會生成致癌物氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）[1-2]，其為2A類致癌物[3]，加拿大、美國等國家對葡萄酒中EC含量規定了限量標準，世界衛生組織提議世界各國規定酒類飲料中EC的限量標準。

目前，葡萄酒中EC含量的檢測多采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）法[4-5]。應用GC-MS方法檢測食品中痕量成分的前處理過程不僅耗時、操作過程繁瑣，而且較易引入分析誤差，因此，選用的樣品前處理方法直接影響到GC-MS儀器分析的成本、準確性和實用性。樣品前處理方法主要有液/液萃取（liquid liquidextraction，LLE）、固相萃取（solidphaseextraction，SPE）、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）等[6-11]。

液/液萃取是傳統的GC分析的前處理方法，其操作過程簡單，但因作為萃取劑的有機溶劑和水相存在乳化現象，分析結果的精密度及準確度均較低。固相萃取法是基于液相色譜理論的一種分離純化方法，雖然沒有出現乳化現象，但萃取劑消耗量大[6,14-15]。固相微萃取方法簡便、快速且不需萃取溶劑，但方法的精密度和準確度較低[8-9]。因此前處理方法中減少萃取溶劑消耗量且提高檢測結果的精密度和準確度是GC-MS檢測中亟待解決的重要關鍵問題。固液萃取是將具有高效、高選擇性和吸附性的硅藻土和待測樣品混合均勻，置入玻璃色譜層析柱中，然后用萃取溶劑以一定的速率進行洗脫目標檢測物的方法。目前，少見固液萃取應用于GC-MS分析前處理方法的文獻報道。

本研究采用SLE前處理方法對葡萄酒樣品進行萃取，結合GC-MS法檢測葡萄酒中EC含量。以期快速準確測定葡萄酒中EC含量，為葡萄酒質量控制提供技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品：市售；氨基甲酸乙酯（純度＞99%）、丙酮（色譜純，純度≥99.9%）、乙醇（色譜純，純度≥99.8%）：美國Sigma-Aldrich公司；氨基甲酸丙酯（n-propyl carbamate，nPC）（純度＞98%）：美國Sigma公司；Celite 545 coarse硅藻土：美國Fluka公司；二氯甲烷（分析純）：上海恒岳化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Thermo Trace GC ultra-DSQ GC-MS：美國Finnigan公司；DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司；SENCO W201旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 EC模式溶液和nPC內標溶液的配制[14]

將一定量的EC和nPC標準品分別溶于色譜級丙酮中，分別配制成10 000 μg/L的EC丙酮溶液和nPC丙酮溶液，備用。分別取4.0 mL 10 000 μg/L的EC丙酮溶液和8.0 mL 10 000 μg/L的nPC丙酮溶液，充分混勻，然后用蒸餾水稀釋至100 mL，稀釋后溶液即為EC模式溶液，溶液中EC和nPC含量分別為0.4 μg/mL和0.8 μg/mL。

取含量為10 000 μg/L的nPC丙酮溶液8 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL，即為800 μg/L的nPC內標溶液。

1.3.2 SLE操作方法及EC標準曲線的繪制

EC-nPC標準溶液配制：用蒸餾水將EC丙酮溶液（10.0 μg/mL）和nPC丙酮溶液（10.0 μg/mL）進行稀釋，得到以下不同含量的EC-nPC標準溶液：0.2μg/mLEC+0.8μg/mL nPC、0.4 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC、0.8 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC和1.6 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC。

SLE操作方法及EC標準曲線繪制：取各含量的EC-nPC標準溶液1.0 mL于燒杯中，與19.0 mL蒸餾水混合均勻，緩慢加入20.0 g硅藻土，充分攪拌均勻。將混合好的EC-nPC-硅藻土混合物裝入玻璃色譜層析柱中，用二氯甲烷進行洗脫，二氯甲烷流速為2 mL/min，洗脫液用蒸餾燒瓶進行收集。洗脫液收集完畢，用10.0 g無水硫酸鈉除去洗脫液中的水分，備用。

