松針提取物α—蒎烯對肝癌HepG2細胞miR—221及其下游靶基因表達的影響

楊杰波+李明+謝菁菁+楊夢蝶+盧昕爍+王芳+陳偉強

[摘要]為探討松針提取物α-蒎烯的抗肝癌作用及機制，該實驗首先使用流式細胞技術檢測α-蒎烯對HepG2細胞周期的影響，然后選取與G₂/M期調控相關的miR-221，采用熒光定量PCR技術檢測α-蒎烯干預對其表達的影響，同時通過TargetScan等在線生物信息學軟件分析miR-221的靶基因，最后對相關靶基因的表達用定量PCR進行檢測。結果顯示，α-蒎烯呈劑量依賴性抑制HepG2細胞增殖，可阻滯細胞于G₂/M期（P<0.05），顯著下調HepG2細胞內miR-221的表達（P<0.05），生物信息學分析顯示CDKN1B/P27和CDKN1C/P57可能是miR-221的下游靶基因，熒光定量PCR顯示α-蒎烯處理后二者的表達顯著上調（P<0.001，P<0.05）。上述結果表明，α-蒎烯可能通過阻滯細胞周期于G₂/M期從而發揮抗肝癌作用，其對G₂/M期的調控可能與下調miR-221表達和上調其靶基因CDKN1B/P27和CDKN1C/P57的表達有關。

[關鍵詞]α-蒎烯； G₂/M期； miR-221

[Abstract]To investigate the anti-hepatoma mechanism ofα-pinene， HepG2 cell was treated withα-pinene and the change of cell cycle was examined by flow cytometry. The expression of miR-221， which was related the regulation of G₂/M phase， was detected by quantitative Real-time PCR. Meanwhile， TargetScan and other online bioinformatics methods were used to analyze and predict the target genes of miR-221， then the expression level of related target genes were detected by quantitative Real-time PCR. The results showed thatα-pinene inhibited the proliferation of HepG2 cells in dose-dependent manner. It was also proved that HepG2 cells were arrested at G₂/M phase byα-pinene （P<0.05）. The expression of miR-221 was down-regulated inα-pinene treated HepG2 cell. The bioinformatics analysis showed that CDKN1B/P27 and CDKN1C/P57 may be the protential targets of miR-221 and both of them were significantly up-regulated（P<0.001，P<0.05）byα-pinene treatment. According to these results， it was believed thatα-pinene may inhibit the proliferation of hepatocellular carcinoma cells through arrest the cell at G₂/M phase， which may be associated with the down-regulate of the miR-221 expression and up-regulate of the CDKN1B/P27 and CDKN1C/P57 expression.

[Key words]α-pinene； G₂/M phase； miR-221

doi：10.4268/cjcmm20162118

肝癌是影響人類健康的重大疾病，其治療一直是研究關注的焦點和難點。中醫認為腫瘤本質是惡毒，常用具有活血、解毒功效的藥物防治腫瘤^[1]。松針（pine needle）為松科松屬植物的葉，在《本草綱目》中記載其“無毒，入肝、腎諸經，治各臟腫毒，強健肝、腎”，筆者據此推測其可能對肝癌具有治療作用，并在前期實驗中證實該假說^[2]。本課題組進一步從松針中分離得到了松針主要成分α-蒎烯，并證實α-蒎烯在體內具有一定的抗肝癌作用，可能是松針抗肝癌的主要活性成分^[3]。α-蒎烯屬于雙環單萜類化合物，具有碳碳雙鍵和碳環結構，豐富的化學結構使α-蒎烯能發生異構化、氧化、氫化、加成、酯化、聚合等一系列化學反應，深入研究α-蒎烯抗肝癌的作用機制是其開發利用的關鍵，因此本實驗采用體外細胞實驗來觀察α-蒎烯對人肝癌HepG2細胞細胞周期的影響，并根據結果利用定量PCR和生物信息學等方法，從分子水平進一步研究了α-蒎烯對G₂/M期相關miR-221及其下游靶基因表達的影響，為進一步闡明α-蒎烯抗肝癌機制提供研究基礎。

1 材料

AvantiTM J25 低速離心機（美國Beckman公司）；MCO-175 CO₂孵箱（日本SANYO公司）； MS 800顯微鏡（日本Olympus公司）；MJ Mini PCR 儀（美國Bio-Rad公司）；CFX96TM實時定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；ELx800酶標儀（美國BioTek公司）；BD Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）。

