合成生物學在天然產物研究中的應用

王麗蘋 羅云孜，2（. 四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室 生物治療協同創新中心，成都 6004；2. 四川大學華西醫院消化內科，成都 6004）

合成生物學在天然產物研究中的應用

王麗蘋1羅云孜1，2
（1. 四川大學華西醫院生物治療國家重點實驗室 生物治療協同創新中心，成都 610041；2. 四川大學華西醫院消化內科，成都 610041）

天然產物作為臨床用藥的重要組成部分和新藥發現的重要來源，已經成為醫藥領域不可或缺的成員之一。但是傳統的天然產物篩選方法在一定程度上制約了新型天然產物的開發，鑒別與改造天然產物的生物合成路徑為全新天然產物的發現提供了思路。近年來，生物信息學和合成生物學技術的蓬勃發展為天然產物的探索與改造帶來了新的曙光。歸納總結了合成生物學技術相關的基因重組策略和基因簇調控方法，并討論了其在天然產物研究中的應用及存在的問題。

天然產物；合成生物學；基因重組；基因編輯；底盤細胞設計；異源表達；CRISPR/Cas9

迄今，大量來源于植物、真菌和微生物中的天然產物被廣泛的應用于制藥、醫療行業和工業。在過去30年制藥行業的發展中，61%抗癌藥物和49%的抗感染藥物來源于天然產物［1］。然而傳統天然產物研究的策略，即通過常規分離萃取方法獲得植物中的天然產物或通過培養條件和工藝優化篩選微生物中的天然產物［2］，往往具有盲目性，且耗時長、成本高，重復發現已知的化合物，已經漸漸不能滿足當前人們對天然產物開發的需要。此時，合成生物學的出現與應用無疑對其產生了巨大的影響。合成生物學主要是以生物技術和工程化理念為基礎，綜合了系統生物學、生物化學、生物物理學、生物信息學等學科，旨在設計、改造、重構或創造生物系統，進而使這些生物系統滿足人類的需求。在過去的10年中，從青蒿素的生物合成到嗎啡在酵母中的表達［3，4］，從達托霉素等的生物合成途徑鑒定到應用組合生物合成方法得到其類似物［5，6］，合成生物學為天然產物的研究帶來了一場新的革命。隨著合成生物學的發展，天然產物的研究得到了相應的促進。一方面，生物信息學的發展和完善，使天然產物研究的靶向性更明確；另一方面，合成生物學技術的蓬勃發展為設計、重構、改造天然產物生物合成系統提供了全新的思路和技術。

在植物中，天然產物主要通過植物內不同酶元件串聯反應得到。對于結構復雜、高活性的植物天然產物，如抗癌藥物紫杉醇，因其提取產量低、全合成效率低，其產量往往難以滿足市場要求，故重構其生物合成途徑并在底盤細胞中成功表達將為解決該問題提供新思路［7-10］。基于京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）［11］和PhytoMetaSyn［12］等數據庫的代謝途徑分析和相關酶的篩選，為植物天然產物合成路徑在底盤細胞中異源表達的設計提供了更多信息和素材。在微生物中，有生物活性的天然產物多為微生物的次級代謝產物。常用的次級代謝產物預測工具有 antiSMASH（antibiotics and Secondary Metabolites Analysis SHell）［13］和SMURF［14］等，以放線菌為例，平均每個放線菌含有20-40個次級代謝生物合成途徑，其中大多數未被研究或在原始菌株生長狀態下不表達（這類基因簇即“沉默”基因簇），激活這些基因簇將會為新型天然產物的挖掘提供新的來源。

因此，系統的生物技術策略與高通量的操作方法對于天然產物的發現和改造有重要的意義［15］。基于有效的基因重組技術［16］和編輯手段，或異源表達策略［17-19］，可快速準確的實現新天然產物的發現或已知高價值天然產物的產量提高［20］。本文主要就近幾年應用于天然產物研究的基因編輯和重組表達策略做了簡要介紹，討論了這些方法用于天然產物表達簇的重組和對底盤細胞的編輯調控，最后對這些相關合成生物學技術在天然產物研究領域的應用進行簡要敘述。

