天然產物合成生物學體系的優化策略

匡雪君鄒麗秋孫超陳士林（. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 0093；. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 00700）

天然產物合成生物學體系的優化策略

匡雪君1鄒麗秋1孫超1陳士林2
（1. 中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193；2. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700）

天然產物是新藥研發的重要源泉。天然產物合成生物學通過設計、重構目標化合物的高效生物合成途徑，借助宿主改造，利用發酵生產目標化合物，可以有效彌補有機合成化學在復雜天然產物類藥物生產方面的不足。雖然合成生物學已經取得了一些進展，但是通過合成生物學技術使目標產物的產量達到工業化生產水平依然是一項非常具有挑戰性的任務。綜述了天然產物合成生物學體系的優化策略，通過綜合運用單個元件、外源代謝途徑、底盤系統和發酵條件的優化技術，可以實現生物合成系統的最優化，最大化目標產物的產量，為來源稀缺的復雜天然產物的開發提供持續、穩定、經濟的原料供給，推動天然產物類新藥的研發。

天然產物；合成生物學；優化；底盤

天然產物在藥物的發現和研制中發揮著重要作用，以天然產物為基礎研制和開發新藥一直是化學界和醫藥界重點關注的領域［1，2］。 天然產物雖然在整個已知化合物中所占比例很小，但以之為基礎發展成為新藥的比例卻很大。1981-2014年間批準上市的1 562個藥物中約有一半與天然產物有關；1940-2014年間，國際上共有175個小分子藥物被批準用于癌癥治療，其中有85個（即約49%）來源于天然產物或其衍生物［3］。這些有價值的天然產物通常在原物種中含量很低，化學提取不僅成本高，而且會對環境資源造成破壞；有些天然產物由于含有多個手性中心或結構不穩定，用化學方法全合成難度很大，因此，利用合成生物學技術合成具有藥用價值的天然產物受到越來越多的關注。目前，已有學者在工程菌中成功異源合成了萜類化合物青蒿素和人參皂苷、生物堿類化合物諾斯卡品、黃酮類化合物兒茶素和柚皮素等重要天然產物［2，4］。

雖然天然產物合成生物學研究進展迅速，但是使異源合成的目標產物的產量達到工業化生產水平依然是一項富有挑戰性的任務。由于底盤細胞是非常復雜的系統，外源途徑的導入會使底盤系統產生一系列反應，包括生長速率的調節、熱激反應、壓力反應、嚴謹反應等［5］，進而引起質粒的不穩定、細胞的裂解和細胞遺傳信息的改變，導致產物無法合成或產量極低。本文提出了天然產物合成生物學體系的優化策略（圖1），綜合運用單個元件、外源代謝途徑、底盤系統和發酵條件的優化技術，對宿主細胞進行改造，人工精確調控外源基因，實現多基因的聯合協同表達，使生物合成系統最優化，最大化目標產物的產量，為天然藥物的研發提供新的先導化合物。

圖1 天然產物合成生物學體系的優化策略

1 單個元件的優化

合成生物學中的元件包括核糖體結合位點（Ribosome-binding site，RBS）序列、復制起始位點、啟動子、終止子、功能蛋白等［6］。單個元件的微調能有效改善基因線路的性能，增加途徑中酶基因的表達量和生化反應的效率。

1.1 RBS優化

核糖體結合位點是調節翻譯強度的重要元件，人工設計的RBS文庫可以方便地通過引物設計和PCR擴增來實現與特定基因的連接，從而在翻譯水平上對基因的表達強度進行調節［7］。可以通過RBS計算器（RBS Calculator）［8］或者RBS 設計器（RBS Designer）［9］對RBS文庫的范圍和強度進行預測。需要注意的是，此方法一般用于大腸桿菌系統，在酵母中不適用。目前，已有研究者成功在大腸桿菌中通過修改途徑中關鍵酶的RBS優化了抗癌類化合物紫蘇醇、抗腫瘤類物質司帕霉素和脫氧紫色桿菌素在工程菌中的產量［10］。