胎牛血清，DMEM培養基，胰酶（美國Hyclone公司）；碘化丙啶（美國Amresco公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，美國Sigma 公司）；Trizol試劑（美國Life Technologies公司）；Prime ScriptTM RT reagent kit 試劑盒，SYBR Premix ExTaqTM Ⅱ（日本TaKaRa公司）；蛋白核酸檢測儀 NanoDrop 2000 （美國Thermo公司）；（+）-α-蒎烯（純度98%，美國Sigma公司）；miR-221 引物Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set，U6 內參引物U6 snRNA qRT-PCR Primer Set（廣州市銳博生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

人肝癌細胞株HepG2細胞購自武漢大學典型培養物冷藏中心，用含10%胎牛血清、1%青鏈雙抗的DMEM培養基，在37 ℃，5% CO₂培養箱中進行培養傳代，取對數生長期的細胞用于試驗。

2.2 細胞周期分析

HepG2細胞3×105個/孔接種到6孔板中，待細胞貼壁后更換新鮮培養液，設置對照組和不同濃度α-蒎烯處理組（使α-蒎烯終濃度分別為16，32，64 μmol·L^-1），24 h后收獲細胞采用碘化丙啶染色法進行細胞周期分析，主要步驟如下：收集細胞用70%乙醇4 ℃固定過夜后重懸于50 mg·L^-1碘化丙啶0.5 mL中，避光室溫保存30 min，用流式細胞儀分析細胞DNA含量，分析G1，S，G₂/M期細胞百分率。

2.3 RNA提取

HepG2細胞同上方法處理，設置對照組和α-蒎烯處理組（終濃度為64 μmol·L^-1），細胞干預24 h后提取總RNA。主要步驟如下：吸掉培養基，PBS洗2次，加入1 mL Trizol，室溫靜置5 min后轉移到EP管中。每管中加入0.2 mL氯仿，劇烈振搖15 s，室溫靜置3 min后于4 ℃，12 000×g離心15 min。吸取上清轉移到新的EP管中，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min后4 ℃，12 000×g 離心10 min。棄上清，加入75%乙醇1 mL，輕柔混勻后于4 ℃，7 500×g 離心5 min。棄上清室溫干燥后加入20 μL無RNA酶雙蒸水，混勻后取1 μL于核酸蛋白儀上檢測RNA濃度和純度。樣品保存于-80 ℃備用，用于后繼定量PCR試驗。

2.4 實時定量PCR檢測miR-221表達變化

2.4.1 cDNA的合成 先在EP管中加入RNA 2 μg和500 nmol·L^-1RT引物工作液，70 ℃孵育10 min，4 ℃孵育2 min，再加入5×PrimeScript Buffer 4 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μL和RNase Free dH₂O，使終體積為20 μL， 42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育10 min，得到cDNA。

2.4.2 實時定量PCR擴增 于8連管中依次加入SYBR Green Mix 10 μL，RT產物2 μL，Bulge-Loopulge-LoopTM miRNA Forward Primer（5 μmol·L^-1） 和Reverse Primer（5 μmol·L^-1）各 0.5 μL，RNase-free H₂O 7 μL，混勻于Bio-Rad CFX96 實時定量PCR儀上擴增，程序為95 ℃10 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，40個循環。運用Bio-Rad CFX Manager軟件分析結果，目的基因表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

2.5 實時定量PCR檢測CDKN1B/P27和CDKN1C/P57表達變化

2.5.1 cDNA的合成 取無菌無酶200 μL EP管放在冰上，按TaKaRa公司Prime ScriptTM RT reagent kit 試劑盒說明書依次加入RNA 1 μg，5×PrimeScript Buffer 4 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL和50 μmol·L^-1 Oligo dT Primer 1 μL，最后加入RNase Free dH₂O至20 μL。混勻后置PCR儀上37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

2.5.2 引物設計 根據Genebank上相關mRNA序列，采用Primer Express 310 軟件設計引物，并用BLAST檢測其同源性。引物由北京六合華大基因科技有限公式合成。引物序列見表1。

2.5.3 實時定量PCR 擴增程序 按照SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說明書加入樣品，混勻后同上方法進行擴增和數據分析，目的基因的表達量采用2-ΔΔCt法進行計算。

2.6 統計方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件進行分析，以單因素方差分析比較組間差異。檢驗水準為0.05。

3 結果

3.1α-蒎烯對HepG2細胞細胞周期的影響

不同濃度α-蒎烯處理HepG2細胞24 h 后，使用流式細胞儀分析細胞周期分布，可見各實驗組G₂/M期細胞數量明顯增加，與空白組對比均有統計學意義（P<0.05），見表2，說明α-蒎烯可以抑制HepG2細胞的增值，使其阻滯于G₂/M期。