除去水分后的洗脫液在30℃下用真空旋轉蒸發儀進行濃縮，蒸餾燒瓶中洗脫液濃縮至4.0 mL后移至KD濃縮瓶中，用2.0 mL二氯甲烷潤洗蒸餾燒瓶，潤洗液完全轉入KD瓶中，KD瓶中溶液在30℃下濃縮至1.0 mL后，完全移入1.0 mL離心管中。各梯度濃縮液進行GC-MS分析。以EC含量為橫坐標（x），EC-nPC的峰面積比值為縱坐標（y），繪制標準曲線，獲得EC標準曲線回歸方程。

葡萄酒樣品中EC的含量根據標準曲線回歸方程和濃縮倍數計算，計算公式如下：

式中：X為葡萄酒樣品中EC含量，μg/L；x為根據標準曲線獲得的EC含量，μg/mL；n為濃縮倍數。

1.3.3 GC-MS分析參數[6]

氣相色譜分析條件：DB-WAX毛細管色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度190℃，柱溫程序：初溫40℃，保持2min，然后以10℃/min升至180℃，保持0.5min，再以50℃/min的速度升至220℃，保持4 min。載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速1.0 mL/min，不分流進樣，進樣量1.0 μL。

質譜分析條件：電子電離（electron ionization，EI）離子源，離子源溫度220℃；電子能量70 eV；接口溫度220℃；電子倍增電壓1 568 V；檢測離子m/z 62、74、89，定量離子m/z 62；溶劑延遲10 min。

2 結果與分析

2.1 二氯甲烷用量對EC萃取的影響

選擇二氯甲烷為萃取溶劑，對模式溶液中EC萃取后進行GC-MS分析，考察二氯甲烷用量為50～90 mL時對EC萃取效果的影響，結果如圖1所示。

圖1 二氯甲烷用量對EC萃取效果的影響(n=3)Fig.1 Effect of dichloromethane dosage on EC extraction efficiency (n=3)

由圖1可知，隨著二氯甲烷用量增加，EC-nPC峰面積比值迅速上升，這是因為隨著二氯甲烷用量的增加，EC-nPC-硅藻土混合物中更多的EC被二氯甲烷萃取出來。但當二氯甲烷用量由70 mL增至90 mL時，EC-nPC峰面積比值變化不顯著（P＜0.05），表明EC-nPC-硅藻土混合物中EC已經完全被二氯甲烷萃取。與李華等[6]報道的固相萃取前處理方法相比較，SLE方法中二氯甲烷用量減少了150.00%。因此，選擇70 mL二氯甲烷作為萃取溶劑。

2.2 乙醇體積分數對模式溶液中EC萃取的影響

研究表明，檢測酒精飲料中EC含量時，乙醇對EC檢測結果的準確度和精確度均有較大影響[15]。因此，向模式溶液中添加乙醇，考察乙醇體積分數為3%～21%時對模式溶液中EC萃取效果的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，當乙醇體積分數為3%～12%時，EC-nPC峰面積比值在（0.528±0.031）～（0.532±0.041）范圍內變化，且差異不顯著（P＞0.05），隨著乙醇體積分數繼續升高，EC-nPC峰面積比值開始下降，可能是因為乙醇和EC對硅藻土的競爭吸附，也可能是乙醇會包裹EC形成微膠團，導致EC的揮發性降低。因此，應用SLE對葡萄酒樣進行萃取時，酒樣乙醇體積分數應低于12%，如果酒樣中乙醇體積分數高于12%，應對酒樣進行適當稀釋。

圖2 乙醇體積分數對EC萃取效果的影響(n=3)Fig.2 Effect of ethanol content on EC extraction efficiency(n=3)

2.3 EC標準品及樣品GC-MS色譜圖

在葡萄酒EC含量檢測時，EC的總離子掃描質譜中，特征離子m/z 62為葡萄酒中EC含量檢測的定量離子。依據1.3.3的方法，分別對標準品和葡萄酒樣品進行GC-MS分析，獲得EC的總離子流色譜圖如圖3所示。

圖3 標準溶液(a)及葡萄酒樣(b)中EC總離子流色譜圖Fig.3 Total ions chromatograms of EC in standard solution(a)and wine sample(b)