1.2 啟動子修飾

啟動子是結構基因上游起始轉錄的一段序列。啟動子結構會影響其本身與RNA聚合酶的親和力，從而影響該啟動子對基因的轉錄效率。啟動子的強度決定了結構基因的轉錄強度［11］。對啟動子進行修飾（如對啟動子進行突變、改變啟動子序列的長度或使用強啟動子）可以調控代謝途徑中酶基因的表達效率［12］。Redding-Johanson 等［13］的實驗表明，使用強啟動子能增加甲羥戊酸激酶和磷酸甲羥戊酸激酶的表達活性，進而提高工程菌中紫穗槐-4，11-二烯的產量。Anthony等［14］通過優化啟動子的長度來平衡甲羥戊酸激酶（MK）和紫穗槐-4，11-二烯合酶（ADS）基因的表達，使抗癌藥物的前體紫穗槐-4，11-二烯（AD）的產量提高了5倍。

1.3 質粒拷貝數優化

增加基因的拷貝數是調節異源基因在底盤系統中表達最常用的工具之一。將基因克隆到多拷貝的表達質粒上增加基因的拷貝數能使基因獲得高水平表達，但會給細胞帶來更大的生理負擔，所以質粒拷貝數不是越高越好［15，16］。Jawed等［17］在大腸桿菌中建立了丁酸的生物合成途徑，他們發現質粒的拷貝數能對丁酸的產量產生影響，使用中等拷貝數的質粒能取得最好的效果，使丁酸的產量達到1.5 g/L。

1.4 密碼子優化

采用宿主偏愛的密碼子，減少或避免使用稀有密碼子是提高途徑酶基因異源表達水平的重要手段［18］。3-類固醇脫氫酶（3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase，KSDD）能將雄甾-4-烯-3，17-二酮催化為雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，由于KSDD是途徑中的限速酶，途徑重構時較低的酶活性使這步反應受到限制。Shao等［19］采用密碼子優化的方法將KSDD在枯草芽孢桿菌（ Bacillus subtilis）中的酶活性提高了7倍，達到12.3 U/mg，結合發酵條件的優化，使雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的產量達到8.76 g/L。

2 代謝途徑的系統優化

對生物合成途徑單一元件進行修飾盡管一定程度上能提高目的產物的產量，但局部的改善往往導致中間產物的積累，增加細胞負擔，甚至可能會對細胞產生生長抑制毒性，不利于目標產物的獲得。對于代謝途徑的平衡優化，主要采用一種基于全局的數學算法和生物信息分析，實現整條途徑代謝流的平衡［20］。

2.1 多元模塊代謝工程

多元模塊代謝工程（Multiple module metabolic engineering，MMME）是將整個代謝途徑分為不同的模塊，再通過系統地改造各個模塊的復制起始位點、啟動子或RBS序列來協調不同模塊的表達強度，只需少數模塊的組合，就可以在大范圍內優化代謝通途徑［21］。Wu 等［22］將松屬素合成途徑分為4個模塊，通過改變每個模塊的質粒拷貝數，限制了毒性物質肉桂酰輔酶A的積累，使松屬素的產量達到40.02 mg/L。Liu等［23］在枯草芽孢桿菌中構建了n-乙酰氨基葡糖（GlcNAc）合成途徑，并把整個途徑分為3個模塊：異源的n-乙酰氨基葡糖合成模塊、n-乙酰氨基葡糖醣酵解模塊和肽聚糖合成模塊。使用調控小RNA來抑制n-乙酰氨基葡糖醣酵解和肽聚糖的合成，通過同時平衡3個模塊中內源和外源基因的表達，使n-乙酰氨基葡糖的產量達到36.35 g/L。

2.2 多元自動化基因組工程

多元自動化基因組工程（Multiplex automated genome engineering，MAGE）是一種高通量修飾基因組的工具，能用目標序列同時替換基因組中多個位點。人工設計的寡核苷酸雙末端均帶有與基因組插入位點同源的序列，中間區域含有需要替換的DNA片段，在宿主DNA復制過程中，在λ噬菌體Red重組酶介導下進行高效同源重組［26］。由于MAGE通過啟動子替換或者核糖體結合位點序列替換這兩種方式調節基因的表達，所以寡核苷酸鏈中間區域含有啟動子序列或核糖體結合位點序列。MAGE能同時調節途徑中多個基因（＞20）的表達［27］。Sharan等［26］利用不同T7啟動子來替換吲哚合成途徑中的12個基因的啟動子，最優菌株中靛藍的產量比原始菌株提高4倍。Wang等［28］利用不同的RBS序列替換番茄紅素合成途徑中20個基因中的原始RBS序列，找到了最優的組合，使番茄紅素的產量提高了5倍。

