豬圓環病毒和大腸桿菌混合感染的診斷

豬圓環病毒和大腸桿菌混合感染的診斷

馬莉莉，常春龍，常敬偉，倪宏波＊
(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

黑龍江省大慶市某豬場暴發豬病，臨床主要表現豬體溫升高、腹瀉、日漸消瘦等癥狀。為了確診該豬場的發病原因，實驗室無菌提取病豬肺臟的DNA、RNA，經分離純化進行PCR檢測，同時進行細菌鑒定，生化試驗等，最終PCR擴增結果診斷為豬圓環病毒和大腸桿菌的混合感染。藥敏試驗結果分析表明該分離菌對畜炎寧(克拉維酸+阿莫西林注射液)、頭孢唑啉、阿米卡星和頭孢噻呋高度敏感，并給豬場提出了有效的防治措施，為豬場對該類疾病的防控提供了參考。

豬圓環病毒；大腸桿菌；混合感染；藥敏試驗

豬圓環病毒病（Porcine circovirus disease）是由豬圓環病毒引起的豬一種新的傳染病，其臨床診斷表現多種多樣，會造成免疫力降低，主要特征為體質下降、腹瀉及內臟器官等廣泛病理變化[1]，特別是腎臟、脾臟及全身淋巴結高度腫大、出血和壞死等。豬大腸桿菌病（Escherichia coli disease）是由病源性大腸桿菌引起的仔豬腸道傳染性疾病，以發生腸炎、腸毒血癥為特征。1～7日齡仔豬發生的一種急性、高度致死性的腸道傳染病[2]，臨床以灰白色稀便為主要特征，發病率高，死亡率低。該病一般發生于個別豬群，有時整群發病，以前多見于春秋季節，但現在的流行特點是沒有明顯的季節性。新生仔豬24 h內最易感染發病。一般出生后3 d左右發病，最遲不超過7 d。

1 發病情況

黑龍江省某豬場有200頭豬，其中保育豬90頭。2016年11月初該豬場部分保育豬突然體溫升高至42 ℃，經流行病學調查得知該豬場發病率20%，死亡率3%，發病豬被毛凌亂，行動緩慢，皮膚蒼白；表現為食欲廢絕，呼吸急促，體溫升高，消瘦；病豬也有咳嗽，黃疸，體表淋巴結腫大，貧血，逐漸消瘦衰竭死亡等臨床癥狀。

2 剖檢變化

病死豬耳根部、背部和股內側皮膚有紅色點狀和片狀紅斑，部分豬腹下、臀部皮膚出現不規則隆起丘疹，呈現出紫色狀。淋巴結呈化膿性病變，并且充血水腫；打開胸腔，見心包積液；肺表面腫脹壞死；胸膜炎、腹膜炎，心包膜內有大量炎性滲出物；肺呈彌散性、間質性肺炎變化；腎臟脾髓交界處出血，腎臟表面有出血點。腸道急性卡他性炎癥，胃膨脹，胃底黏膜潮紅；腸壁黏膜充血，水腫；腸腔有黃白色內容物。通過流行病學調查、臨床癥狀和病理剖檢變化初步懷疑為豬圓環病毒和大腸桿菌混合感染，需進一步通過實驗室方法確診。

3 實驗室診斷

3.1 細菌學檢測

無菌采取病死豬的肝臟、肺臟接種于血瓊脂培養基中，37 ℃培養24 h后挑取典型菌落接種于麥康凱培養基和伊紅美藍培養基37 ℃恒溫培養24 h，觀察菌落特征。結果為麥康凱培養基長出粉色，光滑，圓形菌落；在伊紅美藍培養基長出紫黑色，金屬光澤菌落，對其進行革蘭氏染色鏡檢，染為紅色菌落，可見兩端鈍圓，短小桿狀菌，革蘭氏染色為陰性（如圖4，圖5和圖6）。

3.2 藥敏試驗

圖1 四肢皮膚壞死

圖2 腎臟脾髓交界出血

圖3 肺臟腫大壞死

圖4 革蘭氏染色兩端鈍圓桿狀菌

圖5 麥康凱鑒別培養基

圖6 伊紅美藍鑒別培養基

在血平板上培養純化的單菌落，貼藥敏片于培養基進行37℃培養。結果表明該分離菌對畜炎寧、阿米卡星、頭孢唑啉和頭孢噻呋高度敏感；對強力霉素、慶大霉素和硫酸頭孢喹肟中敏；對氟苯尼考、恩諾沙星和林可霉素耐藥（表1）。

