氘代替代物結(jié)合UPLC—MS/MS同步檢測(cè)去卵巢大鼠血漿中22種內(nèi)源性大麻素

向世勰+徐穎+朱晶晶+王智民+張東+陳兩綿+馮偉紅

[摘要]該文旨在建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同步檢測(cè)去卵巢大鼠血漿中22種內(nèi)源性大麻素類(lèi)物質(zhì)的新方法。首先血漿樣品經(jīng)固相小柱（SPE柱）萃取，然后利用UPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱，以0.1%乙酸溶液為流動(dòng)相A，乙腈-異丙醇（9∶1）溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，采用正離子多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式，以氘代試劑作為對(duì)照品的替代物計(jì)算回收率，同步定量22種內(nèi)源性大麻素。其中，22種內(nèi)源性大麻素類(lèi)物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，定量限（LOQs）為0.089 6～1.965 2 nmol·L^-1；5個(gè)氘代替代物的相對(duì)回收率為11.40%～129.9%；重復(fù)性考察結(jié)果顯示，RSD均小于8.0%。所建立的方法，可以用于去卵巢大鼠血漿樣品中PGF2α EA，AEA等多種內(nèi)源性大麻素類(lèi)物質(zhì)的定性與定量分析，驗(yàn)證了該方法的可行性及實(shí)用性。總之，該方法靈敏度高、重復(fù)性好、實(shí)用性強(qiáng)，可以用于大鼠血漿樣品脂質(zhì)代謝組學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜； 內(nèi)源性大麻素； 氘代替代物

[Abstract]A new method based on ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS） was developed for the simultaneous determination of 22 endocannabinoids（eCBs） and relevant compounds in ovariectomized rat plasma. After being extracted by solid-phase column（SPE）， the plasma samples were detected by using UPLC-MS/MS. Analysis was carried out with ACQUITY UPLC BEH C18 column. The mobile phase was 0.1% acetic acid solution（A）-acetonitrile and isopropanol（9∶1， B） for the gradient elution. In the positive ion multiple reaction monitoring（MRM） mode， deuterated reagents were taken as standard alternatives to calculate recoveries and simultaneously quantify 22 endocannabinoids. The established method provided a good linearity for the 22 eCBs， and their linearly dependent coefficients were all higher than 0.99. The limits of quantitation（LOQs） ranged from 0.089 6 to 1.965 2 nmol·L^-1. Relative recoveries of 5 deuterated surrogates ranged between 11.40% and 129.9%. The repeatability study results showed that RSD was all less than 8.0%. The established method could be used to analyze PGF2a EA， AEA and other endogenous cannabinoids in plasma samples of ovariectomized rats. In summary， this method was proved to boast a high sensitivity， repeatability and practicability， and thus could be used in rat plasma lipid metabolomics study.

[Key words]UPLS-MS/MS； endocannabinoids； deuterated surrogate

doi：10.4268/cjcmm20162122

內(nèi)源性大麻素（endocannabinoids，eCBs）作為內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)，能結(jié)合和激活大麻素受體（CB1與CB2），在各種不同的生理和病理過(guò)程中具有重要作用。與神經(jīng)保護(hù)、記憶、腫瘤、肥胖、免疫功能調(diào)節(jié)和心血管系統(tǒng)疾病等多種病理、藥理作用均有關(guān)^[1]。eCBs主要是N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamine）和2-花生四烯酸甘油（2-AG）2種（化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），還包括長(zhǎng)鏈飽和或不飽和脂肪酰胺、酯和醚等不同種類(lèi)，如：O-花生四烯酸乙醇胺（O-arachidonoyl ethanolamine，O-AEA）^[2]，2-花生四烯酸甘油酯（2-arachidonoyl glycerol ether，2-AGE）^[3]和N-花生四烯酸多巴胺（N-arachidonoyl dopamide，NADA）^[4]等。其中AEA和2-AG的生物活性最強(qiáng)，且兩者均是環(huán)加氧酶（COX-2）作用的底物，在COX-2的氧化下分別形成不同于經(jīng)典前列腺素的新型前列腺素，如前列腺素甘油酯（prostaglandin glycerol esters， PG-Gs）和前列腺素乙醇胺（prostaglandin ethanolamides， PG-EAs）^[5]。PG-Gs包括PGE2-G，PGI2-G，PGD2-G，PGF2α-G和TXA2-G。而PG-EAs由PGE2-EA，PGI2-EA，PGD2-EA，PGF2α-EA和TXA2-EA等組成。