2.3 多元循環質粒工程

與多元自動化基因組工程類似，多元循環質粒工程（Multiplex Iterative Plasmid Engineering，MIPE）也是利用寡核苷酸介導的λ噬菌體Red重組酶的同源重組，將攜帶多個基因的質粒和針對不同基因設計的多個寡核苷酸共同轉化進入宿主細胞，用寡核苷酸目的片段替換質粒上的相應區域，使質粒產生點突變。該法與限制酶切介導的共選擇（Restriction digestion mediated co-selection，RD CoS）策略相結合，每個循環用一個限制酶切位點作為共選擇標記就能用于質粒多個循環的篩選［29］。Li等［29］運用MIPE對核黃素的生物合成途徑中5個基因進行了組合優化，首先從大腸桿菌基因組中克隆出這5個基因，并連接到質粒的同一個操縱子中。然后將含有不同的核糖體結合位點的寡核苷酸混合物、攜帶基因的質粒與用于篩選的寡核苷酸共轉化大腸桿菌，質粒上核糖體結合位點區域經同源重組發生突變，經過3輪循環后，產生了1×107種組合，最后將核黃素的產量提高了2.67倍。

2.4 組合轉錄工程優化法

在真核微生物中（如釀酒酵母），運用啟動子工程能對途徑中基因進行轉錄水平的優化，通常使用隨機突變的方法來得到一系列不同強度的啟動子［30］。采用組合轉錄工程優化法（Customized optimization of metabolic pathways by Combinatorial transcriptional engineering，COMPACTER）將組裝技術成功應用于代謝途徑的組合優化，能同時調節多個酶的表達水平。該技術通過將不同強度的啟動子與不同代謝途徑的基因進行組合，再用高通量的篩選方法來構建和篩選出最高效的代謝途徑，由此實現對代謝途徑中多個基因表達強度的組合優化［31］。COMPACTER技術已經應用到酵母木糖利用途徑的3個酶和纖維二糖利用途徑中2個酶的優化，使工程菌株中纖維二糖的消耗加速了2.1倍，并且使乙醇的產量增加2.3倍［32］。

2.5 可調控基因間序列優化

通過可調控基因間序列（Tunable intregenic regions，TIGR）能在一個操縱子內對多個基因表達強度同時進行調節，且在原核生物和真核生物中都適用［33］。TIGRs由多種控制元件組成，它們是：mRNA二級結構、核糖核酸酶斷裂位點和RBS隔離序列等［34］。Pfleger等［35］在大腸桿菌中對甲羥戊酸途徑中3個基因（atoB、HMGS、tHMGR）構建TIGR文庫，優化多種控制元件，使甲羥戊酸的產量提高了7倍。采用TIGR法人工設計操縱子，能影響mRNA的穩定性或翻譯起始效率，并消除不同基因的干擾，不需要多個啟動子就能在轉錄后水平同時對多個基因的表達強度進行調節。

3 底盤系統優化

一些常見的模式微生物，如大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽胞桿菌等是近年來被廣泛使用的異源合成底盤細胞［1］。它們均具備作為一個優良底盤細胞所需的特征，如生長快速、易于基因工程操作、適合大規模培養、工業化控制簡便等。底盤細胞的初生或次生代謝產物能為異源生物合成途徑的構建提供前體，優化異源宿主能增加主流代謝途徑中的底物供應，促進途徑通量的重新分配，增加天然產物的產量。

