微生物系統定向進化與合成生物學應用研究進展

郭園趙仲麟（. 內蒙古農業大學職業技術學院，包頭 0409；. 河南農業大學理學院，鄭州 45000）

微生物系統定向進化與合成生物學應用研究進展

郭園1趙仲麟2
（1. 內蒙古農業大學職業技術學院，包頭 014109；2. 河南農業大學理學院，鄭州 450002）

當前，生物技術應用常常需要對多基因性狀進行復雜的工程化改造，然而復雜表型的遺傳基礎背景的缺乏限制了人們進行理性設計的能力。人們利用合成生物學工具可以對復雜表型在系統水平進行工程化改造，通過定向進化策略推動整個生物系統的進化，在不知道目標性狀的遺傳基礎的情況下仍可以獲得人們所期望的表型。合成生物學的發展加速了生物的定向進化過程，利用其可以對生物系統中復雜性狀進行工程化改造。對當前合成生物學在微生物系統中復雜性狀定向進化的研究進展進行綜述。

合成生物學；微生物系統；定向進化；應用

微生物在當今人們的生活中扮演著重要的角色，在食品、制藥、醫療、石化、農業及生物修復等領域中應用十分廣泛。越來越多的復雜應用需要更精巧的設計，往往需要考慮多種表型的優化，耐受性、途徑流量、生長率等受多個基因及其與環境因子的相互作用的控制。缺少對復雜性狀遺傳基礎的認知，限制了人們進行合理設計微生物的能力。操縱這些復雜性狀的備選方法是在系統水平進行工程化改造［1］，在不知道其機制的情況下，就可以使生物系統實現人們所期望的表型。

合成生物學是生命科學的工程化過程，合成自然界不存在的生物體系，并對現有的生物體系進行重新設計，目標是生產新的化學品、改善人類健康及解決環境問題等［2］。合成生物學工具包括生物部件、器件、模塊、系統四部分，通過對這些元件逐級設計構建組合具有特定功能的生物系統。利用這些工具，人們可以構建非天然的基因調控模塊來設計構建細胞生命活動的分子網絡，類似于工程學中的線路設計，因此也稱為基因線路（genetic circuit）。近些年來，科學家已構建了很多基于微生物轉錄和代謝復雜系統的合成生物學器件（圖1）。

圖1 基于基因表達的合成生物學器件

生物技術當前的發展趨勢是在系統水平對微生物進行工程化改造，研究主要集中在定向進化、代謝工程和合成生物學領域。已成功應用于基因、代謝途徑和基因組水平，通過設置不同階段探索多種復雜的功能。本文討論了一些通過微生物系統工程化實現復雜性狀的策略，對當前合成生物學用于微生物系統工程化研究進展進行綜述。

1 微生物系統復雜性狀的定向進化

復雜性狀的工程化可以通過定向進化的策略來實現［3］，通過多種控制設置模擬自然進化過程，達到人們所需的表型。自適應實驗室進化技術（Adaptive laboratory evolution，ALE）就是其中一個例子，在特定選擇條件下對微生物進行培養，經過數百代的培養后就可實現表型改進的進化［4］。例如，溫度耐受是一個典型的復雜性狀，人們對其遺傳基礎知之甚少，Tenaillon等［5］利用ALE方法進行了大腸桿菌的溫度耐受進化研究。另外，許多利用ALE方法對大腸桿菌和酵母菌進行工程化改造的研究，成功地提高了生物燃料或化學品的產量和產率［6-8］。

定向進化策略通常依賴于人工選擇壓力和多代循環擴增來改進突變體，最終得到所需的復雜表型。其成功與否主要取決于兩點因素，即產生功能多樣化突變體的能力以及鑒定出真正表型改進突變體的篩選方法。近些年來，合成生物學領域的發展迅猛對定向進化策略做出了重要貢獻，其領域的目標是設計、構建和改進自然界不存在的生物組分及系統［9］。合成生物學已發展出了很多可以加速定向進化的工具，可提高產生多樣性子代的效率，同時也可以擴展篩選或選擇范圍。

