UPLC同時測定墨旱蓮藥材中8種成分的含量

侯雪峰+孫帥+汪剛+邱輝輝+丁淑敏+劉瑩+劉丹+封亮+賈曉斌

[摘要]建立一種超高效液相色譜法同時測定墨旱蓮中的異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內酯、芹菜素8種成分含量的方法。采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm），流動相A為乙腈，B為0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速：0.3 mL·min^-1；柱溫35 ℃；檢測波長350 nm。研究結果表明各指標成分之間分離度良好，在選定的濃度范圍內線性關系良好（r≥0.999 0），平均加樣回收率（n=6）在96.60%～103.4%，RSD為0.86%～2.4%。所建立的UPLC同時測定墨旱蓮藥材中8種指標成分的含量的方法回收率較好，重復性、穩定性良好，為墨旱蓮的鑒別及質量評價提供了科學依據。

[關鍵詞]墨旱蓮； 超高液相色譜法； 多指標成分； 含量測定

[Abstract]To establish an UPLC method for the simultaneous determination of 8 compounds in Eclipta Herba， such as isoquercitrin， luteoloside， demethylwedelolactone， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， luteolin， wedelolactone and apigenin. The experiment was performed with a Waters Acquity UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） column by gradient elution of 0.1% formic acid in water and acetonitrile： 0-4 min，10%-13% A； 4-10 min， 13%-16% A； 10-13 min， 16%-25% A； 13-17 min， 25%-28% A； 17-20 min，28%-40% A；20-25 min，40%-95% A. The flow rate was 0.3 mL·min^-1 .The condition of was the colum temperature was maintained at 35 ℃ and the detected wavelength was set at 350 mm. 8 components were separated clearly by this method. Also a good linearity was obtained between the chosen concentration（r≥0.999 0）. The measured data showed that the recovery rate range from 96.60%-103.4% （n=6） and their RSD values were 0.86%-2.4%. The method has high recovery rate， good reproducibility and stability. It provides a scientific basis for the identification and quality evaluation of Eclipta Herba.

[Key words]Eclipta Herba； UPLC； multi-component quantification； content determination

doi：10.4268/cjcmm20162116

墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L.干燥地上部分^[1]，廣泛分布于河南、安徽、江蘇、江西、浙江、福建、廣東、廣西、湖南、湖北等地^[2]。其始載于《新修本草》，有滋陰益腎涼血止血之功效。現代藥理研究證明，墨旱蓮具有保肝益腎^[3-4]、調節免疫^[5-6]、抗氧化^[7-8]、抗菌抗炎^[9]、抗瘧疾^[10]及抗腫瘤^[11-12]等作用，其主要化學成分主要有香豆草醚類、黃酮類、酚酸類等^[13]。目前《中國藥典》2015年版對墨旱蓮藥材的質量評價依賴于蟛蜞菊內酯單一化學成分的含量測定^[1]。然而傳統中藥的療效是多成分共同作用的結果，單一活性成分并不能代表藥材整體的質量。近年來多指標評價墨旱蓮的活性成分的報道較少，且多為2種成分同時定量^[14-15]，運用方法多為HPLC，大多集中在某一類別化學成分的評價^[16-18]。然而HPLC耗時長，其靈敏度較低，面對傳統中藥中低含量成分的檢測問題時常常束手無策。

UPLC具有耐高壓、快速分離、高靈敏度、高分離度等特點，能克服HPLC靈敏度低，分析時間長等缺點，在中藥等復雜體系的分離分析上具有明顯優勢^[18]，被廣泛地應用于中藥復雜體系的研究^[19-20]。本實驗首次建立了UPLC同時測定墨旱蓮藥材中8種活性成分含量的測定方法，該方法經試驗認證安全可靠簡便易行，重現性好，溶劑消耗少，為建立墨旱蓮藥材的質量控制與評價標準提供借鑒。

1 材料

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀，包括二元梯度泵、恒溫自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器（DAD）以及Waters Empower 2軟件（美國 Waters 公司）。Mettler Toledo MS105DU分析天平（Mettler Toledo 分析儀器有限公司）；KQ5200DE 型數控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

木犀草苷（批號111720-201408）、木犀草素（批號111520-201104）、蟛蜞菊內酯（批號111885-201403）、芹菜素（批號111901-201102）和異槲皮苷（批號111809-201403）均購自中國食品藥品檢定研究院；異去甲蟛蜞菊內酯（批號150401）、異綠原酸A（批號150311）和異綠原酸C（批號150420）均購自成都普菲德生物技術有限公司，所有對照品純度均≥98.0%。甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，購自美國TEDIA公司，水為Mlliipore超純水。6個批次墨旱蓮藥材（產地為安徽亳州；批號分別為150722，150731，150804，150830，150922，151011）購于精華制藥亳州康普有限公司，經南京中醫藥大學生藥學教研室吳德康教授鑒定為菊科植物鱧腸E. prostrate的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）； 流動相A為乙腈，B為0.1%的甲酸水，梯度洗脫條件：0～4 min，10%～13% A；4～10 min，13%～16% A；10～13 min，16%～25% A；13～17 min，25%～28% A；17～20 min，28%～40% A；20～25 min，40%～95% A。流速0.3 mL·min^-1；柱溫35 ℃；檢測波長350 nm；進樣量2 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備 分別稱取異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內酯、芹菜素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成對照品儲備液，備用。依次精密量取上述8個對照品儲備液適量置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，制成含異槲皮苷42.16 mg·L^-1、木犀草苷81.60 mg·L^-1、異去甲蟛蜞菊內酯36.80 mg·L^-1、異綠原酸A 40.80 mg·L^-1、異綠原酸C 14.60 mg·L^-1、木犀草素14.20 mg·L^-1、蟛蜞菊內酯208.00 mg·L^-1、芹菜素21.60 mg·L^-1的混合對照品溶液。