3.1 目標代謝途徑的上調

除了增加外源基因的表達量外，使宿主內源基因的表達上調也能促進產物的生物合成。Fatma等［36］通過計算機軟件分析，在大腸桿菌中選出可能參與長鏈脂肪醛轉化為脂肪醇的35個內源性酶。研究發現敲除YbbO基因會使脂肪醇的含量下降90%，證實該基因在脂肪醇合成中具有重要作用。通過優化YbbO基因的表達，使長鏈脂肪醇的產量達到169 mg/L，此外，通過調節脂肪酸和磷脂的生物合成使脂肪醇的產量進一步增加60%。通過調節途徑中的轉錄因子也能使目標代謝途徑上調，Santos等［37］使用全轉錄工程法（Global transcription machinery engineering，gTME），對rpoA和rpoD轉錄因子進行突變，使酪氨酸的產量達到13.8 g/L。

3.2 競爭性代謝途徑的抑制

下調或阻斷競爭性代謝支路能夠限制或減少流入競爭代謝途徑中的底物供應，從而維持重要前體或中間產物在底盤細胞中的含量。可以通過基因敲除或使用弱啟動子來抑制或下調競爭代謝途徑以獲得更多的前體，促進途徑通量的重新分配［40］。Paradisee等［41］通過敲除競爭性甾體合成途徑中的ERG9基因，減少進入甾體生物合成途徑中的 FPP代謝流，從而使進入青蒿酸生物合成途徑的 FPP流量增加，進而增加了目的產物AD和青蒿酸的產量。Westfall等［42］采用多種策略來提高丙二酰輔酶A在大腸桿菌中的含量，例如過表達乙酰輔酶A合酶基因和敲除競爭途徑，通過消除丙二酰輔酶A降解途徑，最終使丙二酰輔酶A在胞內的產量提高了15倍。有時同一個前體可能同時作為不同次生代謝途徑中的底物用于不同產物的合成，如纈氨霉素和菌絲霉素合成途徑競爭一個共同的前體物質2-酮異戊酸，通過使菌絲霉素合成的基因簇和相關基因失活，纈氨霉素的產量比野生型菌株提高了4倍［45］。

3.3 底盤基因組的簡化

理想的底盤細胞應該具有最小化基因組，即維持細胞的生長繁殖所必須的最少基因（必需基因）。基因組的適當精簡將為重要天然產物的異源生物合成提供理想的底盤細胞。基因組的簡化可使細胞代謝途徑得以優化，不僅能改善細胞對底物、能量的利用效率，更好地耐受引入的各種酶和代謝產物的代謝負擔；還能更好地保持外源基因網絡，大大提高細胞生理性能的預測性和可控性［46］。采用CRISPR-Cas9技術、多元自動化基因組工程、基于位點特異性重組酶的同源重組等基因組編輯技術，能在基因組范圍內對任意的多個位點進行同步修飾，實現底盤細胞的改造［47］。2010年，Komatsu等［48］利用阿維鏈霉菌（S. avermitilis）宿主分別異源重構了鏈霉素和頭霉素C基因簇，阿維鏈霉菌的基因組大小為9.02 Mb，采用雙交換重組與位點特異性重組技術將阿維鏈霉菌染色體左端亞端粒區域與次生代謝產物合成相關的基因與轉座子酶基因刪除（共約1.4 Mb），得到了一系列突變菌株。鏈霉素是一種氨基糖苷類抗生素，可由灰色鏈霉菌（S. griseus）產生，但是阿維鏈霉菌不能合成，故將灰色鏈霉菌中鏈霉素生物合成的基因簇（約41.2 kb）導入阿維鏈霉菌野生型和突變菌株，結果發現基因組簡化后的突變菌株中鏈霉素含量明顯高于野生型阿維鏈霉菌菌株；頭霉素C是一類β內酰胺類抗生素，將棒狀鏈霉菌（S. clavuligerus）中的頭霉素C合成相關的基因簇（約35 kb）導入阿維鏈霉菌菌株，結果也和前述一致，進一步證明了宿主基因組簡化的重要性。由于基因組簡化后的鏈霉菌菌株刪除掉了多種主要的內源性次生代謝產物相關的基因，積累了更多的前體可用于鏈霉素或頭霉素C的合成，故產量得到提高。2013年，該課題組又將20多個基因簇引入阿維鏈霉菌，大部分實現了產物的成功表達，證明了阿維鏈霉菌擁有作為次生代謝產物通用宿主的潛能［49］。