2 遺傳多樣性的實現策略

多樣性是進化的基礎，多樣性程度越復雜，得到復雜的表型的可能性就越大。目前有很多種增加遺傳多樣性的方法被用于定向進化中。例如，易錯PCR法［10，11］和定點突變法等。易錯PCR法利用低保真性的聚合酶，而定點突變法則需要預先知道目標的結構信息，在特定位點進行密碼子突變以改善活性［12］。Bastian［13］利用定點突變的方法開關異丁醇生產中兩個關鍵酶的輔因子，通過消除菌株的輔因子失調，最大限度地提高異丁醇生產理論產量。Firnberg等［14］發展出一個定點突變的改進方法，稱為PFunkel。該方法允許在多個位點同時生成多個自定義文庫。他們利用這個策略構建了一個完整的β-內酰胺酶基因密碼子取代文庫，用于識別一個與臨床抑制劑抗性相關的突變。

現代合成生物學工具可以有效的增加遺傳多樣性，向人們所期望的目標實現加速進化。使用多重自動基因組改造技術（Multiplex automated genome engineering，MAGE）可以在大腸桿菌靶位點增加多樣性（圖2）［15］。在單鏈DNA寡核苷酸上進行染色體編輯，在系統規模的多個層面上生成組合多樣性。MAGE技術已成功用于大腸桿菌基因組的代謝途徑優化［15-19］，演化的MAGE方法也已被用于釀酒酵母的研究中［20］。

多樣性也可以通過基因組改組的方法實現［21］，基因組改組與經典突變篩選相比，可極大的加快進化速度，已被廣泛用于各種生物體的進化［22］。合成生物學工具中最新增加的技術是成簇規律間隔短回文重復序列系統（CRISPR），該技術可以對多種生物進行基因組編輯［23，24］，能夠通過改變表達水平來增加多樣性［25，26］，是當今研究的熱點。另外，多樣性也可以通過精確基因組編輯，即同源重組方法實現［27］，如同飽和突變研究一樣［28，29］。CRISPR-Cas已被用來進行從點突變對整個代謝途徑進行理性設計編輯［30］。現代合成生物學工具還可以利用非標準氨基酸使蛋白質進化出新的催化功能［31］，或是建立完全正交核糖體-mRNA系統［32］，用于核糖體功能的探索或工程化具有新的功能的核糖體。CRISPRCas技術還可以從目標樣本或宏基因組樣本中高效導入異源功能［33-35］。

圖2 多重自動基因組改造技術［15］

3 復雜性狀的篩選與選擇

合成生物學工具可以使人們得到更多突變體，有效的增加種群多樣性。定向進化應用的關鍵是如何在一個群體中篩選或選擇到改進的突變體。如果目標性狀個體數量增加則可以通過生長選擇方法得到目標，比色法或流式細胞儀細胞分選法可以用于篩選［36］，但篩選方法只能用于有限的一些目標性狀。合成生物學通過開發新的工具，擴大了特征譜，以便進行選擇或篩選，從而解決上述問題。

合成生物學通過開發生物傳感器，檢測熒光蛋白觸發表達或通過抗生素抗性基因進行篩選或選擇過程。大多數生物傳感器是基于轉錄因子和同源啟動子對原理［17，37］，也有一些是基于RNA的檢測方法［38］。新型生物傳感器包含RNA傳感器和蛋白質的傳感器［39，40］，這些生物傳感器可用于優化整個代謝通路和基因簇。例如，Raman等［17］使用MAGE技術生產全基因組靶向多樣性，采用基于生物傳感器的選擇策略，通過該方法分別將目標產物柚皮素和葡糖酸產量增加了36倍和22倍。