2.3 供試樣品溶液的制備 取墨旱蓮藥材粉末（過3號篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50 mL，密塞，稱定質量；超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min后，放至室溫，再次稱定質量，用80%甲醇補足失重，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。混合對照品及供試品色譜圖見圖 1。

2.4 線性關系考察 分別精密移取上述混合對照品溶液，加80%甲醇稀釋，稀釋倍數分別為0， 2.5， 10， 20， 50， 100倍，得一系列對照品混合溶液，搖勻。在上述色譜條件下進樣分析，以各成分峰面積為縱坐標（Y），質量濃度（mg·L^-1）為橫坐標（X），繪制標準曲線，計算回歸方程和線性范圍見表 1。

2.5 檢出限和定量限的測定 將2.2項下的混合對照品溶液用80%甲醇逐級稀釋后，以S/N≥3～4計算檢測限（LOD），以S/N≥10～12計算最小定量限（LOQ），結果見表 1。

2.6 精密度試驗 日內精密度：取同一混合對照品溶液，在上述色譜條件下連續進樣6次，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內酯、芹菜素峰面積的RSD分別為0.84%，1.2%，1.6%，0.63%，0.33%，0.81%，1.1%，1.4%。日間精密度：每天1次，以混合對照品溶液連續進樣5d，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內酯、芹菜素峰面積的RSD分別為0.97%，1.3%，1.5%，0.93%，0.83%，1.2%，1.7%，1.9%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗 取墨旱蓮藥材（批號150830）粉末1 g，參照2.3項下操作，平行制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內酯、芹菜素峰面積的RSD分別為1.7%，2.0%，2.6%，2.3%，1.1%，1.9%，2.5%，1.3%，表明重復性良好。

2.8 穩定性試驗 取墨旱蓮藥材（批號150830）粉末1 g，按2.3項下操作，經0.22 μm 微孔濾膜濾過至棕色量瓶中，在上述色譜條件下分別在0，2，4，6，8，12 h進樣分析，計算異槲皮苷、木犀草苷、異去甲蟛蜞菊內酯、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素、蟛蜞菊內酯、芹菜素峰面積的RSD 分別為0.86%，1.8%，2.2%，2.6%，1.3%，1.9%，2.3%，2.4%，表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱取9份已知含量的墨旱蓮藥材（批號150830）粉末0.020 0 g，分別精密加入高、中、低3種濃度的對照品溶液適量（分別相當于藥材原有含量的80%， 100%， 120%），每種濃度取3份，精密稱定，置離心管中，加入80%甲醇2 mL，密塞，稱定質量；之后操作參照2.3項下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，計算平均回收率，見表2。8種被測成分回收率在96.60%～103.4%，RSD在0.86%～2.4%，表明方法回收率較好。

2.10 樣品含量測定 取6個批次的墨旱蓮藥材粉末，參照2.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行分析，每批樣品平行測定2次，按照外標一點法計算各樣品中8種成分的含量，結果見表3。

3 討論

實驗初期對提取溶劑進行了考察，比較了不同濃度甲醇提取物的UPLC色譜圖，分別以純水， 40%，60%， 80%， 100%的甲醇溶劑超聲提取墨旱蓮藥材，其中以80%甲醇為提取溶劑時，色譜峰較多，且峰形好，提取效果最好。故本實驗最終確定用80%甲醇提取效果最佳。

在考察流動相時，有機相分別考察乙腈和甲醇，發現乙腈的分離效果較好，而用甲醇時色譜峰重疊、峰形差。此外，還考察了流動相中酸的種類對峰形的影響，分別采用了乙腈-0.1%乙酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液以及乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相進行比較，結果發現在流動相中加入酸可在一定程度上改善峰形。其中，以乙腈-0.1%甲酸水溶液的峰形最佳。

從表2中可以看出不同批次的墨旱蓮藥材中6種成分含量差異并不是很大，可能是由于藥材出自同一產地，且均在同一年的同一采收期購置得到。然而墨旱蓮產區遍及全國各省^[2]，分布及其廣泛，且未有道地產區的記載。不同產地由于自然資源、氣候條件以及人文因素的不同^[21-22]，藥材質量必將參差不齊。本課題組后續將進一步對不同產地墨旱蓮中化學成分的種類、含量及其量與量之間的關系進行比較，以期建立科學系統的藥材質量評價方法，確定不同產地墨旱蓮藥材成分的差異性。

無論單味藥還是復方中藥，其藥效的發揮主要還是依靠組分的整體協同作用。長期以來，中藥多成分及多靶點的作用特點一直被大家所認同，中藥材的質量評價不能停留在單一指標性成分上，建立多指標成分的測定方法，有助于實現現代中藥的多維質量控制。本實驗首次利用UPLC對墨旱蓮中的異槲皮苷，木犀草苷，異去甲蟛蜞菊內酯，異綠原酸A，異綠原酸C，木犀草素，蟛蜞菊內酯，芹菜素等8種成分進行同時測定，分析方法靈敏、準確、快速，重現性好，分析效率高，30 min內即可同時完成8種成分的準確測定，初步探究了墨旱蓮藥材的物質基礎，為墨旱蓮藥材的評價及質量控制提供借鑒。

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[責任編輯 丁廣治]