補體C1q基因簇rs631090多態性與女性系統性紅斑狼瘡的相關性研究

裴 颯 宋繼權 彭瑋慧 歐運超

·論著·

補體C1q基因簇rs631090多態性與女性系統性紅斑狼瘡的相關性研究

裴 颯 宋繼權 彭瑋慧 歐運超

目的： 確定補體C1q基因簇單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)與中國女性人群系統性紅斑狼瘡(SLE)的易感性。方法： 111例女性SLE患者及120名女性正常對照者。提取樣本基因組DNA后，經普通PCR擴增目的基因，采用二代測序分析C1q基因簇上三個位點(rs631090、rs292001、rs294223)的基因型及等位基因分布。在不同的遺傳模式下分析三個位點基因多態性與SLE的相關性。結果： 位點rs631090(C1qB)病例組與對照組基因型頻率和等位基因分布比較差異均具有統計學意義(P=0.034和P=0.008)。位點rs292001(C1qA)和rs294223(C1qB)的基因型頻率及等位基因分布結果在兩組間不具統計學差異(P值均大于0.05)。位點rs631090在顯性遺傳模型下CT/CC基因型在統計學上具有顯著保護性作用(OR=0.470，95%CI=0.268-0.823，P<0.05)。rs292001和rs294223在三種遺傳模型下分析均未發現相關性(P值均大于0.05)。結論： 在中國女性人群中rs631090位點SNPs與SLE相關，基因型CT/CC可能為女性SLE保護基因型。

系統性紅斑狼瘡； 補體； C1q； 單核苷酸基因多態性

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種典型的自身免疫性疾病，常伴自身抗體及補體系統的變化。其發病機制主要依賴基因、環境因素以及原發性和繼發性免疫系統的異常等因素。世界流行病學調查顯示其發病率為(7.4～159.4)/10萬人，而在發病人群中患SLE女性的數量遠超男性，至少為9∶1，且多見于育齡期女性。C1q是構成補體C1的重要成分，它通過協助溶解免疫復合物以及清除凋亡細胞碎片來發揮抗炎作用[1]。盡管目前關于C1q基因簇多態性與SLE之間關聯的研究很少，仍然有關于C1q缺陷導致SLE發病的病例報道[2]。近年來關于補體C1q基因簇多態性與SLE基因易感性的研究報道結果不盡相同。Clq基因簇由3個基因組成：ClqA、ClqB和ClqC，我們從111例女性SLE患者C1q基因簇上選取了三個位點：rs292001(C1qA)，rs631090(ClqB)和rs294223(ClqC)。通過基因測序分析確定其單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是否和SLE存在相關性。本次實驗采用了二代測序(next—generation sequencing，NGS)中最常用的illumina測序技術，該技術的核心是邊合成邊測序，通過捕捉新合成的末端標記來確定DNA的序列。二代測序較一代測序其測序通量有了很大提升，且費用更低、準確率更高、速度更快[3]。

1 對象與方法

1.1 對象 病例組為女性SLE患者111例，病例收集于武漢大學中南醫院與武漢大學人民醫院2015年5月至2016年5月間的門診及住院患者，平均年齡(37.02±14.76)歲。所有患者均符合1997美國風濕協會修訂的SLE診斷標準。對照組120名為正常體檢者，并自行檢測篩查排除SLE、干燥綜合征、類風濕關節炎、皮肌炎等自身免疫病，且一、二、三級親屬無SLE患者，平均年齡(42.2±15.75)歲。所有實驗組與對照組的受試者均無關聯。兩組年齡分布差異無統計學意義(P>0.05)。本次實驗通過了武漢大學中南醫院倫理委員會的批準，所有的實驗參與者均簽署了知情同意書。采集受試者外周靜脈血標本5 mL進行DNA提取和基因分型。

1.2 方法 (1)基因組DNA的提取:采集外周靜脈血保存于-20℃環境下；采用血液基因組DNA提取試劑盒法(天根生化科技公司，DP318；百泰克生物技術有限公司，DP6101)提取DNA，-20℃保存。(2)PCR擴增目的基因:用于PCR的引物如下：rs292001上游引物為5＇-GCAGACCAGAAGGATCACA-3＇下游引物為5＇-TGGGCAAGTGTCTCAACC-3＇；rs631090上游引物為5＇-TAGCCCAGTAAATGTTGAGG-3＇，下游引物為5＇-TGAACCCCATGACAACCC-3＇；rs294223上游引物為5＇-CTCGAGCAGAGAGAAAGACT-3＇，下游引物為5＇-CCTCTGAGAAATGGGGACA-3＇，由武漢達邦生物科技有限公司合成。擴增條件：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s,72℃延伸30 s，循環35次，末次72℃延伸5 min。將擴增的PCR產物于2%瓊脂糖上電泳，驗證擴增結果后由武漢達邦生物科技有限公司對PCR產物進行測序，一代測序驗證結果見圖1～3。

