冰片對梓醇及葛根素透過局灶性腦缺血模型大鼠血腦屏障作用的研究

吳俊杰+汪宏錦+楊帥+劉楊+徐曉玉

[摘要]該研究通過觀察冰片是否具有促進梓醇、葛根素透過局灶性腦缺血模型大鼠血腦屏障的作用，及其是否與激活β₂腎上腺素受體-eNOS-NO途徑有關，從醫學生物學作用角度闡釋冰片“通竅引經”的傳統功效及其機制。該研究采用大鼠大腦中動脈阻塞局灶性腦缺血模型，5 d后神經功能障礙評分達5分者為造模成功。將模型成功大鼠隨機分為7組，用藥前經統計學檢驗各組間無顯著性差異后，灌服給予相應藥物[梓醇45 mg·kg^-1、 葛根素200 mg·kg^-1、冰片200 mg·kg^-1、布他沙明（Butoxamine，BTX）1.5 mg·kg^-1]：模型組（M組，溶劑）、梓葛組（ZG組）、梓葛冰組（ZGB組）、梓冰組（ZB組）、葛冰組（GB組）、β₂受體阻斷劑+梓葛組（BTX+ZG組）、β₂受體阻斷劑+梓葛冰組（BTX+ZGB組），另設假手術組（S組，溶劑），每組10只。各組給藥10 min后取材，采用UPLC-MS測定腦脊液中梓醇和葛根素含量，Western blot法測定腦組織中eNOS含量、β₂受體表達，Griess法檢測腦組織中NO含量。結果顯示，與假手術組相比，造模大鼠神經功能得分均值均在5分以上，具有顯著差異（P<0.05），顯示造模成功。除假手術組外，經單因素方差分析，給藥前各組之間的神經功能評分均無顯著性差異。給藥后與模型組相比，ZG組梓醇質量分數為26.673 μg·L^-1，葛根素含量在檢測限以下，腦組織中eNOS表達和NO含量、β₂受體表達沒有顯著差異；與ZG組相比，ZGB組、ZB組、GB組腦脊液中梓醇質量分數增加至40～43 μg·L^-1、葛根素質量分數增加至72～75 μg·L^-1，腦組織中eNOS表達和NO含量、β2受體表達均有顯著升高（P<0.05），顯示冰片有促進作用；與ZG組相比，BTX+ZG組大鼠腦脊液中梓醇質量分數為21.401 μg·L^-1，葛根素檢測不出，2組無顯著差異，顯示BTX無抑制作用；與ZGB組相比，BTX+ZGB組腦脊液中梓醇質量分數32.826 μg·L^-1、葛根素質量分數47.820 μg·L^-1，腦組織中eNOS表達和NO含量均有顯著下降（P<0.05），顯示BTX有抑制作用。該研究說明冰片能夠顯著促進梓醇、葛根素透過局灶性腦缺血大鼠血腦屏障，其作用可被β₂腎上腺素受體阻斷劑布他沙明所阻斷，其機制可能與上調β₂腎上腺素受體從而促進eNOS表達，進而使NO含量升高有關。

[關鍵詞]冰片； 梓醇； 葛根素； 血腦屏障通透性；β₂受體； eNOS； NO

[Abstract]Previous studies showed that borneol could promote some drugs crossing through the blood-brain-barrier （BBB） at certain conditions. However， the mechanism has not been clarified yet. This study aimed to investigate the effect of bornrol on promoting catalpol and puerarin through BBB and explore the relevant mechanism. The focal cerebral ischemic rats were divided into 7 groups randomly and then were administered corresponding drugs： model group （M， solvent）， catalpol-puerarin group （ZG， catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1）， catalpol-puerarin-bornrol group（ZGB， catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）， catalpol-bornrol group（ZB， catalpol 45 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）， puerarin-bornrol group（GB， puerarin 200 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）， butoxamine-ZG group（BTX+ZG， butoxamine 1.5 mg·kg^-1+ catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1）， and butoxamine-ZGB group（BTX+ZGB， butoxamine 1.5 mg·kg^-1+ catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）. Another 10 sham-operated rats were set as control （S）. Ten minutes after the administration， the cerebrospinal fluid was taken to test the content of catalpol and puerarin， and the brain tissue was taken to test the expression ofβ₂-adrenergic receptor， eNOS， and NO. Compared with the M group， the ZG group showed content of catalpol is 26.673 μg·L^-1 and the content of puerarin is below the detection limit；the expression levels ofβ₂-adrenergic receptor， eNOS and the contents of NO in brain tissue are no significant difference. Compared with the ZG group， the ZGB， ZB and GB groups showed significantly increased content of catalpol andpuerarin， as well as the expression ofβ₂-adrenergic receptor， eNOS and NO in the brain tissue （P<0.05）. The content of catalpol in BTX+ZG group changed non-significantly. Compared with the ZGB group， the BTX+ZGB group presented significantly decreased content of catalpol and puerarin and reduced expression of eNOS and NO in the brain tissue （P<0.05）.The results demonstrated that borneol could dramatically promote catalpol and puerarin crossing through BBB in the focal cerebral ischemic rats. Moreover， the effect may be related to the up-regulation ofβ₂-adrenergic receptor and the increasing expression of eNOS and NO.