由圖3可知，標準品和葡萄酒樣品中EC保留時間分別為13.31 min和13.34 min，分離效果較好，峰形良好，雜峰干擾少，可以用于實際樣品中EC含量的檢測。

2.4 EC標準曲線繪制

按照1.3.2操作方法，二氯甲烷用量為70 mL，應用SLE方法對系列標準溶液中EC進行萃取，并進行GC-MS分析，以EC含量為橫坐標（x），EC-nPC的峰面積比值為縱坐標（y），繪制EC標準曲線，結果見圖4。

圖4 氨基甲酸乙酯標準曲線Fig.4 Standard curve of ethyl carbamate

由圖4可知，標準曲線回歸方程為y=0.607 7x+0.011 2，相關系數為R2=0.997 9，結果表明，在0.2～1.6 μg/mL范圍內，EC含量和EC-nPC的峰面積比值呈良好的線性關系。

2.5 加標回收率試驗

取葡萄酒樣品，分別加入20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L的EC標準溶液，按照1.3.2處理方法，采用GC-MS進行檢測。計算加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），樣品加標回收率試驗結果見表1。

表1 加標回收率試驗結果(n=3)Table 1 Results of adding standard recovery rate tests(n=3)

由表1可知，EC的加標回收率為91.30%～99.90%，RSD值為1.26%～1.98%，表明方法準確度較高，可以用于檢測葡萄酒中EC含量的檢測。

2.6 方法精密度試驗

取EC含量分別為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL的溶液，根據建立的測定條件，分別測定6次，計算4個溶液樣品的相對標準偏差（RSD），結果見表2。

表2 精密度試驗結果(n=6)Table 2 Results of precision tests(n=6)

由表2可知，應用建立的方法測定4個樣品溶液中EC含量，測定結果的RSD在1.61%～3.06%，表明該方法的精密度較好。

2.7 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的測定

應用所建立的方法測定6個葡萄酒樣品中氨基甲酸乙酯的含量，結果見表3。

表3 葡萄酒中EC含量檢測結果Table 3 Determination results of EC content in wine

由表3可知，利用SLE前處理結合GC-MS方法檢測不同類型的葡萄酒中EC含量，檢測值在（8.29±0.32）～（35.96±0.95）μg/L，說明該方法能夠用于不同類型葡萄酒中EC含量的檢測。測定的6個葡萄酒樣品中，其中5個樣品的EC含量低于加拿大衛生與預防部門規定的30 μg/L。

3 結論

本研究建立了SLE前處理結合GC-MS檢測葡萄酒中EC含量新方法。應用固液萃取法萃取葡萄酒中EC時二氯甲烷用量為70 mL，酒樣中乙醇體積分數低于12%，萃取效果最佳。EC含量在0.2～1.6 μg/mL范圍內線性關系良好（R2=0.997 9）。加標回收率為91.30%～99.90%，相對標準偏差為1.26%～1.98%。方法的精密度RSD值為1.61%～3.06%。SLE方法準確度高、重現性好。建立的葡萄酒中EC含量檢測方法不出現乳化現象，有機溶劑用量少，方法準確可靠，可用于葡萄酒樣品中EC含量的檢測，對葡萄酒質量控制具有重要意義。

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Determination of ethyl carbamate in wine by SLE combined with GC-MS

ZHANG Wanli,LIANG Xinhong*,RAN Junjian,SUN Junliang,MO Haizhen(School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The determination method of ethyl carbamate(EC)in wine was established by SLE combined with GC-MS.Using diatomite as adsorbent, dichloromethane as extraction solution,the EC in wine was extracted.The results showed that the optimum extraction conditions were as follow: dichloromethane dosage 70 ml,ethanol content in wine＜12%.EC had a good linear relationship in range of 200-1 600 μg/L(R2=0.997 9),the adding standard recovery rate was 91.30%-99.90%,and relative standard deviation(RSD)was 1.26%-1.98%.The RSD of method precision was 1.61%-3.06%.Due to high accurate,good reproducibility and accuracy,the method could be used for the determination of EC content in wine.

solid liquid extraction;GC-MS;wine;ethyl carbamate

TS261.7

0254-5071（2017）01-0176-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.037

2016-07-26

河南省科技計劃項目(142102110127)；河南省教育廳自然科學研究資助計劃項目(14A550010)；河南省高校科技創新團隊支持計劃項目(16IRTSTHN007)

張萬利(1991-)，男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。

*通訊作者：梁新紅(1971-)，女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。