表1 藥敏試驗結果

3.3 生化鑒定

分離純化的菌進行生化試驗，過氧化氫酶、糖類發酵、硫化氫和尿素酶等試驗，結果能發酵糖類，產酸、產氣、不產生H2S，不分解尿素，符合大腸桿菌生化特性（表2）。

表2 生化試驗

3.4 PCR檢測

按照 TIANamp Virus DNA/RNA Kit病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取病毒的DNA和RNA，用豬瘟病毒、豬藍耳病毒、高致病性豬藍耳病毒、圓環病毒和偽狂犬病毒的特異性引物進行PCR反應擴增。引物參照GenBank發表的基因序列設計并合成（見表3）。結果顯示第4泳道在490 bp左右有一條帶，與圓環病毒片段相符，見圖7。綜合診斷可以確診該病例為豬圓環病毒和大腸桿菌混合感染。

4 討論

黑龍江省大慶市某豬場送檢的病豬通過實驗室診斷確診為豬圓環病毒和大腸桿菌混合感染。豬場曾接種相關疫苗，但抗體水平不足以抵抗病毒的侵襲，造成疫病流行，所以應制定合理的免疫程序，避免繼發感染[3]。隨著集約化、規模化養豬業的發展，豬場的疾病情況更加復雜。豬圓環病毒病屬于免疫抑制性疾病，一旦發病就會降低豬的免疫力，將給養豬場造成很大經濟損失，因此豬場必須建立健全衛生防疫制度，嚴格監督執行[4]。

表3 引物列表

圖7 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

1）對病豬進行隔離，無害化處理，搞好環境衛生，疫苗接種等綜合防治措施，避免病原入侵。及時治療發病豬，防止傳染給其他豬[5]。對豬舍通道設備等全面消毒，每3天消毒1次，盡量做到清除環境中潛在病原微生物，保證消毒效果。環境凈化，疫情嚴重威脅時，在多數豬場尚無多點生產體系情況下，育肥舍要單元式全進全出的管理[6]，每個豬舍用具、人員等要獨立，不可共用。2）制定合理的免疫保健程序，改善飼養管理，合理搭配日糧，改善空氣質量，降低氨氣和硫化氫的濃度[7]，減少環境帶來的應激，以及避免飼喂霉變飼料等，飼料要定期添加抗生素和維生素，增強機體的免疫力。3）制定免疫程序，合理制定計劃，根據當地相應感染毒株進行疫苗注射，合理定期進行抗體情況的監測[8]，保證豬群的健康水平；減少應激因素對仔豬的影響，病豬要進行對癥治療，選用黃芪多糖等[9]。總之，防治豬場病毒和細菌性的混合感染最主要就是做好消毒措施，并且調節動物機體的免疫功能，通過多方面的渠道最終才能達到抵抗病毒的入侵。

[1] 喬瑾，趙保生.規模化豬場生物安全控制技術研究[J].畜牧獸醫雜志，2011(4)：30-35.

[2] 丁淑燕，朱瑞良，高玲美.豬圓環病毒的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2004，31(3)：41-43.

[3] STEVENSON G W， KIUPEL M，MITTAL S K，et al. Ultra structure of porcupine circovirus in persistently infected PK-15 cells [J]. Vet Pathol，1999，36(5)：368-378.

[4] 王麗峰，黨占國.當前豬病治療困難的原因及防控對策[J].畜牧與飼料科學，2011，32(8)：118-119.

[5] 林進秋，李沐華.豬圓環病毒2型和致病性沙門氏菌的混合感染[J].廣東畜牧獸醫科技，2005，30(6)：33-34.

[6] BURCH D. Cirovirus now for the good news[J]. Pigs international，2007(5)：15-17.

[7] 王永輝.規模化豬場管理中存在的問題及建議[J].今日畜牧獸醫，2011(4)：11-12.

[8] 康麗娟，張鳳玲，于德和，等.豬圓環病毒病Ⅱ型的診斷與防治[J].現代畜牧獸醫，2005(10)：27-28.

[9] 張家崢，李召展，劉小燕，等.豬圓環病的防制對策[J].獸醫導刊，2004(2)：11-13.

2016-11-18)

馬莉莉 (1992-) 女，黑龍江人，在讀碩士，研究方向為分子細菌學和免疫學

*通訊作者：倪宏波(1972-)男，黑龍江人，教授，博士生導師，主要從事分子細菌學和免疫學研究