圖1 rs631090位點，樣品27(含C/T等位基因)的PCR產物測序結果

圖2 rs292001，樣品29(含A/G等位基因)的PCR產物測序結果

圖3 rs294223，樣品31(含A/G等位基因)的PCR產物測序結果

1.3 統計學方法 根據二代測序結果，利用直接計數法對基因型與等位基因頻率進行統計， Hardy-Weinberg(H-W)平衡檢驗，兩組之間基因型頻率及等位基因分布差異的比較利用軟件SPSS 16.0進行χ2檢驗。運用Logistic回歸模型控制年齡的影響，在不同的遺傳模式下(相加模型、顯性模型、隱性模型)分析基因多態性與SLE的相關性。OR值及95%的置信區間用來評估兩組基因型頻率及等位基因分布之間差異的影響。P<0.05(two-sided test)為有統計學差異。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對實驗組、對照組進行H-W平衡檢驗，三個位點在實驗及對照組的分布均符合H-W平衡(P>0.05)，表示本次實驗選取的樣本具有很好的代表性。

2.2 基因型頻率、等位基因分布及三種模型下Logistic回歸分析結果 rs292001、rs631090以及rs294223三個位點的基因型頻率及等位基因分布見表1，三種遺傳模型(相加模型、顯性模型、隱性模型)下對基因型相關性的分析見表2。由統計結果可知： rs631090位點的等位基因C和T分布在實驗組和對照組差異有統計學意義(P=0.008)，CC、CT、TT三種基因型在兩組間的差異具有統計學意義(P=0.034)。在顯性遺傳模型分析下，以TT基因型為參考，基因型CT/CC可能為SLE的保護型基因型，基因型TT有增加患SLE的風險(P=0.008，OR=0.047以及95%CI=0.268～0.823)。rs292001及rs294223的等位基因和基因型頻率在兩組間(實驗組與對照組)差異不具有統計學意義。上述兩個位點分別在相加模型、顯性模型、隱性模型下對基因型相關性進行分析，所示結果均無統計學意義。

表1 rs631090、rs292001和rs294223位點基因型及等位基因在病例組和對照組間的分布

表2 三個位點在三種遺傳模型下的分析結果

3 討論

補體激活可分為3條途徑：經典途徑、MBL途徑以及旁路途徑。C1q作為補體C1的一部分由18個多肽鏈構成即6A，6B和6C[4]，它是經典途徑(classical pathway,CP)的識別分子在CP的起始階段通過與免疫復合物、凋亡細胞、C反應蛋白等上面的配體結合來啟動補體經典激活途徑。