4 發酵條件優化

除了對代謝途徑自身進行優化外，發酵條件對異源宿主中目標產物及其前體的產量也有很大影響。即使天然產物工程菌的性能優良，如果缺乏合理的發酵工藝也不能將其潛力發揮到極致［50］。通過前體飼喂、培養基優化、溫度控制和誘導物添加等方式均能有效增加菌株中目標產物的產量。

4.1 前體飼喂

前體飼喂是提高目標產物產量的最有效的方法之一［51，52］。前體或中間產物的有效供應是天然產物的合成和生產的先決條件，前體的增加對于次生代謝產物的積累有促進作用，通過中間產物的添加，降低中間產物合成的能量消耗，從而促進代謝流向目標產物［53］。Dhakal等［54］在諾卡氏菌中重構了阿根諾卡菌素途徑，通過飼喂前體物質脯氨酸與葡萄糖并調節飼喂時間，阿根諾卡菌素的產量達到84.9 mg/L，與沒有飼喂前體的菌株相比，增加了24倍。

4.2 培養基優化

目前發酵產品的大規模工業化生產多采用液體培養基進行深層發酵。使用的培養基必須滿足微生物生長、繁殖的需要，有利于微生物大量合成有機物［55］。培養基成分對工程菌發酵具有重大影響，不同的生物合成途徑采用不同的碳源進行發酵，常用的碳源有：葡萄糖、木糖、甘油和酵母提取物等［56］。Westfall等［42］研究發現，將乙醇和葡萄糖作為培養基的混合碳源時，發酵產生的紫穗槐-4，11-二烯產量顯著增加，而將碳源變成半乳糖時，發酵產物中的青蒿酸產量上升明顯。

4.3 溫度控制

每種微生物都有最適生長溫度，對于某種特定的微生物而言，只能在一定的溫度范圍內生長，微生物的不同生理活動也需要在不同的溫度條件下進行，所以發酵速度、生長速率和代謝產物積累的最適溫度往往不同［57］。例如，乳酸鏈球菌在40℃時發酵速度最快，在34℃時繁殖速度最快，25-30℃時細胞產量最高［58］。所以，研究不同微生物在生長或積累代謝產物階段時的最適溫度，對于用變溫發酵來提高發酵生產效率具有重要意義。

4.4 誘導物添加

誘導物的種類、濃度和誘導起始時機、誘導時間均能影響產物的產量［59］。因此，兼顧工程菌生理狀態和增殖能力選擇適當的誘導時機、誘導物用量和誘導時間，能夠有效增加工程菌中外源途徑蛋白的表達，提高目標產物的產量。Sassi等［60］利用解脂耶氏酵母作為細胞工廠生產重組蛋白，油酸能作用于誘導型啟動子pLIP2控制基因的表達，把油酸與葡萄糖的混合物（3∶2）添加到培養基中，重組蛋白的產量增加了10倍。

5 總結與展望

表1總結了近年來在天然產物合成生物學體系優化研究領域的主要進展。在體系優化過程中，一個途徑中取得最大產量的方法可能在另一個途徑中并不適用，找到正確的優化方法是增加產量的關鍵。可以選擇一種適合高效的優化技術或是將不同技術相結合，以此來取得產量最大化，為大規模工業化生產奠定基礎。例如，Alper等［61］將基因敲除技術與gTME方法相結合來優化番茄紅素的產量。

質粒拷貝數優化、啟動子替換、核糖體結合位點優化、密碼子優化是常用于提高基因表達水平的方法，已在多個天然產物的途徑優化中得到應用（表1），盡管單一元件的修飾一定程度上能提高目標產物的產量，但天然產物代謝途徑通常相對復雜，包含多個關鍵酶基因與調控基因，對單個元件的修飾可能只會增加部分酶的表達量，對整個代謝途徑的影響不明顯，甚至中間產物的過度積累有時可能會使細胞產生毒性反應，影響細胞正常的生長和繁殖；而采用組合優化的方法對途徑中多個元件進行同時調節能有效避免這種情況的發生。如果目標產物的合成途徑涉及的基因數目不多，可以嘗試優化可調控基因間序列，將途徑中幾個基因置于一個操縱子內，進行協同控制；當途徑復雜，涉及多個代謝支路，可以使用多元模塊代謝工程、多元自動化基因組工程、多元循環質粒工程等方法同時修飾多個元件，使整體的代謝達到平衡，以獲得異源合成體系的最優化［62］。