[Key words]bornrol； catalpol； puerarin； blood-brain barrier；β₂-adrenergic receptor； eNOS； NO

doi：10.4268/cjcmm20162117

冰片（1，7，7-三甲基-二環庚-2-醇）系龍腦香科植物龍腦香Dryobalanops aromatica Caertn F.樹脂的加工品或菊科植物艾納香Blumea balsamiferaDC.葉提取的結晶，或以樟腦、松節油等為原料，經化學方法合成的精制品片^[1]，性味辛、苦， 微寒，歸心、脾、肺經，具有開竅醒神、清熱止痛的功效^[2]。現代藥理學研究發現冰片具有抗炎^[3]、抗菌^[4]、鎮痛^[5]作用，并能增加血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的通透性，促進砷劑^[6]、慶大霉素^[7]等藥物在腦中的轉運從而提高藥物生物利用度等，但對其機制的研究不多。

本實驗以前期研究顯示抗腦缺血有效^[8-11]的梓醇、葛根素為載體，觀察冰片是否能提高腦缺血模型大鼠腦脊液中梓醇、葛根素的含量，從而從醫學生物學作用角度驗證冰片“通竅引經”及“佐使有功”的傳統功效記載。同時，檢測腦組織中β₂受體，eNOS，NO水平，并觀察β₂受體阻斷劑對冰片的作用是否有阻斷效應，以探求冰片“通竅引經”的生物學作用機制。

1 材料

賽龍100A高頻電刀（北京市亞可康達醫療科技有限公司）；130型雙極電凝鑷（武漢麥朗醫療科技有限公司）；68001立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；SHH-150L生化培養箱（重慶永生試驗儀器廠）；5417R臺式高速離心機（德國Eppendorf生命科學有限公司）；ELX800酶標儀（美國BioTek儀器有限公司）；化學發光成像分析系統（上海天能科技有限公司）。

SPF級雄性SD大鼠120只，體重（200±25） g，購于重慶市中藥研究院實驗動物研究所，動物許可證號SCXD（渝）2012-0006，實驗動物質量合格證號0003223，飼養于西南大學藥學院SPF級實驗動物中心，使用許可證號SYXK（渝）2014-0002。適應性喂養1周后進入實驗，對大鼠進行篩選，去掉體重過輕、過重、行運遲緩及反應遲鈍的動物。實驗過程中善待實驗動物，嚴格遵守實驗動物科學與管理的有關規定。

冰片（重慶市和平藥房，經西南大學齊紅藝教授鑒定為龍腦香科植物龍腦香D.aromatica的精制品片，純度99.4%）；梓醇（安徽康輝藥業，純度99.8%）；葛根素（四川玉鑫藥業，純度100%）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；β₂-AR抗體（0.2 mL/支，AD123114），一氧化氮合成酶-3（內皮型）抗體（0.2 mL/支，L8081801）均購于北京博奧森生物技術有限公司；Griess reagent（10 g/瓶，SLBC6343V），β₂受體阻斷劑布他沙明鹽酸鹽（butoxamine hydrochloride）（50 mg/瓶，MKBR6952V）均購于Sigma-Aldrich。

2 方法

2.1 主要藥物溶液的配制

以47.5%乙醇溶液為溶劑，分別將冰片、梓醇、葛根素配制成藥物溶液，其中冰片200 mg·kg^-1、葛根素200 mg·kg^-1、梓醇45 mg·kg^-1；布他沙明（Butoxamine，BTX）配成生理鹽水溶液（1.5 mg·kg^-1）備用。

