代謝物生物傳感器：微生物細胞工廠構建中的合成生物學工具

周益康 吳亦楠 王天民 鄭翔 邢新會 張翀（清華大學化學工程系 教育部工業生物催化重點實驗室 清華大學合成與系統生物學研究中心，北京 100084）

代謝物生物傳感器：微生物細胞工廠構建中的合成生物學工具

周益康 吳亦楠 王天民 鄭翔 邢新會 張翀
（清華大學化學工程系 教育部工業生物催化重點實驗室 清華大學合成與系統生物學研究中心，北京 100084）

代謝物生物傳感器作為重要的合成生物學工具，能夠感應細胞內代謝物濃度的變化，轉化為特定信號輸出，在微生物細胞工廠的構建中顯現出巨大的應用潛力。其主要組成部分通常包括生物識別元件和信號輸出元件，前者來源于自然界中豐富的調控元件，如轉錄因子、核糖開關等，有著不同的響應機理，后者可以為熒光信號、生長優勢、特定代謝通路的開閉等，取決于應用所需。著重介紹了近年來代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠構建中的應用實例，主要包括目標化合物菌株的高通量篩選、選擇、胞內代謝動態調控和非遺傳異質性選擇，同時也著重討論了代謝物生物傳感器的性能對于應用的影響和在實際應用中可能面臨的機遇與挑戰。

代謝物生物傳感器；響應機理；響應性能；微生物細胞工廠

生物體內廣泛存在一類基因編碼的蛋白質或RNA元件（例如轉錄因子、核糖體開關），它們能夠響應細胞內特定代謝物效應物的濃度，通過改變自身結構調控下游基因元件特定信號的輸出。代謝物生物傳感器就是基于這一原理，通過特定的生物識別元件響應目標代謝物化合物，并將其轉化為目的輸出信號（如熒光、細胞的存活、特定代謝通路的開閉）［1］。

代謝物生物傳感器作為一種重要的合成生物學工具，可以視作微生物中的儀表，將代謝物濃度轉化為特定信號的輸出，因而能夠在線的感應細胞體內代謝物濃度及其變化，為代謝途徑設計及優化提供工具。近年來，研究者逐漸嘗試將代謝物生物傳感器應用到微生物細胞工廠的構建領域，由于其能在單細胞層次實現胞內代謝產物的濃度響應，在微生物細胞工廠的改造和優化中日益顯現出巨大的應用潛力。目前已經有相關綜述論述了代謝物生物傳感器的原理和應用［2-6］，本文將著重綜述近年來代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠構建中的應用實例及其存在的挑戰。

1 代謝物生物傳感器構建原理

代謝物生物傳感器的主要組成部分包括生物識別元件和信號輸出元件，前者能夠響應特定的代謝物造成自身結構變化，后者將響應元件結構變化信號轉化為目的輸出信號。自然界中存在豐富的響應機理不同的生物識別元件，其中轉錄因子（Transcription factors，TFs）和核糖開關是目前最常見的生物識別元件。

1.1 基于轉錄（激活、抑制）因子的代謝物生物傳感器

轉錄因子能夠結合在調控基因DNA的增強子或啟動子區域，獨自或與其它蛋白組成復合體，通過促進或阻止RNA聚合酶對于特定基因的結合，進而調控DNA到信使RNA的轉錄速率［7］。轉錄因子特異的與目標代謝物結合，發生別構作用，對基因的調控作用發生變化，如轉錄抑制因子結合代謝物后對RNA聚合酶的空間位阻效應消失。利用轉錄因子的這一特性，將目標代謝物濃度轉化為熒光蛋白、細胞存活等輸出信號，從而構建出響應目標代謝物的生物傳感器（圖1-A）。

轉錄因子在生物體內廣泛存在，以大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）為例，目前已經發現了超過230種轉錄因子，響應的代謝物包括糖類、糖磷酸、氨基酸和脂類等［8］。隨著生物信息學技術的發展，已經有一些調控相互作用和轉錄因子結合位點的數據庫，如Regulon DB、RegTransBase等。其中RegTransBase數據庫提供了原核生物轉錄因子，其結合位點以及小分子效應物的信息，涵蓋了875個效應物，1 488個轉錄因子，為轉錄因子的應用奠定了堅實的基礎。目前研究者利用天然轉錄因子，已開發了不同的生物傳感器，可以響應木糖［9］、1-丁醇［10］、支鏈氨基酸［11，12］、堿性氨基酸［8，13］、酪氨酸［14］、葡糖糖酸、柚皮素［15］以及乙酰輔酶A［16］、丙二酰輔酶A［17］、NADPH［18］等代謝物。

