釀酒酵母人工雜合啟動子與天然啟動子活性比較

唐瑞琪熊亮白鳳武，趙心清（. 上海交通大學生命科學技術學院，上海 0040；. 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 603）

釀酒酵母人工雜合啟動子與天然啟動子活性比較

唐瑞琪1熊亮2白鳳武1，2趙心清1
（1. 上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240；2. 大連理工大學生命科學與技術學院，大連 116023）

系統地比較了人工啟動子PaTEF1與天然啟動子PTEF1和PTDH3在不同條件下的活性差別，結果表明，人工啟動子PaTEF1的活性并不是在任何條件下都高于天然啟動子的活性，而與宿主、培養基以及細胞生長階段有關。在3個宿主背景中，BY4741中PaTEF1的活性最高，而LX03中最低。在YPD100中，人工啟動子PaTEF1活性分別為天然啟動子PTEF1和PTDH3活性的1.4-4.6倍和0.9-2.0倍；而在YPE（5%和7%）中，PaTEF1活性與PTEF1和PTDH3活性之比在0.7-1.3以及0.8-1.3之間。在YPE中培養時，PaTEF1的活性為在YPD100中培養時的1.7-2.0倍，PTEF1和PTDH3的活性在YPE中為YPD100中培養時的2.7-7.1倍和1.3-3.4倍，啟動子在YPE中的活性較YPD100中更高，但人工啟動子的活性變化較天然啟動子更小。此外，在不同遺傳背景的菌株中，啟動子活性從對數期早期到對數期中期和從對數期中期到穩定期的變化趨勢不同。

釀酒酵母；人工雜合啟動子；TEF1啟動子；宿主菌株；環境條件

釀酒酵母是目前最常用的生產生物燃料和生物基化學品的底盤細胞之一。作為重要的細胞工廠，對釀酒酵母細胞中代謝通路進行精細調節對于提高生物產品的產量、產率和生產強度至關重要［1］。啟動子作為轉錄調控以及合成生物學的重要元件，被廣泛應用于基因表達的研究和菌株構建中。天然的啟動子主要可以分為組成型啟動子和誘導型啟動子兩類，前者能維持恒定的基因轉錄水平，而后者的表達則依賴于特殊誘導劑的添加［2］。研究者們鑒定了許多不同的啟動子，包括天然啟動子和啟動子的突變體［3，4］。研究表明，啟動子中的元件可以作為模塊進行合成生物學改造來調節啟動子的表達強度，通過將不同的上游增強元件（UASCLB和UASCIT）與不同的天然啟動子核心（PGPD、PCYC、PTEF和PLEUM）串聯，得到的雜合啟動子的活性是相應的天然啟動子活性的1.63-10.02倍［5］。作為一種新的遺傳操作元件，人工啟動子的高強度和穩定性對于精細調節細胞中關鍵途徑的表達具有重要意義。

目前發表的大部分研究結果傾向于創造更高的啟動子多樣性，然而，研究個別啟動子在不同條件下的啟動活性同樣重要。啟動子的活性會受到多種環境因素的影響，例如，釀酒酵母多個啟動子在不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖和乙醇）中的活性具有顯著差異［6］。當細胞處在不同的生長時期時，啟動子的活性也略有不同。此外，啟動子在碳源轉換期（diauxic shift）的活性也存在明顯差異［6］?；虻淖顑灡磉_水平在不同宿主菌株中也不盡相同，并受到宿主遺傳背景的影響［7］。

葡萄糖是細胞工廠生產目標產物時最常見的碳源，隨著發酵的進行，當葡萄糖耗盡之后，細胞轉換為利用培養基中其他碳源的模式。乙醇既是釀酒酵母乙醇發酵中的主要代謝產物，在發酵后期乙醇也可能被當做支持菌株生長的碳源。在某些高附加值產品的生產過程中，乙醇也被用作生產碳源，例如，以乙醇作為碳源有利于青蒿素的生產［8］。高濃度乙醇也對宿主菌株產生明顯的抑制作用［9］，因此，研究不同濃度乙醇存在條件下啟動子的活性具有重要參考價值。