1 合成生物學技術的發展

為實現新天然產物的發現和高價值化合物的高量表達，目標基因簇的構建與合適底盤細胞的選擇十分重要。在過去的10年里，科研工作者們基于合成生物學技術開發和優化了許多基因編輯與重組的技術以用于大片段DNA的組裝和編輯以及宿主細胞的改造和優化［21］。就基因重組技術而言，主要包含兩大類：體內重組與體外重組。其基本原理大都是基于限制性內切酶的酶連反應或同源序列介導的重組（表1）。基因編輯技術也在近幾年有飛速的發展，同時促進和協助了底盤細胞的優化以及基因簇的定向改造。

表1 基因重組策略

1.1 生物合成路徑的重構方法

1.1.1 體外重組方法

1.1.1.1 基于限制性內切酶的重組系統 這類方法主要是利用限制性內切酶剪切，暴露出黏性末端，具有互補性質的黏性末端在連接酶作用下末端識別進行重組。

2008年，Engler等［35］利用具有特殊性質的IIS型內切酶構建了一個多片段的一步克隆法，命名為Golden Gate。IIS型內切酶的特點在于，其剪切位點大都在識別位點的外側2-4 bp，因此剪切后載體不易自連，同時由于暴露的末端與酶切位點序列無關，故可以通過設計利用同一內切酶實現多片段組裝和連接。2011年，Weber等［36］基于Golden Gate發明了新的多片段重組系統模塊克隆（Modular Cloning，MoClo），并且通過三步克隆，成功實現了總長33 kb共11個轉錄單元（共來自44個基因片段）的基因簇構建。MoClo主要思路為：a.設計最終的載體結構及確認實驗中所需的工具載體與基因片段；b.以基本的基因片段平行組裝所有的轉錄單元（一級載體）；c.將上一步得到的轉錄單元組裝得到二級載體（由于組裝效率的限制，每次最多組裝6個單元），最后一步根據實際情況可能要多次重復才能得到最終的載體（圖1）［37］。2012年，Werner等［22］通過在該系統一級載體與二級載體間引入過渡載體，實現了總長50 kb共17個轉錄單元的基因簇構建（來自68個基因片段）。2016年，Iverson等［38］基于MoClo建立了新的跨學科的整合設計自動化研究實驗室（Cross-disciplinary Integration of Design Automation Research lab，CIDAR）模塊克隆庫，其中包含了一系列在E.coli中可通用的模塊組分，包括啟動子、終止子、載體和核糖體結合位點等。該系統的建立使MoClo的使用更加自動化，大大節約了設計和操作的時間。除此之外，2016年Moore等［39］基于MoClo開發了另一適用于E.coli合成生物學操作的工具包EcoFlex，并且成功實現總長31 kb、共20個基因的組裝。EcoFlex系統引入了標準元件庫（與CIDAR相似），以及熒光報告系統（CIDAR無該設計），然后基于標準元件實現用戶自定義的模塊組裝。與CIDAR側重于自動化模塊組裝相比，EcoFlex在實時檢測和設計靈活上有更明顯的優勢。相比于傳統的酶切連接，在多片段克隆上，MoClo具有設計簡便、操作流程簡潔、省時高效的優勢。同時，CIDAR和EcoFlex系統的建立，進一步從實驗設計上優化了多片段克隆。

2013年，Chen等［23］設計了一個多基因片段連接的新方法——甲基化輔助的末端剪切連接（Methylational-ASsisted Tailorable Ends Rational ligation，MASTER ligation），并成功組裝4個基因片段得到總長29 kb的DNA片段。MASTER主要根據同時兼具IIS與IIM性質的限制性內切酶（restriction enzyme，RE），如Chen等采用MspJI，特異性識別甲基化的4-bpmCNNR（R=A/G），并在識別位點外側剪切形成黏性末端，產生4 bp隨意的黏性末端，從而實現多基因的按序無縫連接。與MoClo相比，由于其組裝過程與序列無關（sequence-independent）的性質，故更適于基因片段相似性高的多片段組裝。