目前，生物樣品中內(nèi)源性大麻素及其代謝產(chǎn)物的分析方法主要有液相色譜-紫外檢測(cè)法（HPLC-UV），液相色譜-熒光檢測(cè)法（HPLC-FD）^[6-8]，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）^[9-10]，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）^[11]，液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）^[12-13]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）^[14-16]等。內(nèi)源性大麻素在生物樣品中含量很低，而且其化學(xué)結(jié)構(gòu)特殊，缺乏必需的發(fā)色基團(tuán)或熒光基團(tuán)，因此不適于使用紫外或熒光檢測(cè)器進(jìn)行分析。GC-MS和GC-MS/MS分析前一般要求樣品具有較好的揮發(fā)性，且前處理過(guò)程復(fù)雜，樣品回收率低，不適用于生物樣品等熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。目前，LC-MS和LC-MS/MS仍然是分析生物樣品中內(nèi)源性大麻素及其主要代謝產(chǎn)物的最主要方法。因此，本文采用LC-MS/MS分析技術(shù)，采用固相小柱萃取樣品前處理方法，并首次使用氘代試劑作為對(duì)照品的替代物計(jì)算回收率，建立了一種基于UPLC-MS/MS同時(shí)定性/定量檢測(cè)去卵巢大鼠血漿中多種內(nèi)源性大麻素類(lèi)物質(zhì)的新方法。

1 材料

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；AB 5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL 20MW，湖南赫西儀器裝備有限公司）；METTLER TOLEDO XSE 105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；QL-901型渦旋儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；PSAN-8氮?dú)獍l(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；GM-1.0A兩用型隔膜真空泵（天津津騰公司）；Visiprep 24管防交叉污染固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；Oasis HLB 1cc（10 mg）固相萃取小柱（美國(guó)Waters公司）。甲醇、乙腈、異丙醇、乙酸（色譜純，美國(guó)Fisher公司）；抗氧化劑BHT/EDTA（美國(guó)Sigma公司）；甘油（美國(guó)Sigma公司）；內(nèi)源性大麻素類(lèi)對(duì)照品（美國(guó)Cayman公司）。試驗(yàn)用水均為Milli-Q純水儀制得的雙蒸水（德國(guó)默克密理博公司）。樣品為去卵巢組、假手術(shù)組、陽(yáng)性給藥組、七寶美髯方給藥組（低、中、高劑量）大鼠血漿。

2 方法

2.1 對(duì)照溶液的配制 內(nèi)標(biāo)1-cyclohexyl urea 3-dodecanoic acid（CUDA）溶液的配制：精密稱(chēng)取一定量的CUDA于5 mL量瓶中，甲醇定容，作為內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密量取上述內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液21 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容，制備終濃度為6 167.40 nmol·L^-1的CUDA內(nèi)標(biāo)溶液A，精密量取CUDA內(nèi)標(biāo)溶液A 160 μL于10 mL量瓶中，甲醇-乙腈（1∶1）定容，制備得到終濃度為100 nmol·L^-1的CUDA內(nèi)標(biāo)溶液B，-80 ℃冰箱保存，備用。

內(nèi)源性大麻素氘代替代物混合液的配制：精密吸取一定量的d8-NA-Gly，d5-2-AG，d4-PGF2α EA，d4-PEA，d8-AEA原液于同一5 mL量瓶中，甲醇定容，得到各物質(zhì)終濃度分別為6.49，6.26，6.23，6.59，6.19 μmol·L^-1，作為混合氘代儲(chǔ)備液C，-80 ℃冰箱保存，備用。精密量取1.6 mL上述混合氘代儲(chǔ)備液于10 mL量瓶中，甲醇定容，制備終濃度為1 000 nmol·L^-1的氘代替代物混合液D，-80 ℃冰箱保存，備用。

內(nèi)源性大麻素混合對(duì)照品溶液的配制：分別精密稱(chēng)取適量的PEA，SEA等7種內(nèi)源性大麻素類(lèi)對(duì)照品，甲醇定容，配成單標(biāo)溶液，備用。分別精密量取適量上述7種單標(biāo)溶液以及LEA，αLEA等15種對(duì)照品原液于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，得到22個(gè)內(nèi)源性大麻素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述內(nèi)源性大麻素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液3，1，0.3，0.08，0.008，0.001 mL，置于10 mL量瓶中，再分別加入適量且等量的CUDA內(nèi)標(biāo)溶液A，氘代替代物混合液C，甲醇定容，使各濃度梯度混合對(duì)照品溶液中CUDA內(nèi)標(biāo)和氘代替代物混合液的終濃度都為100 nmol·L^-1，-80 ℃冰箱保存，備用。