雖然目前已經有不少關于啟動子在不同碳源和不同細胞生長時期的研究，但是大部分研究只對單一宿主中或單一條件下的不用啟動子活性進行了比較，沒有同時比較不同宿主、不同培養基以及不同細胞生長階段的啟動子活性的研究。此外，現有對人工啟動子和天然啟動子活性比較的研究還非常少。本研究選取了由3個串聯的上游增強元件UASCLB和TEF1啟動子核心組裝而成的人工啟動子P［10］aTEF1與天然啟動子進行了比較，研究人工啟動子PaTEF1與天然啟動子PTEF1以及PTDH3在不同宿主及同一宿主不同細胞生長階段或者不同培養基條件下的活性差別，為進一步應用釀酒酵母人工啟動子進行合成生物學研究以及人工啟動子的生物技術應用和進一步改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物 本研究所用到的菌株、質粒和引物，如表1-表3所示。

1.1.2 培養基 LB培養基：5 g/L酵母浸粉，10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl；YPD100培養基：10 g/L酵母浸粉，20 g/L蛋白胨，100 g/L葡萄糖；YPE培養基含10 g/L酵母浸粉和20 g/L蛋白胨，5% YPE和7% YPE分別加入5%（V/V）和7%（V/V）的無水乙醇；YPD活化培養基：10 g/L酵母浸粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖。固體培養基添加瓊脂粉至20 g/L。大腸桿菌轉化子篩選時添加100 mg/L氨芐青霉素；釀酒酵母轉化子篩選和細胞培養時添加200 mg/L潮霉素。

1.2 方法

1.2.1 報告載體的構建 首先以pKT127為模板，yEGFP-F/R為引物PCR擴增得到帶多克隆位點Linker和ADH1終止子序列的yEGFP片段，經Xma I/Kpn I雙酶切后連接到用相同酶處理的pRS41H載體中，得到載體pRS41H-yEGFP。以S288c基因組為模板，PTEF1-F/R和PTDH3-F/R為引物分別進行PCR，擴增得到PTEF1和PTDH3啟動子片段；以p416-UASCLB（3X）-PTEF為模板，PaTEF1-F/R為引物PCR擴增得到PaTEF1啟動子片段。人工啟動子PaTEF1比野生型PTEF1多了3個重復的CLB2啟動子激活序列UASCLB，該序列位于基因CLB2起始密碼子上游-867至-627，長度為240 bp［5］。將上述啟動子片段通過相應的酶切位點連接到pRS41H-yEGFP，得到相應的報告載體 pRS41H-PTEF1-yEGFP、pRS41H-PTDH3-yEGFP和pRS41H-PaTEF1-yEGFP。

1.2.2 菌株的構建和篩選 將測序驗證正確的啟動子報告載體及其空載（pRS41H-yEGFP）通過醋酸鋰轉化法［14］分別轉化到釀酒酵母BY4741、Ethanol Red和CEN.PK 113-5D LX03（下文簡稱LX03）菌株中。在含有200 mg/L潮霉素的抗性YPD固體培養基中篩選轉化子。挑取單菌落，在含有200 mg/L潮霉素的YPD培養基中擴大培養，含有啟動子的轉化子通過熒光顯微鏡檢測細胞GFP熒光?？蛰d體的轉化子在含有200 mg/L潮霉素的YPD中培養后提取質粒，轉化大腸桿菌并進一步驗證質粒的序列。

表1 本研究所用的菌株

表2 本研究所用的引物

表3 本研究所用的質粒

1.2.3 釀酒酵母細胞培養 為了高通量檢測不同宿主以及不同培養基中的啟動子活性，本研究采用方形U底全擋板24孔板（常州英德生物科技有限公司，YD010124B），在30℃和200 r/min條件下，對上述12個釀酒酵母菌株進行培養。培養體積為3 mL，并比較了各菌株在YPD100、5% YPE和7%YPE三種培養基條件下的生長和啟動子活性。取在-80℃甘油管中保存的菌在5 mL YPD活化培養基中培養過夜后，將活化后的菌液按初始OD600為0.2轉接至上述培養基中進行培養，并取樣檢測細胞生長及啟動子活性。每個菌株在培養和檢測時設置兩個平行。1.2.4 細胞生長的測定 每隔12 h（YPD100）或24 h（YPE）取0.1 mL不同培養基中培養的菌液，稀釋到合適濃度后，用酶標儀（Thermo-Fisher ScientificTM，MultiskanTMGO，MA，USA），在600 nm波長下檢測細胞濃度。