在SLE活動期，補體系統尤其是C3會沉積在各種器官的炎癥部位。補體缺陷可以促進SLE的發生、發展，遺傳性補體缺陷患者SLE的發病率高于正常人群[5]。目前已確證40多個與SLE易感相關的遺傳因素，其中就包括補體成分缺陷(C1q，C4，C2)。研究表明，補體活化經典途徑中的早期成分(C1q、C2、C4)的遺傳性純合子缺陷與SLE的發生發展及病情的嚴重程度有關。在SLE患者中，C1q自身抗體的產生可能會導致C1q缺陷。C1q自身抗體也是在SLE患者致病的免疫復合物中最先被發現。它被證實與狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)有關。而LN存在于30%～50%的狼瘡患者中。除ANA和dsDNA外，C1q、C3和C4以及C1q的抗體在血清中的濃度是診斷SLE很重要的免疫學指標，尤其是對于LN。在SLE中，C1q缺失可能是C1q基因缺陷所致抑或者是C1q自身抗體的產生。已被證實補體C1q和C1q抗體的濃度在活動期LN患者中會分別減少和升高。 C1q 除了參與SLE的發病，已有證實C1q在一定程度上與動脈粥樣硬化、糖尿病、類風濕關節炎、精神分裂癥以及衰老相關疾病如神經退行性病變、肌纖維化等相關[7-10]。Rafiq等研究歐洲人群中的23個位點認為，最有可能與SLE存在關聯的位點是rs294223(P=0.06)[1]。Martens等研究荷蘭北部的高加索人，103例靜止期SLE患者，經系譜不平衡檢驗(pedigree disequilibrium test,PTD)分析得rs631090與SLE存在明顯關聯(P=0.02)[11]；Radanova及其同事對保加利亞人群進行研究(38例LN患者和185名健康對照)，rs631090與LN無相關性[12]。Mosaad等人在130例埃及青少年SLE患者(juvenile SLE,jsSLE)中證明位點rs292001的SNPs與jsSLE存在明顯相關性，且C1q蛋白的血清水平在jSLE中明顯低于對照組，治療前后的對比結果顯示在LN和腎病活動期患者中可以觀察到C1q水平明顯回升[13]；同樣在土耳其人群中rs292001被證明SNPs與SLE存在基因易感性[1]。而且從Martens的研究中可知rs292001與重癥SLE存在關聯(Systemic Lupus Erythematosus International Collaborating Clinics (SLICC) damage index score>0;P=0.007)，但在波蘭SLE人群中并未呈現明顯關聯性[11]。在保加利亞人群中亦未證明rs292001SNPs與LN存在基因易感性[12]。以上研究結果不盡相同，推測可能與地域和種群差異、實驗技術以及樣本量等因素相關。我們的實驗中位點rs631090在病例組與對照組基因型頻率和等位基因分布比較，其差異均具有統計學意義(P=0.034和P=0.008)。位點rs292001和rs294223的基因型頻率及等位基因分布結果在兩組間不具統計學差異(P>0.05)。位點rs631090在顯性遺傳模型下CT/CC基因型在統計學上具有顯著保護性作用(OR=0.470，95%CI=0.268～0.823，P<0.05)。rs292001和rs294223在三種遺傳模型下分析均未發現相關性(P>0.05)。rs631090位點在兩組間基因型頻率及等位基因分布的比較結果表現出明顯差異，推測其SNPs與中國女性SLE的發病可能存在關聯。而rs292001和rs294223的SNPs與中國女性SLE之間不存在基因易感相關性。

本研究主要結論如下：初步探究了C1q基因簇多態性與SLE基因易感性的關系。結果提示rs631090的單核苷酸多態性與中國女性系統性紅斑狼瘡易感性相關。在中國女性SLE人群中TT基因型可能增加患SLE的風險，CC/CT基因型可能提供保護作用。這為以后的機制學研究提供了新的思路。因本實驗樣本量較小，地域范圍較窄，其結果有待更多的研究證實。

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(收稿：2016-08-25)

Association of rs631090 C1q gene cluster polymorphism with systemic lupus erythematosus among women population

PEISa,SONGJiquan,PENGWeihui,OUYunchao.

ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To investigate the association of C1q gene cluster polymorphisms with systemic lupus erythematosus (SLE) among Chinese women population. Methods: A case-control study including 111 SLE patients and 120 healthy individuals were designed. DNA of the subjects was extracted and amplified by polymerase chain reaction (PCR). The difference in frequencies of the three single nucleotide polymorphisms (SNPs) (rs631090, rs292001 and rs294223) alleles and the genotypes were further confirmed by the next-generation sequencing technology. Results: In rs631090 (C1qB), distributions of the genotypes or alleles between case and controls were significantly different (P=0.034 andP=0.008, respectively). The differences in the frequencies of the other two SNPs (rs292001 (C1qA) and rs294223 (C1qB)) alleles and genotype were statistically insignificant when the SLE patients were compared with controls in this study (all,P>0.05). Under dominant model, the CT/CC genotypes of rs631090 showed significant protective effect on SLE (OR=0.470, 95%CI=0.268-0.823,P<0.05). About rs294223 and rs292001, no association was detected using different genetic model (additive, dominant and recessive; all,P>0.05). Conclusion: Our findings indicate that the SNPs of rs631090 might be associated with the development of SLE among Chinese women population, and the genotype CT/CC of rs631090 may be the protective genotype for SLE.

systemic lupus erythematosus (SLE); complement; C1q; single nucleotide polymorphisms (SNPs)

湖北省自然科學基金(編號：2013CFB263)

武漢大學中南醫院皮膚科，湖北省武漢市，430071

宋繼權，E-mail: songjiq@126.com