2.2 樣品預(yù)處理 固相萃取小柱（SPE柱）的準(zhǔn)備：分別使用乙酸乙酯1 mL，甲醇2 mL對(duì)SPE柱進(jìn)行活化，然后用2 mL酸水溶液1（0.1%乙酸水-甲醇 95∶5）對(duì)其進(jìn)行平衡，備用。樣品的準(zhǔn)備：精密量取血漿樣品100 μL，分別加入抗氧化劑（0.1 g·L^-1BHT-EDTA 1∶1）5 μL，5種氘代替代物混合液C 10 μL（濃度為1 000 nmol·L^-1），混合均勻后，備用。

樣品的處理：上樣，加入1 mL酸水1稀釋?zhuān)谧陨碇亓ψ饔孟伦匀幌疵摚患尤胨崴芤?（0.1%乙酸水-甲醇 7∶3）1 mL，在自身重力作用下自然洗脫；連續(xù)抽真空20 min，棄去濾液；分別使用甲醇0.2 mL，乙腈0.5 mL，乙酸乙酯0.7 mL依次沖洗小柱，合并濾液，并加入20%甘油甲醇溶液10 μL，氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?00 μL CUDA內(nèi)標(biāo)溶液B復(fù)溶，6 ℃，12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清液，-80 ℃冰箱保存，備用。

2.3 液相色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm， Part No.186002352）；流動(dòng)相：A相為0.1%乙酸水，B相為乙腈-異丙醇 9∶1，梯度洗脫，0～0.25 min，25%B，0.25～0.5 min，25%～40%B，0.5～1.5 min，40%～50%B，1.5～3 min，50%～55%B，3～3.5 min，55%～80%B，3.5～8 min，80%～85%B，8～9 min，85%～95%B，9～9.25 min，95%B，9.25～9.35 min，95%～100%B，9.35～10.35 min，100%B，10.35～10.5 min，100%～25%B，10.5～12 min，25%B，流速0.25 mL·min^-1；柱溫60 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），掃描模式為正離子多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM），檢測(cè)窗口時(shí)間范圍為0～12 min；碰撞氣（CAD）為9 psi（1 psi=6.895 kPa），霧化氣（Gas 1）為40 psi，輔助加熱氣（Gas 2）為40 psi，氣簾氣（CUR）為30 psi，離子源溫度（TEM）為500 ℃，噴霧電壓（IS）為-4 500 kV。使用Analyst 1.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及處理。

2.4 精密度試驗(yàn) 按照2.1項(xiàng)下方法操作，配制一定濃度的混合對(duì)照品溶液，同1 d連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄氘代替代物的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.5 回收率試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用氘代替代物計(jì)算回收率。按照2.2項(xiàng)下方法操作，記錄樣品中氘代替代物的峰面積A，按照2.1項(xiàng)下方法操作，配制一定濃度的混合對(duì)照品溶液，檢測(cè)并記錄純?nèi)軇┲须娲锏姆迕娣eB，通過(guò)比較相同量的氘代替代物在實(shí)際樣品與純?nèi)軇┲械姆迕娣e之比來(lái)考察回收率，即提取回收率=A/B×100%。

3 結(jié)果

3.1 方法專(zhuān)屬性 分別取加標(biāo)樣品溶液在上述液相色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，22種內(nèi)源性大麻素、5種氘代替代物及1種內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜圖見(jiàn)圖2。d4-PGF2αEA作為PGF2α EA，PGE2 EA，PGD2 EA，PGF2α 1G，PGE2 1G的內(nèi)標(biāo)，d8-AEA作為AEA，LEA的內(nèi)標(biāo)，d5-2-AG作為2-AG的內(nèi)標(biāo)，d8-NA-GLY作為NA-Gly，Dihomo GLA EA，1-AG，2-LG的內(nèi)標(biāo)，d4-PEA則為22個(gè)中除以上幾種內(nèi)源性大麻素的內(nèi)標(biāo)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 按上述色譜質(zhì)譜條件測(cè)定所配制的系列對(duì)照溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程，線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見(jiàn)表1。以大于10倍信噪比（S/N）得出22種內(nèi)源性大麻素類(lèi)的定量限。