盡管天然存在的轉錄因子能夠響應許多不同種類的小分子代謝物，但是在實際應用中，目標代謝物往往不存在天然響應或者響應性能不理想的轉錄因子，通過工程化改造的手段能夠改變轉錄因子響應的特異性。例如，來自于E.coli的能夠天然響應L-阿拉伯糖的轉錄因子AraC已經被改造為能夠特異性響應D-阿拉伯糖［19］、甲羥戊酸［20］、三乙酸內酯（TAL）［21，22］和四氫嘧啶［23］，為基于轉錄因子的代謝物生物傳感器的應用提供了更多的潛力。此外，通過對傳感器元件的改造，還可實現傳感器的跨種屬應用。例如，來源于E.coli的甲羥戊酸傳感器通過改造已經成功應用于扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens，M. extorquens）AM1中，實現對甲羥戊酸的響應［24］。

1.2 基于核糖開關的代謝物生物傳感器

核糖開關是一類在mRNA的前導區中被發現的cis-編碼的調控RNAs，它們能夠在對應的效應物存在或不存在的情況下發生形變［25］。一般地，核糖開關通過在對應配體存在時，采用能夠誘導轉錄終止或者抑制翻譯起始結構構象，在對應配體不存在時，采用能夠使得轉錄延長或翻譯開始的替代構象來控制下游基因的表達［26］。利用這種機制，將下游基因設計為易于檢測的輸出信號，同樣能夠構建代謝物生物傳感器（圖1-B）。

目前為止，已經有至少19個不同的效應物-結合核糖開關種類被鑒定［27］，核糖開關能夠結合的效應物包括一些重要的代謝物，如葡糖-6-磷酸［28］、賴氨酸［29］和甘氨酸［30］，輔酶因子［31-35］如維生素B12，S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine，SAM）、硫胺素焦磷酸、黃素單核苷酸（Flavin mononucleotide，FMN），以及鎂離子［36］、氟離子［37］等。基于核糖開關的特性，許多研究組致力于發展基于核糖開關的代謝物生物傳感器［38-40］，例如通過將維生素B12的核糖開關與報告基因β-半乳糖苷酶，熒光素酶或者紅色熒光蛋白相結合，研究維生素B12的代謝轉運機理［41］。此外，還有基于適體酶核糖開關設計的代謝物生物傳感器［42］，適體酶能夠利用配體來控制錘頭狀核酶，進而控制mRNA轉錄的穩定性或翻譯的可行性。

盡管基于核糖開關的代謝物生物傳感器潛力巨大，但是在代謝工程中的應用仍舊受到限制［43］，主要原因是能夠響應目標代謝物的核酸適配體缺乏以及核酸適配體與驅動區域的連接研究不充分［5］。近年來隨著合成生物學的迅速發展，已經出現了一些能夠輔助設計核糖開關的工具［44］，將有可能極大促進基于核糖開關的代謝物生物傳感器在代謝工程中的應用。

圖1 代謝物生物傳感器響應機制

1.3 其他類型的代謝物生物傳感器

除了轉錄因子與核糖開關外，其他的能夠響應特定代謝物的生物識別元件也被應用于代謝物生物傳感器的設計。例如，壓力響應的啟動子［45-47］，核糖體干擾肽［48］，能夠發生熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的代謝物-感應蛋白［49，50］等。這些生物識別元件的挖掘將有力地推動代謝物生物傳感器在代謝工程中的應用。

2 代謝物生物傳感器的性能評價

代謝物生物傳感器的響應性能決定了其能否在微生物細胞工廠構建中實際發揮作用。其性能評價的主要依據是輸入輸出響應曲線（圖2），代謝物濃度與生物傳感器響應輸出（Arbitrary reporter units，AU）之間的關系刻畫了生物傳感器的轉換函數，提供了生物傳感器的性能信息，包括靈敏度（Sensitivity）、響應范圍、線性檢測范圍、檢測閾值等信息，為實際應用提供參考［51］。其中靈敏度表示響應曲線的斜率，描述了在兩個樣品輸入產物濃度之間的最小的可微變化。響應范圍表示代謝物生物傳感器輸出信號在最高上限和背景狀態之間的差異。線性檢測范圍表示代謝物濃度能夠與輸出表達信號線性相關聯的范圍。轉化函數表示代謝物生物傳感器輸入和輸出之間的數學關系。