2.2 動物造模

取SD大鼠120只，參考文獻資料采用改良Tamura法制備大鼠局灶性腦缺血模型^[12-13]。大鼠3.5%水合氯醛麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上。剪毛消毒，沿右側頂顳嵴切開大鼠頭皮，切口約2 cm，鈍性分離顳肌，充分暴露顳窩。用顱骨鉆在鱗狀骨前部打孔至有凹陷即可，使用小手術鉗向前下方擴大骨窗，注意不要破壞硬腦膜。在大腦皮層表面，約在左眼和右耳的連線上，可以看到向上行走的大腦中動脈。使用玻璃分針輕輕上抬大腦，使大腦中動脈暴露更加充分。用雙極電凝鑷對大腦中動脈進行凝斷（電凝強度為2，凝閉時間為2～3 s）。完成后傷口用青霉素處理，分別縫合肌肉和皮膚。

2.3 神經功能評分及分組

術后5 d后采用改良神經功能缺損評分 （modified neurological severity scores，mNSS）對造模大鼠進行功能評分^[14-15]。mNSS評分包括運動、感覺、反射和平衡木4項測試，神經功能記分在0～18分 （0分為正常，最大神經功能缺損為18分）。評分在5分及5分以上分數的造模大鼠判定為造模成功。行為學檢查方法：由一個對試驗實施過程不了解的觀察者對大鼠進行行為學評測，評測續貫進行。如果大鼠在一次評測中出現恰當的行為，而以后卻未出現，按前者記分。將造模成功的大鼠隨機分為7組，模型組（M組）、梓葛組（ZG組）、梓葛冰組（ZGB組）、梓冰組（ZB組）、葛冰組（GB組）、β₂受體阻斷劑+梓葛組（BTX+ZG組）、β₂受體阻斷劑+梓葛冰組（BTX+ZGB組），每組10只大鼠，經用藥前統計學檢驗各組間評分無顯著性差異后給藥。以僅暴露大腦中動脈，但不凝斷的大鼠10只作為假手術組（S組）。

2.4 動物給藥及取材

除假手術組及模型組外，其余各組模型大鼠分別灌胃給予相應藥物及劑量，灌服藥物體積為0.01 mL·g^-1，β₂受體阻斷劑布他沙明腹腔注射30 min后再給藥，劑量為1.5 mg·kg-1[16-17]。隨后用3.5%水合氯醛麻醉大鼠，給藥10 min后采集腦脊液（前期預實驗結果表明，大鼠灌胃后10 min冰片開始出現促透作用）：用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口（1.5 cm左右），在其中點向尾側沿皮下剪開2 cm，將皮分離兩側，擴大視野。緊貼大鼠頭骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側擴大視野。接近頸后黃韌帶時，小心地分離附蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用微量進樣器水平刺入蛛網膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液放置在離心管中，-80 ℃保存。斷頭取大鼠缺血側皮層腦組織，按每約100 mg組織加入700 μL裂解液于冰上研磨，于低溫高速離心機中12 000 r·min^-1離心30 min，取上清液，-20 ℃保存。

2.5 UPLC-MS/MS檢測梓醇、葛根素含量^[18-19]

2.5.1 色譜條件 I-Class色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相10 mmol·L^-1甲酸胺水溶液-乙腈，梯度洗脫，洗脫條件見表1。

2.5.2 質譜條件 毛細管電壓2.7 kV，脫溶劑氣流速700 L·h^-1，錐氣流速50 L·h^-1， ESI正離子模式。質譜條件見表2。

2.6 Western blot法測定缺血側皮層腦組織中β2受體、eNOS含量

采用BCA法測定樣品蛋白含量，計算得到每孔總蛋白上樣量為50 μg。樣品蛋白加入Loading Buffer后渦旋混勻，用PCR儀進行蛋白處理（95 ℃，5 min）；再配制5%濃積膠和10%分離膠，經上樣、電泳、轉膜、切膜后條帶用TBST配制的5% BSA 4 ℃封閉過夜，繼而進行一抗孵育[37 ℃，90 min；兔抗eNOS（1∶300）、兔抗β2-AR（1∶300）]；TBST清洗條帶后二抗孵育[室溫、90 min；小鼠抗GAPDH（1∶5 000）]；最后得到的蛋白表達條帶用TBST洗后采用化學發光成像分析系統顯影并進行圖像分析。

2.7 Griess法檢測腦組織NO表達

按試劑盒說明操作，檢測NO表達。取一塊96孔板，依次加入S組、M組、ZG組、ZGB組、ZB組、GB模型組、BTX+ZG組、BTX+ZGB組樣品液100 μL，各孔再分別加入Griess reagent 100 μL，室溫反應15 min后用酶標儀檢測吸光度，檢測波長為490 nm。以吸光度大小衡量NO表達。