1.1.1.2 體外同源重組方法 體外的同源重組方法主要有序列與連接獨立型克隆（Sequence and Ligation-Independent Cloning，SLIC）［40］、無縫克隆試劑盒（Seamless Ligation Cloning Extract，SLiCE）［41］、尿嘧啶-定點切除試劑克隆（Uracil-site Specific Excision Reagent cloning，USER）［42］等。以上方案大都僅適用于10 kb以下的片段重組，但它們可用于一些基礎工具載體的構建，從而進一步用于基因編輯。2009年，Gibson等［21］報道了一種高效快捷的一步克隆法——Gibson assembly，并實現了大于50個基因片段的組裝，也可實現總長約900 kb的基因序列組裝，故Gibson assembly可作為大片段組裝時的優先選擇。該方法原理是利用T5外切酶剪切基因片段得到單鏈DNA臂，經Taq連接酶與聚合酶的作用，使各基因片段按序組裝。2015年4月，Wang等［43］將CRISPR/Cas9系統與Gibson assembly結合實現基因簇構建或編輯，成功克隆組裝出最長約29 kb的DNA片段。同年9月，Jiang等［44］發表文章，利用策略-CATCH（Cas9-Assisted Targeting of Chromosome segments）（圖2），成功克隆組裝得到最長約150 kb的DNA片段。CRISPR/Cas9-Gibson assembly的作用原理是在CRISPR/Cas9定向剪切后，得到目的基因片段，最后采用Gibson assembly重組得到目的序列。但此方法對于大片段的操作效率仍然較低。基于CRISPR/Cas9的大片段克隆技術，由于其一步克隆得到目的片段的特點，且其片段克隆受酶切位點等的限制，操作的靈活性強，故尤適于完整大基因片段克隆。2016年，Jin等［27］發明了一個類似Gibson assembly的無縫克隆方法DATEL（DNA Assembly method using Thermostable Exonucleases and Ligase），驗證對于2-10片段的基因組裝均有效，但對于大片段的操作效率依然較低。

圖1 MoClo的基本操作原理［36］

圖2 CATCH與CRISPR/Cas9-TAR的操作流程

另一種多片段組裝策略基于隨機組裝的位點特異性重組（Site-Specific Recombination-based Tandem Assembly，SSRTA）由Zhang等［45］研究報道的。2010年，其課題組研究wBT1和wC31介導重組的同時，發現并鑒定了一系列attB與attP位點，次年，Zhang等［24］構建了SSRTA，完成了總長62.4 kb（10片段）的埃博霉素生物合成途徑的構建。SSRTA主要是利用wBT1整合酶的重組機制，利用wBT1特異性剪切aat位點形成末端，再經過重組酶作用形成DNA產物，該方法可以快捷高效有序的組裝多片段。2014年，Colloms等［25］報道了另一種基于絲氨酸整合酶重組的方法絲氨酸整合酶重組系統（Serine Integrase Recombinational Assembly，SIRA），可有效組裝總長小于10 kb的4-5個基因片段。這兩種方法除了可以有效的組裝多片段外，且驗證可以對已有的基因進行片段的增刪等。