1.2.5 GFP熒光檢測 取24孔板中培養的菌液0.1 mL，在4℃下3 000 ×g離心3 min收集細胞，用1 mL預冷的ddH2O洗滌細胞，離心后棄上清并用預冷的ddH2O重懸細胞至適合流式細胞儀檢測的濃度。通過流式細胞儀（BD FACSAria II?，NJ，USA）檢測單個細胞中yEGFP的熒光強度，進而對啟動子強度進行分析。yEGFP熒光通過藍光（488 nm）激發，用530/30規格的濾光片檢測。每份樣品（細胞懸液）共收集50 000個細胞進行檢測和統計。通過前向散射光檢測器（FSC-A）和側向散射光檢測器（SSC-A）對細胞大小進行檢測。GFP熒光與細胞的大小有關，本研究根據Peng等［6］描述的方法進行校正。

2 結果

2.1 報告載體和菌株的構建

根據1.2.1所描述的方法，構建得到不含啟動子的pRS41H-yEGFP載體和含有3種不同啟動子的報 告 載 體：pRS41H-PaTEF1-yEGFP、pRS41H-PTEF1-yEGFP和pRS41H-PTDH3-yEGFP（圖1）。將上述4個載體分別轉化釀酒酵母BY4741、Ethanol Red和LX03菌株，得到表1所示的12個報告載體過表達菌株，并用于后續研究。

圖1 報告載體示意圖

2.2 細胞生長的比較

釀酒酵母BY4741、Ethanol Red和LX03菌株在YPD100、5% YPE和7% YPE條件下的生長情況如圖2所示。YPD100中培養的各個菌株無明顯延滯期，在36 h之后進入穩定期，BY4741背景的菌株生長速率顯著低于以另外兩個菌為宿主的菌株，而以Ethanol Red為宿主的菌株生長速率略高于以LX03為宿主的菌株。同時，5% YPE和7% YPE中BY4741背景的菌株生長速率也要慢于以Ethanol Red或LX03為宿主的菌株，但LX03背景的菌株生長速率略快于以Ethanol Red為宿主的菌株。

2.3 各菌株在不同條件下的啟動子強度

菌株在不同培養基中生長情況不同，因此經過預實驗確定各個菌株在3種培養基中培養時的生長時期，并按照1.2.5描述的方法檢測細胞熒光。

釀酒酵母BY4741、Ethanol Red和LX03菌株在YPD100、5% YPE和7% YPE條件下的GFP熒光強度如圖3所示。含有空載體的菌株檢測到的熒光強度幾乎可以忽略不計，因此細胞中的熒光強度直接反映相應的啟動子強度。在YPD100中3種遺傳背景的菌株的人工啟動子PaTEF1活性均高于天然啟動子PTEF1活性，前者是后者的1.4-4.6倍；而BY4741、Ethanol Red和LX03菌株的PaTEF1活性分別是PTDH3活性的0.93、2.03和1.14倍。在5%和7% YPE中，LX03背景的菌株中PaTEF1活性較PTEF1更高，較PTDH3更低；而Ethanol Red背景的菌株中PaTEF1的活性較PTEF1更低，較PTDH3更高，BY4741背景的菌株中PaTEF1的活性較PTDH3更高，與PTEF1相比則是有高有低；3個菌株在YPE培養基中的PaTEF1活性與PTEF1和PTDH3活性之比分別在0.7-1.3和0.8-1.3之間。在不同遺傳背景的菌株中，啟動子在YPE中的活性均較YPD中更高，在YPE中培養時細胞的PaTEF1、PTEF1和PTDH3啟動子活性分別為在YPD100中培養時的1.7-2.0、2.7-7.1和1.3-3.4倍。在3種培養基中，PaTEF1和PTDH3的活性在BY4741背景的菌株中最高，在LX03背景的菌株中最低；而PTEF1的活性則在Ethanol Red背景的菌株中最高，在LX03背景的菌株中最低。