圖2 代謝物生物傳感器響應曲線

代謝物生物傳感器響應效應物的靈敏度和特異性是其在應用過程中重點關注的性能，因而在實際應用中，需要首先測定生物傳感器的響應曲線，以確定其能否滿足應用需求。實際操作中，往往通過外源添加目標代謝物的方法來測定響應曲線，但是由于細胞膜具有選擇透過性，代謝物可能通過主動運輸進入細胞，使得胞內與胞外代謝物濃度并不一定線性相關，因而需要測定胞內代謝物的濃度。

3 代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠中的應用

代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠中典型的應用包括高產目標化合物菌株的高通量篩選和微生物胞內代謝動態調控（Dynamic control）等［5］。例如代謝物生物傳感器可以在單細胞水平上將代謝物化合物濃度轉化為熒光輸出或者細胞生長優勢，進而通過高通量的流式細胞儀（Fluorescence activated cell sorting，FACS）或者細胞優勢表型壓力選擇，實現對特定高產菌株的高通量篩選（Screen）或者選擇（Selection）。在代謝動態調控方面，利用人工構建的代謝物生物傳感器模擬微生物原有的精細調控體系，實現目的代謝途徑根據效應物的濃度動態開閉，可以幫助微生物體內的代謝流實時響應宿主細胞的代謝狀態或者宿主所處的外部環境的變化，使代謝網絡有更強的魯棒性和更高的生產效率。此外，近期有報道利用代謝物生物傳感器實現非遺傳細胞間異質性選擇（Nongenetic selection），提高代謝途徑的生物合成。

3.1 高通量篩選

生物體系的復雜性使得工程化改造菌株往往需要通過多輪設計-構造-檢驗循環（Design-Build-Test cycle，DBT循環）才能夠找到基因元件的最優組合。DBT循環的通量決定了菌株優化所需要的時間。近年來，隨著合成生物技術的發展，設計和構建的通量迅速提高，已經能夠構建庫容超過109的多樣性庫，但是目前檢驗的通量仍舊限制在102/d或103/d的水平，極大地限制了DBT循環的通量［52］。代謝物生物傳感器能夠在單細胞水平將效應物濃度轉化為熒光輸出，結合FACS技術（圖3-A），篩選的通量能夠達到109細胞/d，使得DBT循環的通量提高106倍。

代謝物傳感器在目的產物高通量篩選領域的應用最早報道于2012年，基于來源于谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum，C. glutamicum）的能夠響應精氨酸、組氨酸和賴氨酸的轉錄因子LysG，以及其對應的啟動子lysE，以黃色熒光蛋白（Yellow fluorescent protein，YFP）作為輸出信號，構建的代謝物生物傳感器被應用于在化學誘變微生物突變庫中篩選賴氨酸高產菌株［8］。這一傳感器隨后也被用于篩選合成途徑中酶的突變體，消除了原有的反饋抑制作用，提高了對應氨基酸的積累量［13］。另一個同樣來源于C. glutamicum的轉錄因子Lrp能夠響應包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸在內的支鏈氨基酸，也被應用于優化C. glutamicum中氨基酸的生產［11，12］。高通量篩選系統同樣可以應用于對酶的進化。基于酚類特異性響應的轉錄激活子DmpR在E.coli中構建的高通量篩選有機磷酸酯降解酶活性的篩選系統，在3輪突變和FACS篩選后，分離出了發生3個氨基酸替換的突變體MPH，kcat/Km提高100倍［53，54］。

代謝物生物傳感器結合高通量篩選的技術能夠輔助微生物調控網絡的工程化改造（Sensor-assisted transcriptional regulator engineering，SATRE）。本文作者團隊在M. extorquens AM1中成功應用這一策略，利用工程化改造后能夠響應甲羥戊酸的生物傳感器，結合FACS手段，實現了M. extorquens AM1中代謝流的再分配，將來源于甲醇的乙酰輔酶A更多的導向甲羥戊酸合成，使得其產量提高60%［24］。

來源于細菌的轉錄因子通過改造也能夠應用于真核細胞中，例如來源于細菌的響應木糖的轉錄因子XylR被改造為能夠在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）中響應木糖的基因元件［9］。研究者優化了多種來源的XylR抑制子和操縱子在報告基因上游區域的插入位點，利用優化后的生物傳感器進行木糖轉運蛋白的改造，將該蛋白的轉運效率提高了6.5倍。