1.1.2 體內重組方法 2009年，Shao等［46］基于酵母體內重組的機制構建了一個新的體內克隆方法-DNA assembler，并成功完成約19 kb，共8個片段的組裝。2011年，其課題組利用該系統完成約45 kb的spectinabilin合成基因簇的構建［29］。該方案的顯著優點在于：設計靈活、不受酶切位點限制、效率高以及操作簡單。與DNA assembler類似的另一種方法TAR（Transformation-Associated Recombination），于2002年由Resnick等［47］構建，是一種基于轉化偶聯重組的酵母重組技術，由于其組裝基因長度小于15 kb而使應用受限。通過不斷優化，現已成為大片段構建的常用方法之一，如Yamanaka等［30］利用TAR組裝得到總長67 kb的它納霉素合成基因簇。2014年，Lee等［34］將CRISPR/Cas9系統與TAR聯合，最終實現約55 kb的基因簇克隆。TAR-CRISPR/Cas9原理與CATCH類似（圖2），即利用Cas9作為“剪刀”，從基因組中獲得目的片段，再將目的片段與載體利用TAR進行組裝，得到最終目的載體。DNA assembler與TAR均為利用酵母體內可自行發生同源重組的特性，二者對于組裝的基因片段均需要具有相應的同源序列；雖然TAR最終形成的是環形的酵母人工染色體，而DNA assembler則可將基因片段組裝到目的質粒上，也可直接整合至酵母基因組上，但是這兩類方法均可有效的組裝天然產物的合成基因簇。

在E. coli內的同源重組系統也有相應發展。2011年，基于全長的Rac噬菌體前蛋白RecE及其協同作用蛋白RecT的發現鑒定［32］，Bian等［48］在E. coli中，建立了一個直接將DNA大片段克隆至表達載體的方法：線性-線性同源重組（Liner-Liner Homologous Recombination，LLHR），并成功克隆了10個基因（大小為10-52 kb不等）至表達載體，且其中兩個表達載體在異源宿主中表達得到相應產物luminmycin A 和luminmide A/B。LLHR的基本原理是基于E.coli中類似于重組酶系統的噬菌體前蛋白RecE在其協同蛋白RecT的協同調節下使載體與目的片段進行高效的線性-線性同源重組。2015年，Yin等［33］利用LLHR組裝得到總長106 kb的salinomycin合成基因簇。另外也有研究者將CRISPR/Cas9系統引入E.coli進行重組系統設計［26，49］，并成功組裝長約10 kb的丁醇表達途徑［49］。雖然在E.coli中引入CRISPPR/Cas9系統對于大片段的組裝不存在明顯優勢，但由于該方法可一步實現從基因片段到基因組的整合，故可利用其進行一些簡單的生物合成途徑的組裝。

2014年，Du等［50］建立了一個直接克隆的策略-基于噬菌體wBT1整合酶調節的位點特異性重組。與SSTAR不同，該方法使得鏈霉菌基因組編輯與抗生素合成基因簇克隆可以同時進行，且整個過程在鏈霉菌中完成。其原理是在鏈霉菌中，3個導入的外源質粒中其中兩個質粒分別對基因組的特定位點進行剪切，另一質粒對剪切片段進行重組并復制。Du等［50］成功利用該方法從天藍鏈霉菌中克隆得到放線菌紫素的合成基因簇，從玫瑰包鏈霉菌NRRL15998中克隆得到納它霉素和達托霉素的合成基因簇，且效率高達80%。相比于SSRAR，該方案在克隆大片段的基因簇操作上更簡潔，同時通過外源質粒的優化，更適用于高GC含量的鏈霉菌基因的操作。隨后2015年，Jin等［51］設計了一個新的大片段克隆系統FACs（Fungal Artificial Chromosomes），并成功獲得56個來源于土曲霉的次級代謝產物合成途徑。該方案主要是構建一個同時具有E.coli復制起始位點和曲霉復制起始位點的人工染色體，使其可在E.coli與模式的曲霉中穿梭，從而攜帶目的基因片段（可達150 kb）。真菌人工染色體能夠快捷地從自然宿主基因組DNA上捕獲不同大小的基因，通過對轉化子末端測序來鑒定是否含有自然宿主的完整基因簇，將攜帶完整基因簇的真菌人工染色體在構巢曲霉中表達完成天然產物的異源生產。與基于噬菌體wBT1整合酶調節的位點特異性重組類似，FACs也是一步完成大片段基因克隆，但其目前僅限于對某些特定的真菌系統的操作。