3.3 精密度和回收率 配制一定質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，同1 d連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄氘代替代物峰面積，計(jì)算3次不同測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度的RSD低于8.0%。通過(guò)比較相同量的氘代替代物在實(shí)際樣品與純?nèi)軇┲械姆迕娣e之比來(lái)考察回收率，結(jié)果顯示，除d8-NA-Gly與d4-PEA回收率較低外，其他氘代替代物回收率都在80%以上，結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4 方法的應(yīng)用 用上述方法定性定量分析了去卵巢組、假手術(shù)組、陽(yáng)性給藥組、七寶美髯方給藥組（低、中、高劑量組）大鼠血漿中的內(nèi)源性大麻素類(lèi)代謝產(chǎn)物。各組中22種內(nèi)源性大麻素類(lèi)的含量結(jié)果見(jiàn)圖3。在對(duì)內(nèi)源性大麻素類(lèi)物質(zhì)定量分析的基礎(chǔ)上，采用SIMCA-P 12.0軟件，對(duì)所測(cè)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）與偏最小二乘判別（PLS-DA）分析，見(jiàn)圖4。試驗(yàn)結(jié)果表明，共定性檢測(cè)到PGF2a EA，PGF2a 1G，αLEA，DHEA，AEA，LEA，2-AG，dihomo GLA EA，1-AG，2-LG，1-LG，PEA，DEA，OEA，NO-Gly，1-OG，SEA等17種內(nèi)源性大麻素類(lèi)物質(zhì)，其中對(duì)PGF2a EA，AEA，LEA，1-AG，2-LG，1-LG，OEA，1-OG，SEA等8種物質(zhì)進(jìn)行了定量分析。其中1-OG，2-LG，1-LG含量相對(duì)較高；且去卵巢組內(nèi)源性大麻素明顯高于其他組。PCA分析與PLS-DA判別分析中可知，去卵巢組與假手術(shù)組明顯聚為2類(lèi)，經(jīng)七寶美髯方給藥治療后，各組中內(nèi)源性大麻素的成分有不同變化，且給藥劑量越高，越接近陽(yáng)性給藥組與假手術(shù)組，這些結(jié)果表明七寶美髯方具有雌激素樣作用，能改善脂質(zhì)代謝，降低血漿中內(nèi)源性大麻素的含量。

4 討論

4.1 樣品前處理方法的優(yōu)化 目前血漿樣品的前處理方法有蛋白質(zhì)沉淀法和固相萃取法，蛋白質(zhì)沉淀法又叫液液萃取法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、快速，缺點(diǎn)是在使用有機(jī)溶劑沉淀血漿中蛋白質(zhì)的同時(shí)，部分待測(cè)物會(huì)包裹其中，與蛋白發(fā)生共沉淀，造成待測(cè)物的損失。固相萃取法具有回收率高、除雜效果好等優(yōu)點(diǎn)，不足的是操作相對(duì)復(fù)雜，而且成本較高。試驗(yàn)比較了利用乙腈、甲醇等作為萃取劑的蛋白質(zhì)沉淀法和固相萃取法，結(jié)果表明固相萃取法對(duì)極性較大的內(nèi)源性大麻素類(lèi)物質(zhì)（如DHEA，AEA，LEA）有較高的萃取率，而經(jīng)乙腈和甲醇處理后的樣品中，這3種物質(zhì)損失較為嚴(yán)重。綜合考慮，選擇固相萃取進(jìn)行樣品前處理的方法。

4.2 應(yīng)用氘代替代物 進(jìn)行內(nèi)源性物質(zhì)的檢測(cè)與分析時(shí)，如何準(zhǔn)確的計(jì)算回收率是一個(gè)必須解決的問(wèn)題。如果采用常規(guī)的對(duì)照品法進(jìn)行回收率計(jì)算，樣品中自身存在的內(nèi)源性目標(biāo)分析物會(huì)干擾回收率的結(jié)果，無(wú)法計(jì)算得到真實(shí)的樣品回收率。尤其是當(dāng)樣品中分析物濃度比較低的時(shí)候，干擾更大，其回收率計(jì)算值往往會(huì)高于100%。本試驗(yàn)采用氘代對(duì)照品替代實(shí)際對(duì)照品，進(jìn)行回收率的考察，有效解決了上述干擾問(wèn)題。氘代對(duì)照品的優(yōu)勢(shì)在于它們?cè)跇悠分胁淮嬖冢皇軜悠分斜镜椎母蓴_，其化學(xué)結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)以及質(zhì)譜裂解方式均與實(shí)際對(duì)照品相似，可以用來(lái)代替對(duì)照品計(jì)算回收率。同時(shí)還可以有效地消除基質(zhì)的干擾，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，簡(jiǎn)化試驗(yàn)過(guò)程。另外，本試驗(yàn)氘代替代物回收率試驗(yàn)與樣品測(cè)定試驗(yàn)同步進(jìn)行，所有樣品信息只需采集1次，在完成樣品測(cè)定的同時(shí)，也采集到回收率數(shù)據(jù)，大大提高了試驗(yàn)效率，也降低了試驗(yàn)

成本，為內(nèi)源性物質(zhì)代謝組學(xué)的方法學(xué)研究提供了一個(gè)新的思路。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]