圖2 菌株在不同培養基條件下的生長情況比較

圖3 菌株在不同培養基條件下的GFP熒光比較

此外，對3個菌株在YPD100培養基中，對數期早期、對數期中期和穩定期的細胞熒光強度進行了比較，相應的取樣時間點分別為8、24和48 h（圖4，表4）。啟動子活性從對數期早期到對數期中期的變化較對數期中期到穩定期的變化大。對比對數期中期和對數期早期，PTDH3啟動子在3種背景的菌株中啟動子活性變化小，而PaTEF1啟動子在BY4741背景的菌株中對數期中期的活性較對數期早期的活性減弱（前者是后者的0.73倍），PTEF1啟動子在LX03背景的菌株中活性增強（前者是后者的1.43倍）。

圖4 菌株在YPD100培養基中不同細胞生長階段的GFP熒光比較

表4 菌株在YPD100培養基中不同生長階段的GFP熒光強度比較

3 討論

釀酒酵母是普遍使用的底盤細胞，對其細胞中關鍵代謝途徑的基因表達強度進行精細調節對于提高生產菌株的性能至關重要。細胞內代謝的調控水平包括轉錄水平、翻譯水平和翻譯后修飾水平。蛋白質的翻譯后修飾調控較為復雜，不便于進行遺傳操作。相較于翻譯水平，轉錄水平的調控對基因表達水平的提升倍數更多，可達到102數量級，而翻譯水平調控對基因表達水平的提升卻很低，例如密碼子優化使釀酒酵母雙加氧酶基因表達水平提高2.9倍左右［15］。因此，通過采用不同強度的啟動子來調控轉錄水平進而改變代謝流是一個常用的方法［16］。例如，通過在RIM15基因的5'-UTR區域插入PCK1基因的啟動子可以抑制RIM15基因在早期葡萄糖豐富時的表達而激活其在后期乙醇發酵時的表達，進而提高乙醇發酵性能［17］。此外，在其他代謝途徑中，研究者們也通過選擇不同強度的啟動子來調控不同酶的表達水平。如我國學者［18］對釀酒酵母中萜類化合物合成途徑中多達12個基因的啟動子活性進行了表征，并采用具有不同活性的啟動子對代謝途徑進行了重新設計，進而獲得了角鯊烯、油酸和麥角固醇產量顯著提高的釀酒酵母菌株。在過去20多年里，研究者們鑒定了許多不同的啟動子，包括天然的啟動子及其突變體。Partow等［19］對多個組成型啟動子以及誘導型啟動子PGAL1和PGAL10在葡萄糖和半乳糖中的活性進行了表征；Alper等［5］通過對野生型TEF1啟動子進行突變得到了活性跨度較大的TEF1啟動子突變體；Peng等［6］則同時鑒定了19個啟動子在不同碳源中的活性。在現有啟動子的基礎上，研究者們又創造性地將啟動子中的調控元件進行了組裝，得到了具有更強活性的人工啟動子［4］。