目標基因簇的重構有時還涉及到一些優化與改造，如利用“Plug and Play”策略對目標基因插入模塊化的啟動子，或利用CRISPR/Cas9對調控基因進行編輯等，以實現基因簇的表達優化和調控改造［52，53］。基于傳統的基因重組策略，優化和發現新的基因重組編輯方法為不同目的的基因簇重構提供了更多的選擇性。

1.2 底盤細胞的選擇與改造

底盤細胞往往是異源表達效率的決定因素之一，故其選擇和改造也是天然產物生物合成路徑構建的重要考慮方向。底盤細胞改造主要涉及到基因組的精簡與優化、代謝流的控制優化和調控因子的改造等。

對于底盤細胞的精簡與優化，最經典的方法為Cre-LoxP，例如2010年，Komatsu等［54］利用Cre-LoxP策略敲除了阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）全基因（9.02 Mb）組中約1.4 Mb的非必需基因，獲得“最小基因組”阿維鏈霉菌底盤細胞，并成功表達外源基因簇鏈霉素、頭孢菌素C等，且產量優于原始菌株表達量。該方法的主要原理是利用Cre重組酶可以特異性的識別LoxP位點并介導其發生重組。該系統適應性強，適用范圍廣，但其介導重組后會留下引入的LoxP位點，故對于需要多次非連續的基因編輯時，其應用則受到LoxP位點設計的限制。CRISPR/Cas9技術的出現則給了底盤細胞基因組精簡與優化的另一種選擇。CRISPR/Cas9介導的基因刪除原理是 Cas9蛋白在sgRNA（single guide RNA）的作用下，識別特異性的PAM位點，繼而發生重組。例如，Cobb等［55］，利用CRISPR/ cas9系統敲除20 bp-30 kb的DNA時，效率可達70%-100%。相比于Cre/LoxP系統，CRISPR/cas9系統在選擇靶點上更為靈活，且對于非連續性的多片段敲除上更易設計與操作。

對于代謝流的控制和調控因子的改造多通過對原始基因編輯或引入新的基因元件實現。其主要思路有：（1）引入啟動元件或高表達正調控因子。例如，Bai等［56］通過定量法鑒別了一系列可通用的合成模塊調控元件（核糖體結合位點+啟動子），并成功將其應用于S.avermitilis中番茄紅素表達基因簇的激活與過表達；為更好地在E.coli中表達異戊二烯，Chen等［57］通過協同過表達對異戊二烯合成有利的甲基赤磷酸化途徑和甲戊磷酸化途徑，成功將異戊二烯產量提高20倍；（2）負調控因子的沉默或敲除。例如，已知在阿維鏈霉菌中阿維菌素生物合成分別受到SdrA和avaR2調控，Ulanova等［58］和Komatsu等［59］通過敲除SdrA和avaR2，不僅實現產物產量的提高；對于已改造的阿維鏈霉菌底盤細胞SUKA17引入ptlB，成功提高紫穗槐-1，4-二烯異源表達產量［59］。

底盤細胞作為生物合成途徑表達的載體，為天然產物的合成提供了初始零件，即底盤細胞決定了生物合成底物與代謝通量，底物與代謝通量決定了天然產物合成的性質與產量。故根據實際生物合成途徑選擇合適的底盤細胞，并對其代謝過程的酶與調控因子加以優化，將為天然產物的異源表達錦上添花。

2 合成生物學在天然產物研究中的應用

隨著基因信息學的不斷完善和編輯新方法與策略的不斷發現及改造，從微生物或植物中鑒別次級代謝產物合成途徑變得更加有靶向性（圖3）。合成生物學方法用于天然產物的研究從結果上可分為兩大類：重構天然產物的合成基因簇進行異源表達，通過對原始宿主的調控實現合成基因簇的激活或過表達。