除了可以應用目標化合物直接作為效應物應用于基因表達調控，目標化合物的前體或者指示劑也能夠作為效應物。還原反應是細胞代謝過程的核心，大約1/4的已知酶為氧化還原酶，其中大多數為NADPH依賴型［55］。在E.coli內能夠間接響應胞內NADPH/NADP+的比例的轉錄因子SoxR被應用于NADPH依賴的酶的高通量改造［16］。將色氨酸作為紫色桿菌素合成途徑中的重要節點，本文作者團隊開發了基于色氨酸新生肽tnaC的新型生物傳感器，利用正向熒光信號篩選色氨酸高產菌株，進一步利用負向熒光信號篩選消耗色氨酸的高效下游途徑，進而成功構建了從葡萄糖合成色氨酸及高產下游衍生物的E.coli工程菌［48］。來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）的特異性響應丙二酰輔酶A的轉錄因子FapR和操縱子fapO已經成為途徑工程中的重要工具，在E.coli［56，57］與S. cerevisiae［17］中都得到了成功應用。此外通過報告菌株將目標產物轉化為可檢測的信號的雙菌篩選系統為高通量檢測工業上全細胞催化菌株分泌代謝物的產量提供了可行性［58］。作為概念驗證，研究者利用E.coli將B. subtilis生產的維生素B2轉化為FMN，利用能夠特異性響應FMN的核糖開關調控輸出信號綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的表達，提高了在B. subtilis中維生素B2的合成。

通過人為設計條件，模擬自然進化的機制，使得不同基因型的菌株之間存在生長差異，使得具有生長優勢的突變體在培養過程中富集，進而得到理想表型的過程稱為選擇。若代謝物生物傳感器的輸出信號為與生長相關的基因，能夠實現代謝物產量與菌株生長優勢相關聯（圖3-B），實現通量1010細胞/輪的篩選。

2013年報道了在E.coli中開發的1-丁醇生物傳感器/生長選擇體系［10］。四環素外排泵TetA的表達受到來源于丁香假單胞菌（Pseudomonas butanovora，P. butanovora）特異性響應乙醇的轉錄因子BmoR調控，從而使的1-丁醇的產量與菌株在四環素中的生長情況相關聯。該體系應用于篩選丁醇合成途徑上游基因的RBS序列優化的突變體，成功提高了丁醇的產量。另一個成功的案例是2014年報道的結合多重自動基因工程（Multiplex genome engineering，MAGE）和代謝物生物傳感器進行定向進化。來源于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida，P. putida）的抑制蛋白TtgR在結合包含柚皮素在內的黃酮類化合物時產生去除抑制效果，利用該機制可構建柚皮素生物傳感器。研究者結合該生物傳感器，并利用TolC外膜孔蛋白作為選擇標記，實現在十二烷基硫酸鈉存在時正向篩選，在E.coli毒素E1存在時反向篩選［15］。在4輪MAGE靶向突變和篩選后，獲得了柚皮素產量提高36倍的菌株。相同的策略應用于葡萄糖二酸合成途徑中，基于特異性響應的轉錄因子CdaR，葡萄糖二酸的產量提高22倍。核糖開關同樣能夠應用于菌株進化。在E. coli 中，應用賴氨酸-OFF核糖開關將賴氨酸生產與菌株生長相關聯。在賴氨酸存在時，該核糖開關能夠抑制下游tetA基因的表達，而TetA對Ni2+敏感，使得在Ni2+存在時，高產賴氨酸的突變菌株具有生長優勢，進而產生富集［59］。

除了E.coli，將代謝物生物傳感器與影響微生物生長的基因相耦合的策略同樣能夠應用于S. cerevisiae中。結合來源于E.coli的轉錄因子MetJ和其對應的操縱子metO，在S. cerevisiae中構建了SAM的生物傳感器［60］。通過融合MetJ和轉錄激活區域B42，并將metO放置在報告基因上游，MetJ-B42混合體在S. cerevisiae中成為一個SAM誘導的轉錄激活子。為了更好地調制報告基因，研究者構建了雙輸入元件，報告基因受到TetR的調控。選用his3和leu2作為缺陷型報告信號，篩選了S. cerevisiae基因組突變庫，鑒定出目標基因GAL11能夠將SAM產量提高7倍。