3.2α-蒎烯對HepG2細胞miR-221表達的影響

由于α-蒎烯干預后細胞主要阻滯于G₂/M期，且隨濃度增高而增高，因此本實驗進一步以64 μmol·L^-1的α-蒎烯干預HepG2細胞，觀察G₂/M期相關miR-221的表達變化。結果顯示64 μmol·L^-1α-蒎烯處理HepG2 24 h后，給藥組 miR-221的表達水平（0.53±0.12）遠低于空白組（1.00±0.08），二者差異顯著（P<0.05），說明α-蒎烯阻滯HepG2細胞于G₂/M期與調控miR-221的表達相關。

3.3 miR-221下游靶基因的生物信息學預測

miRNAs通過調節下游靶基因來發揮其調控作用。本實驗采用miRbase和TargetScan在線生物信息學軟件對miR-221的靶基因進行預測，結果顯示細胞G₂/M期調節蛋白CDKN1B/P27，CDKN1C/P57的非編碼區可與miR-221結合，提示二者可能作為miR-221的下游靶基因受其調節，見圖1。

3.4α-蒎烯對CDKN1B/P27和CDKN1C/P57表達的影響

64 μmol·L^-1α-蒎烯處理HepG2細胞 24 h后，CDKN1B/P27及CDKN1C/P57表達均明顯增高，與空白組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.001），見表3。

4 討論

近年來肝癌在全球尤其是我國的發病率呈上升趨勢，統計顯示我國肝癌發病率和死亡人數均居世界首位。雖然肝癌的外科治療已經取得長足的進步，但是化療仍然是中晚期肝癌患者的主要治療手段之一，開發高效低毒的抗肝癌藥物具有很重要的應用價值和社會意義。中藥具有療效獨特、毒副作用小等特點，因此從中藥中尋找具有抗肝癌作用的化合物，成為抗肝癌藥物開發和研究的熱點。本實驗根據松針“入肝經”、“治腫毒、腫皰”等中醫理論，認為松針有可能具有抗肝癌作用。前期的研究發現松針油在體外能顯著抑制肝癌細胞增殖，初步證實了筆者的科研假說。本課題組還發現α-蒎烯是松針油的主要藥效成分，其在體內也能明顯的抑制腫瘤的生長。因此，深入探討并闡明其作用機制成為松針油及α-蒎烯進一步研究的重點。

細胞周期調控異常導致的細胞過度增殖是腫瘤發生的重要原因之一，阻滯或調控細胞分裂從而抑制癌細胞增殖是抗癌藥物的主要作用機制之一。本研究發現α-蒎烯作用后肝癌HepG2細胞被阻滯在G₂/M期，與本課題組前期在肝癌7402細胞株上得到的結果是一致的^[3]，說明阻礙肝癌細胞G₂/M期分裂可能是α-蒎烯作用的關鍵所在，也是深入研究其作用機制的突破點。

miRNAs是一類具有調控基因表達功能的非編碼RNA，其通過互補配對的方式導致靶mRNA降解或者阻遏靶mRNA翻譯，導致基因轉錄后沉默，從而影響細胞功能。miRNAs可以通過調控癌基因或抑癌基因的表達，影響腫瘤細胞的分裂、增殖、凋亡和轉移，因此對miRNAs的影響成為探索抗癌藥物作用機制的新方法和重要途徑^[4-5]。細胞周期調控是一個復雜的過程，目前已知有多個miRNAs和基因參與其中，其中miR-221是最關鍵的調節miRNAs之一^[6]。已有報道表明癌旁組織與良性肝組織相比，miR-221在肝癌組織中的表達升高^[7]，抑制miR-221的表達后，癌細胞的生長受到抑制，而增加miR-221的表達后則加速細胞的生長。在肝癌中高表達的miR-221也有可能是通過抑制細胞周期蛋白CDKN1B/P27，CDKN1C/P57的表達，從而促進肝癌繁殖^[8]，因此通過抑制miR-221的表達有可能是抑制腫瘤細胞生長的有效途徑之一。

CDKN1B/P27 基因作為一種細胞周期負調控因子，CDKN1B/P27表達減少，會導致細胞周期失調，DNA合成增強，細胞過度增殖。CDKN1C/P57也是細胞內一種十分重要的細胞周期調控因子，當細胞內CDKN1C/P57表達減少時會導致細胞異常增殖^[9]。由此可見，促進CDKN1B/P27，CDKN1C/P57表達可以有效抑制癌細胞的增殖。

本實驗證明，α-蒎烯可下調miR-221在細胞內的表達以及上調CDKN1B/P27和CDKN1C/P57的表達，達到抑制癌細胞增殖的效果。至于CDKN1B/P27和CDKN1C/P57是否為miR-221的直接靶標，尚需更深入的研究進行確證。

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[責任編輯 陳玲]