2.8 統計處理方法

試驗數據用SPSS 17.0軟件進行分析，GraphPad Prism 5.0作圖，統計結果以±s表示。

3 結果

3.1 模型成功判定結果及分組差異性檢驗

造模后大鼠精神萎靡，飲水、攝食狀況差，部分大鼠在造模后死亡。進行局灶性腦缺血造模的大鼠共120只，術中及術后死亡共16只，術后蘇醒進入存活率觀察的大鼠共104只。造模5 d后，除假手術組外，各組造模大鼠神經功能評分在5分以上者76只，造模成功率為63.3%。去除造模后飲水、攝食狀況差所致的體重過輕、健康狀況過差的大鼠6只，按照隨機表將70只造模成功的大鼠分成7組，每組10只，各組大鼠神經功能得分均值均在5分以上，與假手術組對照具有顯著差異（P<0.05），顯示造模成功。除假手術組外，經單因素方差分析，給藥前各組的神經功能評分均無顯著性差異，見表3。

3.2 冰片顯著升高局灶性腦缺血模型大鼠腦脊液中梓醇、葛根素含量

給藥10 min后，ZG組大鼠腦脊液中梓醇質量分數為（26.673±0.936） μg·L^-1、葛根素含量在檢測限以下，無法檢出；與ZG組相比，在合用冰片后，ZGB組腦脊液中梓醇質量分數為（43.087±7.637） μg·L^-1，葛根素質量分數為（75.554±3.555） μg·L^-1；ZB組腦脊液中梓醇質量分數為（40.652±1.900） μg·L^-1；GB組腦脊液中葛根素質量分數為（72.049±2.074） μg·L^-1，ZGB組、ZB組、GB組腦脊液中梓醇或葛根素含量都顯著增加（P<0.05），顯示冰片能顯著促進梓醇、葛根素透過局灶性腦缺血大鼠血腦屏障，見表4。

3.3β₂受體阻斷劑顯著抑制冰片對梓醇、葛根素的促透作用

在給藥前30 min用布他沙明預處理之后，與ZG組相比，BTX+ZG組腦脊液中梓醇和葛根素含量無顯著變化；與ZGB組相比，BTX+ZGB組腦脊液中梓醇和葛根素質量分數分別為（32.826±1.813），（47.820±2.574）μg·L^-1，均顯著降低（P<0.05），說明阻斷β₂腎上腺素受體能顯著降低冰片對梓醇、葛根素的促透作用，見表4。

3.4 冰片配伍梓醇、葛根素后顯著促進局灶性腦缺血模型大鼠腦內eNOS表達與NO含量升高

與假手術組相比，模型組大鼠eNOS表達量無顯著變化，NO含量顯著提高（P<0.05）；與模型組相比，ZG組eNOS表達和NO含量無顯著變化；而與ZG組相比，ZGB組、ZB組和GB組eNOS表達和NO含量都顯著升高（P<0.05），說明冰片配伍梓醇、葛根素后能顯著促進腦內eNOS與NO的水平，見圖1，2。

3.5 β₂受體阻斷劑顯著抑制冰片配伍梓醇、葛根素后上調eNOS表達和NO含量作用

與ZG組相比，BTX+ZG組eNOS表達和NO含量均沒有顯著變化，說明在沒有合用冰片條件下β₂受體阻斷劑布他沙明對eNOS表達和NO含量沒有影響；但是與ZGB組相比，給藥前30 min用β₂受體阻斷劑布他沙明預處理之后，BTX+ZGB組的eNOS表達量顯著下降（P<0.01）、NO含量顯著降低（P<0.05），說明β₂受體阻斷劑能抑制冰片對eNOS表達和NO含量的促進作用，見圖1，2。

3.6 冰片配伍梓醇、葛根素后顯著上調局灶性腦缺血模型大鼠腦內β₂受體表達

與假手術組相比，模型組β₂受體表達無顯著變化；與模型組相比，ZG組β₂受體表達無顯著變化；與ZG組相比，ZGB組β₂受體表達量極顯著上升（P<0.01），同時ZB組、GB組β₂受體表達量也顯著上升（P<0.05），說明冰片配伍梓醇、葛根素后能顯著上調局灶性腦缺血模型大鼠腦內β₂受體表達，見圖3。