3.3 動態調控

代謝工程中，最大程度的表達生物合成途徑中相應的酶通常不能夠獲得最高產量，這是由于酶和途徑的過表達會給細胞帶來代謝壓力，導致途徑中的有毒中間產物積累，或者使得重要代謝物的缺乏影響細胞生長。雖然目前已經有一些有效的優化途徑基因表達的策略，如優化啟動子強度，核糖體結合位點強度，酶的降解速率，以及近期發展迅速的能夠實現多目標基因的調控dCas9［61］和反義-RNA［62］技術，但是這些策略大多是將表達水平控制在固定水平。利用代謝物生物傳感器響應胞內代謝狀態動態調控細胞內基因的代謝水平，模擬微生物天然存在的代謝調控網絡，能夠避免有毒代謝中間產物的過量積累，平衡細胞生長所需的前提供應與目標代謝產物的合成（圖3-C）。

早在2000年，已經實現通過能夠響應胞內乙酰磷酸的水平的調節因子Ntr，控制E.coli中番茄紅素合成途徑中的兩個關鍵酶基因的表達水平，使得番茄紅素產量提高約18倍［63］。另一個經典的案例是利用脂肪酰輔酶-A的生物傳感器FadR動態調控脂肪酸乙酯（Fatty acid ethyl ester，FAEE）合成基因的表達［47］。FAEE合成包含乙醇和脂肪酰基輔酶A的合成反應，而這兩個的前體物質對于生長有毒害或抑制作用。轉錄抑制因子FadR與酰基輔酶A和脂肪酸都有相對較弱的親和作用。這一效應物的偏好性順序，使得脂肪酸的積累誘導酰基輔酶A合酶的表達，隨后脂肪酰基輔酶A合成反過來誘導從丙酮酸到乙醇的合成以及蠟質合成酶表達。這一動態調控元件避免了乙醇的過度累積，同時平衡了細胞生長和FAEE合成所需要的脂肪酸代謝流，在進一步優化啟動子強度后，FAEE產量達到1.5 g/L，相比于沒有動態調控的對照菌株提高了3.5倍。

丙二酰輔酶A是脂肪酸合成、黃酮類化合物合成途徑中的重要前體，但是過表達丙二酰輔酶A的合成途徑乙酰輔酶A羧化酶（accABCD編碼）對細胞生長有害。基于響應丙二酰輔酶A的轉錄因子FapR構建的負反饋元件，使脂肪酸合成產量提高了34%［56］。轉錄因子FapR通過結合在fapO上抑制基因表達，FapR與丙二酰輔酶A結合后，從結合位點脫離下來。隨后的研究工作進一步揭示了FapR介導的E.coli啟動子PGAP表達激活作用，和取決于丙二酰輔酶A的抑制作用，并采用了類似的動態調控設計，使得脂肪酸的產量相比于靜態表達提高了2.1倍［64］。在S. cerevisiae中應用FapR和葡萄糖濃度響應的啟動子PHXT1，圍繞關鍵中間產物丙二酰輔酶A設計得分層動態調控系統，使得3-羥基丙酸的產量提高10倍［65］。

各劑量組實驗中期及實驗結束前采尾血測定各劑量組血常規各項血液學指標（血紅蛋白、紅細胞計數、白細胞計數及其分類）。結果與對照組比較均無顯著性差異(p＞0.05)，且各項指標均在本實驗室正常值范圍內。

核糖開關同樣被應用于動態調控系統。作為概念驗證，來源于E.coli和B. subtilis的賴氨酸-OFF的核糖開關被整合在C. glutamicum染色體中gltA基因（編碼檸檬酸合酶）上游，使得賴氨酸產量分別提高63%和38%［66］。為了進一步提高C. glutamicum中賴氨酸的產量，研究者開發了賴氨酸-ON核糖開關［67］，動態上調賴氨酸轉運蛋白（gltA）表達量。為了構造新的核糖開關，簡并堿基被插入到賴氨酸核酸適配體與雙重選擇標記tetA上游的RBS區域。3輪正-反篩選后，成功構建了能夠在賴氨酸存在時激活上游基因表達的核糖開關。利用這一賴氨酸-ON的核糖開關動態控制gltA表達量，賴氨酸產量提高了21%。