與挖掘啟動子的多樣性相比，研究個別啟動子在不同條件下，尤其是工業發酵環境條件下的啟動活性和穩定性對于提升細胞工廠的性能同樣重要?；虻淖顑灡磉_水平在不同宿主中也不盡相同，并受到宿主遺傳背景的影響。因此本研究選擇了不同宿主進行啟動子活性分析，包括BY4741、Ethanol Red和LX03，其中BY4741為常用的實驗室菌株，Ethanol Red為工業菌株，LX03則是本課題組之前研究工作中構建的木糖代謝菌株［10］。Partow等［19］研究發現，當把8 h時的PTEF1啟動子活性定義為100%時，24 h和48 h時PTEF1啟動子活性分別為156%和136%。在本研究中，僅LX03背景菌株在葡萄糖條件下的啟動強度變化與Partow等［19］的研究結果一致，而BY4741和Ethanol Red背景菌株中PTEF1在24 h和48 h相對于8 h的啟動子活性均出現了下降（表4）。Partow等［19］所用的菌株為CEN.PK 113-5D，與LX03的出發菌株相同。由此說明，在相同遺傳背景的菌株中，啟動子活性隨著細胞生長階段的變化趨勢相同。PaTEF1在YPD100中的活性高于PTEF1的活性，而在YPE中則表現為在LX03背景的菌株中PaTEF1的活性高于PTEF1的，在Ethanol Red背景的菌株中PaTEF1的活性較PTEF1更低，而在BY4741中有高有低。在3種培養基中，PaTEF1的活性在BY4741背景的菌株中最高，在LX03背景的菌株中最低。而PTEF1的活性則在Ethanol Red背景的菌株中最高，在LX03背景的菌株中最低。表明啟動子活性會隨宿主遺傳背景的不同而變化。同一啟動子的活性在不同宿主中不盡相同，這可能與不同宿主的代謝調控網絡不同有關。此外，人工啟動子的活性并非總是高于天然啟動子活性，而是隨著釀酒酵母遺傳背景和培養基條件的不同發生變化。

研究表明，啟動子的活性也會受到包括碳源和生長時期等多種因素的影響［19，20］，因此本研究檢測了3種培養基條件下對數期早期、對數期中期和穩定期的啟動子活性。葡萄糖是細胞工廠生產目標產物時最常用的碳源，當葡萄糖耗盡之后，細胞轉換為利用培養基中其他碳源的模式。乙醇既是釀酒酵母乙醇發酵中的主要代謝產物，在發酵后期也作為細胞生長的碳源。乙醇也被用作某些高附加值產品，如角鯊烯、游離脂肪酸等［18］生產過程的碳源，研究表明以乙醇作為碳源有利于青蒿素的生產［8］。此外，高濃度乙醇對宿主菌株產生明顯的抑制作用［21］。因此研究乙醇為碳源條件下的啟動自強度也具有重要的意義。Peng等［6］研究了以2%乙醇為碳源時啟動子活性，發現PTEF啟動子活性較PPGK1和PTDH3等啟動子的活性更強。Yamauchi等［22］發現BTN2啟動子可在高濃度（＞9%，V/V）乙醇條件下強表達，但在溫和乙醇脅迫條件下PBTN2活性則相對較低，采用該啟動子也能夠在高濃度乙醇條件下啟動CUR1、GIC2以及YUR1等異源基因的表達。本研究對不同宿主中野生型啟動子和人工啟動子在3種培養基YPD100、5% YPE和7% YPE的活性進行了研究和比較。其中，培養基YPE中5%和7%的乙醇既可作為碳源又是一種細胞脅迫因子，相較于2%的乙醇濃度也更接近生產發酵過程中的乙醇濃度。有趣的是，啟動子PaTEF1、PTEF1和PTDH3在YPE中的活性均高于在YPD100中的活性，前者是后者的1.3-7.1倍，提示乙醇對上述啟動子有一定的激活作用。YPE中啟動子活性較YPD中更強，可能是菌株響應乙醇脅迫的一種表現。通過菌株在不同培養基條件下的生長情況（圖2）可知，在YPE條件下培養時，菌株的延滯期延長，即乙醇對菌株的生長產生了抑制，這可能使得細胞對蛋白質的需求更大，增加了啟動子活性。另外，轉錄因子與啟動子的結合對啟動子的活性影響較大［23，24］，乙醇作為一種脅迫的同時也是一種不同于葡萄糖的碳源，可能影響轉錄因子的結合，從而影響啟動子活性。