生物傳感器還可以與基因線路整合，以擴大輸入的復雜性，同時連接所需輸出［41］。更加復雜的基因線路可以通過兩種方式提高篩選和選擇能力：第一，一個單一的輸入可以連接到多個輸出（圖3-A），在這種情況下目標性狀可能觸發級聯調控網絡，重新連接到有目標表型的細胞，最終進行篩選或選擇。當達到足夠的細胞濃度，重組細胞代謝在一個特定的輸入下可以生產異丙醇［42］；第二，多個輸入可以通過邏輯門連接到一個單一輸出上（圖3-B）［7］，導致增加的特異性表型的篩選。Hoynes-O'connor等［43］用RNA熱敏元件構建3輸入的基因線路，構建出可觸發GFP的表達的熱敏傳感器。

圖3 基因線路

另一種有效的選擇策略是適當增加目標性狀。噬菌體輔助連續進化技術（Phage-assisted continuous evolution，PACE）使用修飾的M13噬菌體循環，使目標性狀與感染所需的噬菌體蛋白表達相關［44］。通過讓生物分子的實驗室進化和噬菌體的生命周期結合在一起，讓蛋白質在每24 h內進化60輪。PACE的效率是傳統實驗室進化方法的100倍左右，整個實驗過程無需人為干預，大大節省了人力勞動成本。這個系統使用大腸桿菌的宿主細胞作為制造噬菌體的細胞工廠，利用噬菌體基因編碼使生物分子繁殖，生成所需要的蛋白質，進行持續多輪的進化。最近研究人員還對PACE技術進行了改進，包括調整選擇強度、對不需要的突變體進行負向選擇等［45］。

4 合成生物學在系統水平的應用

有了高效的多樣性產生方法和篩選或選擇策略，人們即便不完全了解某些微生物的遺傳背景，仍然可以在系統水平上完成復雜的性狀定向進化研究。新方法的產生使得生物技術將在不久的將來能夠解決更多的問題。定向進化和合成生物學手段已經越來越多地應用于微生物的系統水平上。通過引入非標準氨基酸，蛋白質能夠進化出自然界沒有的新功能。例如，Xiao等［46］利用非標準氨基酸得到一個催化效率改進的內酰胺酶，而如果利用標準氨基酸突變方法則無法實現。利用生物系統還可以探索新的化學組成和性質，而代謝途徑中的新功能則可以實現全新的應用，通過如MAGE或CRISPR-Cas等手段結合高效的篩選或選擇方法進行優化［27］。另外，新近發展出的諸如ePathBrick和CasEMBLR等方法則可以進行快速通路組裝并測試所期望的功能［47，48］。因此，復雜的新功能可以使用合成生物學和定向進化工具在代謝途徑水平進行工程化改造。

目前，如何處理細胞內的復雜調節是代謝途徑水平工程化的一個難題，而很多情況往往是未知的。如今模塊化的工程概念已被應用到合成生物學中，可以部分解決這個問題［49-51］。例如，Xu等［52］將脂肪酸生物合成分列在3個不同的模塊中，可以有效優化大腸桿菌生產水平。通過優化每個模塊的轉錄和翻譯水平，通過平衡中間體的生產和消耗來消除生產瓶頸，當前這些模塊化工程策略已經被大規模應用。此外，為克服天然調控機制，Temme等［53］在產酸克雷伯菌中重構了一個23.5 kb的固氮基因簇，重構的基因簇由特征顯著的啟動子和核糖體結合位點等合成元件所控制，重構后人們可以將一些功能基因簇轉移到大腸桿菌中。如萊因衣藻光的系統II 重構，證實了種內交換的可行性［54］。重構策略的另一個十分有前景的應用是小分子組合生物合成［55］，這些分子庫可能成為未來新一代療法。

基因組規模的工程化是合成和系統生物學的前瞻性應用。Ma和Isaacs等［56］開發出分級結合組裝基因組工程策略——CAGE，可以將不同大腸桿菌菌株的基因組中的區域整合組裝形成一個嵌合體基因組（圖4），允許大規模的特異基因組區域轉移，無需體外操作就能實現體內染色體的精確操控 。利用靶點編輯工具改變遺傳密碼，將這些密碼子修飾組合并入到基因組中，通過這種方法能夠測量重組頻率，確認活性，并確定相關的表型［18］。