實現動態調控的另一重要策略在于實現細胞生長和目標產物生產過程的解耦。例如，利用良好表征的lux群體相應系統，當E.coli細胞密度達到理想水平，動態調控代謝流從TCA循環到異丙醇合成，異丙醇產量提高了3倍［68］。當酰基同型絲氨酸內酯（N-（β-ketocaproyl）-L-Homoserine lac- tone，AHL）濃度達到一定水平時，調節因子LuxR激活啟動子Plux的表達。異丙醇生產途徑和TetR抑制蛋白表達受到AHL-LuxR響應系統調控，而編碼檸檬酸合酶的gltA基因受到TetR控制。同時能夠通過控制添加的IPTG濃度和LacI蛋白表達調控LuxR開關發生時細胞濃度和AHL水平。

除了以上提到的利用轉錄因子和核糖開關構建的代謝物生物傳感器實現動態調控外，壓力響應的啟動子實現代謝途徑的動態調控也是重要的策略。能夠特異性響應特定效應物的啟動子也可以歸為代謝物生物傳感。通過轉錄組分析鑒定出了對于法尼焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，FPP）表現出壓力響應啟動的特性，利用FPP-抑制的啟動子PgadE調節FPP合成，FPP-激活的啟動子PrstA調節下游紫穗槐二烯的合成，相比于靜態調控轉化率提高了兩倍［69］。相似的策略應用在S. cerevisiae中，通過下調競爭性麥角固醇合成途徑，提高了紫穗槐二烯的產量［46］。通過結合修飾的GAL調控系統和葡萄糖濃度響應的啟動子PHXT1分別調控的鯊烯合成途徑和β-胡蘿卜素途徑，使甲羥戊酸途徑和競爭性的鯊烯途徑順序響應葡萄糖濃度實現動態調控，使類胡蘿卜素產量達到1 156 mg/L［45］。

3.4 非遺傳細胞間異質性選擇

在蛋白和代謝物濃度水平上，細胞間天然存在非遺傳因素導致的異質性。由于細胞內蛋白表達機器在不同細胞間存在隨機分配現象，在任意培養體系中均存細胞間差異，針對目的產物的生產，也就是存在非遺傳因素造成的高效生產和低效生產細胞［70］。由于低效的細胞消耗了營養卻沒有有效合成目標產物，非遺傳細胞異質性的存在影響了目標代謝物的合成效率。基于轉錄因子的細胞群體控制系統（Population quality control，PopQC）能夠持續富集高效生產的細胞，降低低效生產細胞的比例（圖3-D），進而提高合成效率［18］。PoPQC的概念在游離脂肪酸（Free fatty acid，FFA）生產中得到驗證。高FFA濃度水平對應于細胞內高濃度的酰基輔酶A，酰基輔酶A與轉錄因子FadR結合后，激活下游TetA外排泵的表達，使細胞具有四環素抗性。通過PopQC富集培養的高產FFA的亞群體細胞，使得FFA的產量提高3倍。類似的策略應用于E.coli，利用特異性響應酪氨酸的TyrR轉錄因子，提高了酪氨酸生產。

圖3 代謝物生物傳感器在微生物細胞工廠中的應用

以往的提高生物合成效率的策略大多忽視了非遺傳細胞異質性差異的影響。但是，低效生產細胞的大量存在，特別是在工業生產中，不同時間尺度上微環境的差異會放大細胞異質性的影響，確實極大地限制了合成效率。因而易于設計和應用的PopQC若能與傳統優化的策略相結合，有望成為提高合成效率，實現低成本合成的通用策略。

4 展望

隨著代謝工程、系統生物學、合成生物學的迅速發展，使得微生物能夠生產一系列有價值的化合物。為了實現包括生物燃料、藥物、大宗化學品等在內的化合物高效生產，需要在細胞中構建高效的合成途徑，提高微生物細胞工廠的產量（Titer）、轉化率（Yield）和生產速率（Productivity）。代謝物生物傳感器作為合成生物學提供的有力工具，能夠大大加快微生物細胞工廠的構建。高通量篩選和選擇將大大提高代謝途徑設計及優化過程中DBT循環的通量，加快構建的速度。而利用代謝物生物傳感器實現宿主內代謝途徑的動態調控將使得微生物具有更高的生產效率。基于代謝物生物傳感器的減少由于非遺傳差異導致的低效生產細胞比例的方法有望應用于工業微生物發酵，提高合成效率。但是對于代謝物生物傳感器的生物元件的挖掘，對響應機理的進一步認識以及如何將其更好地應用于代謝工程仍舊是亟需研究的重點。