2.1 異源表達

異源表達作為天然產物研究的重要策略之一，主要應用可包含以下幾類：第一，已知生物合成途徑的高價值化合物的基因簇異源表達或調控，提高已有表達量。例如將來源于Streptomyces spheroides的新生霉素合成基因簇導入Streptomyces coelicolor M512中進行表達，使其產量提高了3.4倍［60］。第二，通過異源表達功能模糊或“沉默”的合成基因簇，實現新天然產物的發現。其主要應用的策略包含：啟動子的優化，即替換原始基因簇的弱啟動子或加入新的啟動子；調控基因的編輯，即過表達正向調控子或沉默負調控子等。例如，Luo等［61］重構源于Streptomyces griseus中的未知基因簇，并在其上游加入啟動子，成功使該基因簇在變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans）中表達，發現了具有重要生理活性的一類抗真菌化合物。Yamanaka等［30］通過編輯來源于Saccharomonospora sp. CNQ-490中的未知NRP基因簇，使其去除其中的LuxR型的負轉錄調控子，并將該基因簇轉入底盤細胞天藍鏈霉菌中表達，成功分離鑒定得到一個新的脂多肽化合物taromycin A。第三，對植物源天然產物的生物合成途徑進行重構，實現其在模式微生物內的表達。如阿片類化合物在酵母中的成功表達［4］。

2.1.1 Anthracimycin Anthracimycin作為一類結構獨特的14元大環內酯類抗生素，最先于2013年從Streptomyces sp. CNH365中分離鑒定得到其化學結構［62］。2015年，Alt等［63］從Streptomyces sp. T767中分離得到Anthracimycin，并通過異源表達分析推斷得到其生物合成路徑，為其進一步調控和衍生物的獲得提供了依據。

圖3 天然產物生物合成研究的整體思路

從Anthracimycin的結構分析，其主要骨架來源于PKS（polyketide synthase）合成途徑，但其萘烷部分形成類似于［4+2］的環加成，且其中3組雙鍵的位置與典型的PKS作用結果不同。于是Silke等首先通過基因信息學的分析，對推斷得到的Anthracimycin合成基因（來源于Streptomyces sp. T767，后面以act 表示）進行功能的判斷，并通過實驗驗證（同位素追蹤等）確定得到其生物合成途徑（圖4）。Anthracimycin很可能只通過actC-F四個PKS基因作用形成，而不涉及后修飾基因作用。然后其課題組將鑒定的act 基因簇（actC-F）克隆并轉入異源宿主S. coelicolor中表達并成功分離鑒定得到Anthracimycin。通過對act 基因簇的模型（一類新的PKS）構建，有利于了解這類新的大環內酯類抗生素的研究。另一方面，通過推斷了解其生物合成過程，也為基因重構實現其類似物的發現奠定了基礎。

圖4 Anthracimycin合成基因簇

從傳統的發酵手段獲得新的化合物依然是天然產物研究中的重要策略，但是某些生理活性較好的化合物若沒有經過進一步的優化難以成為臨床藥物成分。另一方面，闡明高活性化合物的生物合成途徑也有利于其類似物的發現。

2.1.2 nisin類似物 nisin是屬于羊毛硫抗生素類，由34個氨基酸組成，是一種天然抑菌劑，該類物質多具有良好的抑制革蘭氏陽性菌的作用，且由于其安全性高，故也作為食品防腐劑用于食物保鮮，但該類化合物目前被分離得到的種類卻不甚可觀。

2016年，Van Heel等［64］通過BAGEL3等數據庫分析，得到了72條與nisin中心肽類似的序列。隨后其基于nisin合成基因的模塊，保留先導肽部分從而構建了一個可適用不同核心多肽表達的元件（圖5）。最后將預測的序列與先導肽元件結合，引入乳酸菌中表達得到18種全新的結構差異較大的類似物，且其中5種表現出良好的藥理活性。相較于傳統的培養條件篩選，該系統能較快的實現未知基因的表達，同時能更具目的性的對產物進行分析。