4 討論

4.1 冰片“通竅引經”功效的生物學作用驗證

冰片引藥上行的作用自古就有記載。《本草綱目》稱其能“通諸竅、散郁火”， 而《本草衍義》總結出的其作用特點“獨行則勢弱， 佐使則有功”。后世冰片多作為中醫方劑配伍之佐使藥， 以引經直達病所^[20]。曾有研究表明，冰片內服后可經胃腸道迅速吸收，5 min后即可通過血腦屏障進入腦組織，說明能夠快速打開血腦屏障^[21-22]。本實驗通過配伍研究發現，在給藥10 min后，配伍了冰片的給藥組比單純使用梓醇或葛根素的組別腦脊液中梓醇或葛根素的含量均顯著提高，說明冰片能夠顯著促進梓醇和葛根素透過血腦屏障。這一實驗結果從生物學作用的角度，印證了冰片“通竅引經”及“佐使有功”的傳統功效記載。

4.2 eNOS來源的NO具有血腦屏障保護作用

NO是血腦屏障通透性的重要調節分子，由nNOS，eNOS，iNOS 3種一氧化氮合成酶催化合成。在腦缺血的發展過程中，不同細胞中不同類型的酶催化合成的NO及其量的多少、氧化或還原狀態不同則會產生不同的生物學作用。腦缺血發生后，nNOS產生的NO介導早期谷氨酸興奮毒性并導致缺血初期的神經損傷^[23-25]。亞急性期之后，iNOS在有充足底物和協同因子的條件下可持續由神經元、星形膠質細胞、內皮細胞等組織細胞大量表達^[26-27]，并由其主要介導病理性損傷過程，產生過量NO，導致遲發性神經損傷和促使微血管通透性增加誘發腦水腫，通過級聯反應促進半暗帶區進展為梗塞灶^[28-32]。有研究使用同源重組技術發現，nNOS及iNOS基因敲除小鼠在腦缺血后的梗死灶減小，證實nNOS和iNOS在腦缺血后的表達具有毒性作用^[33-34]，使用nNOS和iNOS阻斷劑可以分別減少腦缺血早期或晚期所誘導的神經毒性和組織損傷^{[23-25，35-37]}；而eNOS基因缺陷小鼠在腦缺血后的梗死灶較野生型大， 提示eNOS源性NO在腦缺血中具有保護性作用^[38]。但eNOS主要通過擴張血管、抑制血小板聚集、減少白細胞黏附增強側支循環而改善缺血后腦血流的神經保護作用很快就會被iNOS介導的毒性作用所取代^[38-39]。所以抑制iNOS的表達或促進eNOS的表達是腦缺血的一種良好治療策略。

4.3 冰片通過升高eNOS表達增加NO的含量

本研究結果顯示，模型組大鼠腦組織中NO含量相比假手術組顯著升高，可能與病理條件下iNOS表達上調從而生成NO增多有關；與梓醇+葛根素組相比，梓醇+葛根素+冰片組eNOS表達和NO含量進一步上升，提示冰片可進一步促進eNOS的表達，從而促使eNOS源性的NO增多，對血腦屏障的開放增強。并且有研究顯示，冰片能夠抑制iNOS的表達及其活性，減少iNOS源性的NO過度產生^[40-42]；將iNOS源性NO導致血腦屏障損傷性病理性開放轉變為eNOS源性的NO對血腦屏障可逆性生理性的開放。冰片的這種血腦屏障促透作用與病理性血腦屏障擴張不同，不會損傷或加重血腦屏障損傷，具有顯著的腦和血腦屏障保護作用^[40，42-44]。

4.4 冰片通過上調β₂腎上腺素受體升高eNOS表達

曾有研究顯示，通過介導β₂受體能促進eNOS表達^[45-48]，并使其磷酸化水平增強^[49]，且這種作用能夠被β₂受體阻斷劑所抑制^[50]。這引起了作者思考：冰片能否通過介導β₂腎上腺素受體上調eNOS表達、增加NO含量進而促進血腦屏障開放。本研究結果首次證實，冰片能顯著上調局灶性腦缺血模型大鼠腦內β₂受體表達；在使用β₂受體阻斷劑布他沙明預處理后，eNOS表達和NO含量比未予阻斷組顯著減少，腦脊液中梓醇和葛根素含量也顯著降低，說明通過阻斷β₂受體能顯著抑制冰片對eNOS表達和NO含量的上調作用，進而抑制冰片對血腦屏障的開放作用。這提示冰片可能通過上調β₂腎上腺素受體進而上調eNOS表達和增加NO含量，促進血腦屏障的開放。這一實驗結果為冰片“通竅引經”的傳統功效提供了生物學作用信號通路的依據。但是冰片對β₂腎上腺素受體的調控是如何具體實現的，有待進一步深入研究。

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[責任編輯 陳玲]