表1 天然產物合成生物學體系的優化研究進展

途徑的異源重構常用的工程化宿主有：大腸桿菌、釀酒酵母、鏈霉菌等，宿主中存在的內源性初生代謝途徑能為目標次生代謝產物的合成提供前體物質［10，63］。通過對宿主初生代謝途徑進行調節，并與引入的外源代謝途徑之間達到平衡，以獲得更多的前體物質。刪除異源宿主中與目標化合物合成不相關的非必需基因，例如轉座子和插入序列基因和次生代謝產物基因簇相關的基因，可以提高細胞的遺傳穩定性，減少代謝負擔［63］。

目前，途徑優化還存在一些瓶頸：首先，途徑中不同的基因與方法（例如使用不同拷貝數、啟動子和RBS長度）的組合多樣，即使是一個小型途徑，要找到最優的組合也費時費力。但幸運的是，大型文庫的高通量篩選、動態平衡系統和計算機輔助的建模方法進展迅速，極大地促進了途徑優化進程。其次，將小規模體系按比例擴大用于目標產物高細胞密度的大規模發酵時，可能會導致系統通量的不平衡，小規模體系所用的發酵條件（如溫度、氧氣飽和度、細胞密度等）需要進行大幅度的改變，以適應產物工業生產的需要。令人振奮的是，最近出現了多種可用于天然產物生物合成研究的新技術和新方法，如生物傳感器用于途徑的實時監控，使微生物系統達到動態的平衡［64］；CRISPR-Cas9介導的基因組工程技術用于調節基因的強度［65］；使用合成支架或融合蛋白實現多個酶空間結構的合理優化［66］、對代謝產物和途徑酶進行細胞器水平的區室化，以實現底物和酶的充分利用等［67］。可以預見隨著合成生物學理論和技術的快速發展，在不久的將來會開發出更高效的工程工具，用來優化天然產物合成生物學體系，從而實現復雜天然產物的工程化生產。

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（責任編輯 馬鑫）

Optimization Strategies for Synthetic Biological Systems of Natural Products

KUANG Xue-jun1ZOU Li-qiu1SUN Chao1CHEN Shi-lin2
（1. Institute of Medicinal Plant Development，China Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100193；2. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700）

Natural products have become an important source of new drugs. However，there are some deficiencies while producing complex natural products by classical organic synthesis，one measure to efficiently make up those deficiencies is to apply synthetic biology in the biosynthesis of natural product，i.e.，designing and reconstructing efficient biosynthetic pathways of target compounds，re-engineering it in host cells，and producing target compounds by fermentation. However，achieving the yield of target product to the industrial level through technology of synthetic biology is still very challenging though there have been advances in synthetic biology. Here，we review various pathway optimization strategies for the synthetic biological systems of natural products. Via optimization technologies of fine-tuning individual component，exogenous metabolic pathways，the chassis systems，and fermentation conditions，the synthetic biological system may be optimized，and the yield of target product may be maximized，thus providing continuous，stable and economical raw material supplies for the manufacture of complex natural products while source is rare，and promoting the research and development of new drugs similar to natural products

natural products；synthetic biology；optimization；chassis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.005

2016-10-22

國家自然科學基金面上項目（81273485，81573704）

匡雪君，女，碩士研究生，研究方向：天然藥物的代謝工程與合成生物學；E-mail：kuangxuejun@126.com

孫超，男，博士，教授，研究方向：基于組學分析的藥用植物有效成分生物合成途徑解析及天然藥物的代謝工程與合成生物學；E-mail：csun@implad.ac.cn；陳士林，男，博士，E-mail：slchen@icmm.ac.cn