圖4 分級結合組裝基因組工程策略［56］

其中一個典型的例子是通過改變遺傳密碼來設計一種依賴于非標準氨基酸的代謝，利用合成蛋白設計來進行轉基因生物控制［57］。另外，有效的DNA的組裝方法加上逐漸降低DNA合成成本，使得科學家可以從頭合成整個基因組［58］。探索合成重構基因組的復雜性降低將有利于人們進一步研究和操縱這些系統。2014年，Annaluru等［59］全合成了一個功能完整的酵母染色體，未來人們可以利用從頭合成技術和計算機輔助設計工具重構合成染色體和基因組［60］。而這些進展為未來的理性設計和基因組訂制奠定了基礎，給生物技術和生物科學研究帶來革命性的變革。然而，基因組設計及引導基因組進入細胞的規則尚未闡明，是目前科研人員遇到的最大障礙。

合成生物學技術還可以用于多細胞水平，工程化的微生物菌群可以通過分工擴大代謝能力，減少許多純培養的限制因素，如代謝負擔或有毒中間產物的積累等。這些可以通過代謝互養或基于群體感應信號分子的基因線路來實現有效的細胞間的通訊［61，62］。一個標志性的研究工作是利用工程真菌細菌菌群從纖維素生物質中直接生產異丁醇［63］，而最近大腸桿菌共培養的方法也被用于從葡萄糖/木糖混合物中生產復雜的對羥基苯甲酸和黏康酸［64］。一些與人類健康相關的生物技術應用也證實了預測和工程化的復雜生物之間的相互作用是可行的。腸道微生物工程菌群就是一個非常有前途的領域，未來能夠治療大范圍的人類疾病。在這之前，仍然需要科學家發展多種非模式生物相關的合成生物學工具，并且對腸道微生物的相互作用機制有更深刻的了解。

5 展望

設計復雜的多基因表型的能力是很多生物技術研究努力的方向，同時也正制約著這個領域的發展。將現代合成生物學工具與定向進化和代謝工程相結合，通過操縱越來越復雜的性狀，可以讓生物系統作為一個整體進行工程化改造。通過這些技術，人們可以對復雜的系統和性狀進行工程化改造，這將會推動新生物技術在多個工業部門間的應用。利用合成生物學工具可以快速和有效的產生理性多樣性，加速定向進化周期。此外，更多新型生物傳感器和基因線路研發將大大提高改進突變體的篩選和選擇能力，進一步加快人們對其他生物進行定向進化能力，大幅增加生物技術設計的復雜性。

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（責任編輯 馬鑫）

Advances on Applications of Synthetic Biology and Directed Evolution in Microbial Systems

GUO Yuan1ZHAO Zhong-lin2
（1. Vocational and Technical College，Inner Mongolia Agricultural University，Baotou 014109；2. College of Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002）

Nowadays，there are needs to engineer complex multi-genic traits in modern biotechnology applications；however，our capability to rationally engineer them is limited by the lack of knowledge on the genetic basis of complex phenotypes. Using synthetic biological measures，complex phenotypes can be engineered at the systems level，and via directed evolution strategies the whole biological system may be driven toward desired phenotypes without requiring the knowledge of the genetic basis of the targeted traits. The latest developments in the synthetic biology accelerate the directed evolution cycle，facilitating engineering of increasingly complex traits in biological systems. Herein，the recent advances on synthetic biology in directed evolution of complex traits in microbial systems are reviewed.

synthetic biology；microbial system；directed evolution；application

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.008

2016-10-18

郭園，女，碩士，講師，研究方向：微生物與免疫；E-mail：guoyuan_2003@163.com

趙仲麟，男，博士，副教授，研究方向：化學生物學、分子生物學；E-mail：rayzzl@163.com