隨著合成生物學的發展和啟動子研究的深入［4］，人工雜合啟動子成為一種新的元件構建方法。人工雜合啟動子由上游激活序列和核心啟動子組合而成，Alper等通過將不同的上游增強元件（UASCLB和UASCIT）與不同的天然啟動子核心（PGPD、PCYC、PTEF和PLEUM）串聯得到的雜合啟動子的活性是相應的天然啟動子活性的1.63-10.02倍。盡管人工啟動子比野生型啟動子活性更強，但前人的研究只考察了釀酒酵母BY4741菌株在YSC-URA（20 g/L glucose）培養基中培養48 h時的人工啟動子活性，未對人工啟動子在不同宿主、不同碳源以及不同生長時期的活性進行進一步研究。本研究選取的人工啟動子是Alper等［5］報道的將3個串聯的240-bp UASCLB與PTEF1核心組裝而成的啟動子UASCLB（3X）- PTEF1，該啟動子在葡萄糖條件下的活性是野生型PTEF1的1.63倍，并研究了人工啟動子及其天然啟動子PTEF1以及常用的強啟動子PTDH3在不同宿主、不同培養基條件和細胞不同生長階段的活性。值得一提的是，在YPD100和YPE培養基中，人工啟動子PaTEF1的活性變化倍數為1.7-2.0，而天然啟動子PTEF1和PTDH3的變化倍數分別為2.7-7.1和1.3-3.4，這可能從側面反映出人工啟動子的活性在不同培養基中較天然啟動子更穩定。

4 結論

本研究系統全面地分析和比較了人工啟動子和天然啟動子在不同條件下和不同宿主中的性能。宿主的遺傳背景和培養基條件對啟動子活性的影響較大，同時，啟動子活性可能隨著細胞生長階段的不同而不同，另外，在不同遺傳背景的菌株中，啟動子活性從對數期早期到對數期中期和從對數期中期到穩定期的變化趨勢不同。這些結果表明啟動子的選用需要考慮宿主遺傳背景和不同的培養基條件以及基因的表達在不同細胞生長階段的需求。人工啟動子在不同培養基中的活性比天然啟動子更加穩定，因此在需要基因穩定表達的情況下，人工啟動子可能是一種更好的選擇。

致謝：感謝美國德克薩斯大學奧斯汀分校Hal S. Alper教授惠贈質粒p416-UASCLB（3X）-PTEF。

［1］Kav??ek M, Stra?ar M, Curk T, et al. Yeast as a cell factory：current state and perspectives［J］. Microbial Cell Factories, 2015, 14（1）：1.

［2］Mnaimneh S, Davierwala AP, Haynes J, et al. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles［J］. Cell, 2004, 118（1）：31-44.

［3］Weinhandl K, Winkler M, Glieder A, et al. Carbon source dependent promoters in yeasts［J］. Microbial Cell Factories, 2014, 13（1）：1.

［4］Blazeck J, Alper HS. Promoter engineering：recent advances in controlling transcription at the most fundamental level［J］. Biotechnology Journal, 2013, 8（1）：46-58.

［5］Blazeck J, Garg R, Reed B, et al. Controlling promoter strength and regulation in Saccharomyces cerevisiae using synthetic hybrid promoters［J］. Biotechnology Bioengineering, 2012, 109：2884-2895.

［6］Peng B, Williams TC, Henry M, et al. Controlling heterologous gene expression in yeast cell factories on different carbon substrates and across the diauxic shift：a comparison of yeast promoter activities［J］. Microbial Cell Factories, 2015, 14：91.

［7］Alper H, Fischer C, Nevoigt E, et al. Tuning genetic control through promoter engineering［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102（36）：12678-12683.

［8］Westfall PJ, Pitera DJ, Lenihan JR, et al. Production of amorphadiene in yeast, and its conversion to dihydroartemisinic acid, precursor to the antimalarial agent artemisinin［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109：E111-E118.

［9］Zhao XQ, Bai FW. Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for efficient fuel ethanol production［J］. Journal of Biotechnology, 2009, 144（1）：23-30.

［10］Blazeck J, Liu L, Redden H, et al. Tuning gene expression in Yarrowia lipolytica by a hybrid promoter approach［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77（22）：7905-7914.

［11］熊亮, 程誠, 李凱, 等. 菊芋秸稈高濃度物料分步糖化及乙醇發酵［J］. 應用與環境生物學報, 2016, 22（3）：382-387.

［12］Sheff MA, Thorn KS. Optimized cassettes for fluorescent protein tagging in Saccharomyces cerevisiae［J］. Yeast, 2004, 21：661-670.

［13］Taxis C, Knop M. System of centromeric, episomal, and integrative vectors based on drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae［J］. Biotechniques, 2006, 40（1）：73-78.