圖5 nisin類似物研究思路

2.1.3 阿片類化合物 阿片類化合物作為西方最初使用的鎮痛劑和姑息治療藥物，目前其唯一來源依然是罌粟的提取，因此其產量嚴重的受到氣候、地域和蟲害等的影響。作為重要的臨床藥物，不確定的產量制約了其市場需求。另外，阿片的衍生物諸如嗎啡、蒂巴因等都是具有高價值的化合物，而化學合成這些結構復雜的化合物并不具有經濟上的競爭性。大約30多種關于阿片類化合物的化學合成途徑，但沒有一種適用于大規模生產［65］。于是重構其生物合成途徑在模式微生物中表達則具有突破性的意義（圖6）。

植物源天然產物的異源表達，首先需要篩選得到相應的酶；其次是在重構基因簇后，對底盤細胞的代謝流進行相應調控，最后完成途徑的優化。

2008年，Hawkins等［66］首次通過在酵母中引入6OMT、CNMT、4OMT三種甲基轉移酶，實現了BIAS合成的前體物質（S）-牛心果堿的獲得（圖6橙色框）。2014年，Thodey等［67］以蒂巴因為底物，在酵母中引入蒂巴因到嗎啡合成途徑中的脫甲基酶T6ODM和醛酮合成酶COR，最終在發酵液檢測得到嗎啡。此外，其在以上基礎引入源于惡臭假單胞菌中的嗎啡脫氫酶（MorA）和嗎啡還原酶（MorB），最終生物合成得到氫可酮、氫化嗎啡酮和氧可酮（圖6藍色框）。2015年，Deloache等［68］基于酶偶聯法發明了一種新的生物傳感器，并成功篩選得到來源于甜菜中的CYP716AD1具有酪氨酸羥化酶活性。通過PCR優化CYP716AD1，并將其引入酵母表達，成功實現從葡萄糖到阿片類化合物中間體（S）-牛心果堿的生物合成（圖6綠色框）。同年，Fossati等［69］首先引入罌粟中沙羅泰里啶合成酶（PsSAS），沙羅泰里啶還原酶（PsSAR）和salutaridinol乙酰轉移酶（PsSAT）以及T6ODM、COR、CODM，構建得到從（R）-牛心果堿到阿片類化合物的生物合成途徑，并且在酵母中以（R）-牛心果堿為底物時，成功分離得到嗎啡（圖6紫色框）。誠如傳統的化學反應，隨著生物內反應鏈的加長，產物的積累變得更加困難，另外如何成功實現（S）-reticuline到（R）-reticuline的生物體內轉化成為阿片類化合物從頭合成的障礙。同年Galanie等［4］通過研究發現，DRR-DRS酶的作用，可將（S）-reticuline成功轉化為（R）-reticuline，并通過改進底物來源的木糖輔助途徑從源頭提高阿片類化合物形成的代謝流，同時在實驗中不斷優化作用酶的表達和代謝流，從而最終實現了從頭合成阿片類化合物（圖6）。雖然產量較低，但從無到有的合成給進一步的產量優化奠定了基礎。

圖6 阿片類化合物的生物合成途徑［4］

就阿片類化合物而言，生物合成一方面可以解決傳統植物提取所面臨的環境依賴性和產量不確定性；另一方面，相較于復雜冗長的化學合成，其更適合于大規模生產，且以葡萄糖為底物使其在經濟上更具競爭性。

當前，利用模式微生物成功表達植物來源的天然產物的成功案例已經屢見不鮮，如在E.coli中成功表達過紫杉醇的前體紫杉二烯和紫杉酚，在酵母中成功表達過紫杉醇［9，70，71］、人參皂苷［72］、依托泊苷［73］等。

異源表達作為一種有效的天然產物發現與鑒定的策略，不僅成功應用于天然產物的發現，同時也為高價值化合物的高表達提供了新的策略。為成功實現目的天然產物的異源表達，需要注意以下3點：適宜的底盤細胞的選擇、合理的代謝調控的優化以及待表達的基因簇的設計改造。當然，構建出多種不同高適應性的底盤細胞庫與相應的調控元件庫，將會加快基因簇的重構與異源表達的進程。