雖然目前已經報道了許多成功應用代謝物生物傳感器的案例，但是想要實現廣泛應用，仍舊需要進一步挖掘生物體內廣泛存在的調控元件。生物信息學的發展為調控元件的挖掘奠定了基礎，但是傳統的基于全細胞挖掘代謝物生物傳感器的方法，由于存在細胞膜與細胞壁的束縛，同時細胞內代謝調控網絡復雜程度高，以及細胞培養過程使得設計-構建-檢驗的流程長，難以快速高通量定量評價代謝物生物傳感器的性能。近年來，利用細胞提取物來完成轉錄翻譯過程的無細胞體系迅速發展［71，72］。基于無細胞合成體系進行代謝物生物傳感器挖掘和構建工作，有望大大加快設計-構建-檢驗的進程。另一方面隨著合成生物學技術的發展，有望為來源不同生物的調控元件移植到宿主中進行應用提供通用的策略，如將來源于細菌的轉錄激活子應用于酵母細胞中［73］。

在實際應用中，代謝物生物傳感器的響應特性制約了應用需求。對于目標菌株的高通量篩選和選擇而言，生物傳感器的響應特性決定了其篩選和選擇所得菌株的閾值和分辨率。對于動態調控而言，生物傳感器的響應特性也尤為重要，研究表明不同響應特性的胞內代謝物生物傳感器對回路動態調控的實際效果影響很大，目標產物的最終產量有時甚至相差數10倍［69］。如果要使代謝物生物傳感器真正廣泛應用到代謝工程研究和實際應用中，如何能夠工程化傳感器使其具備滿足應用需求的響應特性成為亟需解決的難題。目前已經有一些經驗性方法改造生物傳感器的特性，如在轉錄水平改變相關基因的啟動子強度［74-77］，或在轉錄后水平RBS序列優化［78］、使用正交核糖體［79］、優化密碼子［80］等策略，然而由于目前對蛋白質或者mRNA序列-結構-功能的認識仍舊處于非常初級的階段［81］，這些方法仍舊屬于假設-試錯循環的范疇，導致生物傳感器改造周期漫長，很難對最終的改造結果進行預測。這使得代謝物生物傳感器的應用受到重大挑戰，急需解決如何從分子層次認識響應機理，配體識別機制，解析序列-結構-功能之間的關系等關鍵的科學問題。結合近年來快速發展的高通量分選技術和深度測序技術，有望開發快速、易于工程化應用的生物傳感器改造方法。

隨著生物元件的不斷挖掘，對生物識別元件響應機理認識的深入，工程化改造方法的成熟，將會有更多的代謝物生物傳感器應用于微生物細胞工廠的構建，結合快速發展的高通量測序技術、自動化技術等手段，有望實現微生物細胞工廠高通量、智能化構建。

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（責任編輯 馬鑫）

Metabolite Biosensor：A Useful Synthetic Biology Tool to Assist the Construction of Microbial Cell Factory

ZHOU Yi-kang WU Yi-nan WANG Tian-min ZHENG Xiang XING Xin-hui ZHANG Chong
（Department of Chemical Engineering，Tsinghua University，Key Lab of Industrial Biocatalysis of Ministry of Education，Center for Synthetic and Systems Biology，Tsinghua University，Beijing 100084）

Metabolite biosensor，which represents a useful synthetic biology tool，can sense the concentration of intracellular metabolites and then transfer it into specific signal output，showing great potential in the construction of microbial cell factory. It generally consists of two components，biological recognition element and signal output element. The former，typified by regulatory elements，is ubiquitous in nature，such as transcription factor and riboswitch，and has diverse response mechanism. The output can be fluorescence signals，fitness，pathway activation or silence，and so on. Here we reviewed recent progresses about applications of metabolite biosensor in the construction of microbial cell factory，including high-throughput screen/selection，dynamic control and non-genetic selection. We also discussed the effects of the metabolite biosensor performance in application and focused on the opportunities and challenges we might meet in practice.

metabolite biosensor；response mechanism；performance；microbial cell factory

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.001

2016-12-19

周益康，男，學士，研究方向：生物化工；E-mail：zyk15@mails.tsinghua.edu.cn

張翀，男，博士，副教授，研究方向：生物化工、合成微生物細胞工廠；E-mail：chongzhang@mail.tsinghua.edu.cn