2.2 原始宿主調控

原始宿主的調控主要包括利用操作調控子，改變代謝途徑中的加工酶或轉運酶或前體飼喂等實現天然產物的發現或產量提高。Wang等［74］在C-1027合成途徑中，通過過表達調控子sgcR1、sgcR2和sgcR3均使目標產物的產量增加。Gottelt等［75］通過敲除天藍鏈霉菌中一條PKS（Polyketide Synthase，聚酮合成酶）生物合成途徑中的轉錄抑制子scbR2，從而發現了新化合物coelimycin。Bai等［56］通過發明有一種基于啟動子的生物感應器，成功激活并過表達了S. avermitilis中番茄紅素。

Law等［76］在雷帕霉素的合成途徑中引入新的甲硫氨酸腺苷轉移酶，使其可識別不同甲基底物，得到多種新的16-位定點改變的雷帕霉素同系物。另外，Nguyen等［77］通過改變達托霉素合成途徑中DptBC次級單位上的一個或多個模塊從而改變達托霉素的環多肽中心；同時結合模塊的更換、NRPS次級單位的替換、沉默后修飾的谷氨酸3-甲基轉移酶等方法得到約30種達托霉素類似物，并且其中一種表現出優于達托霉素的抗E.coil imp的能力。

原始宿主內的調控主要集中于正向調控元件或生物傳感器的引入、負調控因子的刪除或沉默，從而實現未知基因簇的激活及過表達。另一方面，對于原始宿主內基因簇中關鍵的合成元件的調整將會為快速發現天然產物的類似物提供研究思路。所以建立可通用的生物傳感器、發明快速準確的基因編輯手段是基于原始宿主研究天然產物的重要策略。

3 結語

當前正是天然產物發現的新紀元，生物信息學為天然產物的合成基因簇鑒定與重構提供了理論參照數據，合成生物學技術的發展影響著應用的進程。在理論分析得到目的基因簇后，選擇合適的基因簇改造方法，如異源表達、模塊調節、組合合成等，可更準確的實現基因功能的鑒別及新化合物的發現［18，64，78］。同時，CRISPR/Cas9等新基因編輯技術的出現，為大片段的獲得與組裝編輯提供了新的策略，使基因重構表達更快速［34，52，79］。

雖然合成生物學方法應用于天然產物研究已經取得了一定成果，但是由于生物合成途徑的重構隨基因簇的增大而變得復雜，最終得到的表達系統也不一定符合預期。所以，設計構建更好的基因編輯系統和更具有優勢的底盤細胞，將會進一步促進天然產物領域的發展。

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（責任編輯 馬鑫）

Applications of Synthetic Biology in the Research of Natural Product

WANG Li-ping1LUO Yun-zi1，2
（1. State Key Laboratory of Biotherapy，West China Hospital，Sichuan University and Collaborative Innovation Center of Biotherapy，Chengdu 610041；2. Department of Gastroenterology，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041）

As an important source of clinical medicine and new drug candidate，natural product plays an essential role in therapeutic and pharmaceutical industry. However，traditional methods for natural product discovery constrain the development of new compounds at certain extent，and identifying and refactoring the biosynthetic pathways of natural products provided new thoughts for the discovery of new natural product. Currently，with the prosperous development of bioinformatics and synthetic biology technologies，a new era of natural product discovery and engineering can be foreseen. Here，we summarize recent advances on the strategies of genetic recombination and gene cluster regulation related to synthetic biology techniques，and discuss their applications and issues in studying natural products.

natural product；synthetic biology；genetic recombination；gene editing；chassis design；heterologous expression；CRISPR/Cas9

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.004

2016-09-26

國家自然科學基金項目（81502966）

王麗蘋，女，碩士，研究方向：天然產物合成與結構修飾；E-mail：2015224060103@stu.scu.edu.cn

羅云孜，女，博士，研究員，研究方向：合成生物學、天然產物；E-mail：luoyunzi@scu.edu.cn