［14］Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method［J］. Nature Protocols, 2007, 2（1）：31-34.

［15］Leavitt JM, Alper HS. Advances and current limitations in transcript-level control of gene expression［J］. Current Opinion in Biotechnology, 2015, 34：98-104.

［16］Blazeck J, Alper H. Systems metabolic engineering：Genome-scale models and beyond［J］. Biotechnology Journal, 2010, 5（7）：647-659.

［17］Watanabe D, Kaneko A, Sugimoto Y, et al. Promoter engineering of the Saccharomyces cerevisiae RIM15 gene for improvement of alcoholic fermentation rates under stress conditions［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2016, pii：S1389-1723（16）30202-X. doi：10. 1016/j. jbiosc. 2016. 08. 004.

［18］Rasool A, Zhang G, Li Z, et al. Engineering of the terpenoid pathway in Saccharomyces cerevisiae co-overproduces squalene and the non-terpenoid compound oleic acid［J］. Chemical Engineering Science, 2016, 152：457-467.

［19］Partow S, Siewers V, Bj?rn S, et al. Characterization of different promoters for designing a new expression vector in Saccharomyces cerevisiae［J］. Yeast, 2010, 27（11）：955-964.

［20］Vickers CE, Bydder SF, Zhou Y, et al. Dual gene expression cassette vectors with antibiotic selection markers for engineering in Saccharomyces cerevisiae［J］. Microbial Cell Factories, 2013, 12：96.

［21］Bai FW, Anderson WA, Moo-Young M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks［J］. Biotechnology Advances, 2008, 26（1）：89-105.

［22］Yamauchi Y, Izawa S. Prioritized expression of BTN2 of Saccharomyces cerevisiae under pronounced translation repression induced by severe ethanol stress［J］. Frontiers in Microbiology, 2016, 7：1319.

［23］Redden H, Alper HS. The development and characterization of synthetic minimal yeast promoters［J］. Nature Communications, 2015, 6：7810.

［24］Ganapathi M, Palumbo MJ, Ansari SA, et al. Extensive role of the general regulatory factors, Abf1 and Rap1, in determining genomewide chromatin structure in budding yeast［J］. Nucleic Acids Research, 2011, 39（6）：2032-2044.

（責任編輯 馬鑫）

Activity Comparison of the Artificial Hybrid Promoter with Its Native Promoter in Saccharomyces cerevisiae

TANG Rui-qi1XIONG Liang2BAI Feng-wu1，2ZHAO Xin-qing1
（1. School of Life Science and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240；2. School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116023）

The responses of promoter strengths of artificial TEF1 promoter（PaTEF1）and native promoter PTEF1as well as PTDH3were comprehensively compared. The strength of PaTEF1was not always higher than PTEF1，but varied along with the genetic background of host，medium，and cell growth phase. Among the three investigated hosts，PaTEF1showed the highest strength in BY4741，while the lowest in LX03. The strengths of PaTEF1were 1.4-4.6 and 0.9-2.0 times of those of native promoters（PTEF1and PTDH3）in YPD100medium，respectively. The activities of PaTEF1in YPE（5% and 7%）were 0.7-1.3 and 0.8-1.3 times of PTEF1and PTDH3. The activity of PaTEF1in YPE was 1.7-2.0 times of that in YPD100，whereas 2.7-7.1 and 1.3-3.4 times for PTEF1and PTDH3，respectively. The activities of the promoters in YEP were higher than those in YPD100，however，the activity variation of artificial promoters was less than that of native promoter. In addition，the variation trends of promoter strengths from early-log to mid-log phase and from mid-log to stationary phase varied in different host strains.

Saccharomyces cerevisiae；artificial hybrid promoter；TEF1 promoter；host strain；environmental condition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.01.013

2016-10-20

國家自然科學基金項目（31461143029，5151101168）

唐瑞琪，女，博士研究生，研究方向：釀酒酵母代謝工程改造；E-mail：rq_tang@sjtu.edu.cn

趙心清，女，博士，教授，研究方向：釀酒酵母及絲狀真菌代謝工程改造和生物能源生產；E-mail：xqzhao@sjtu.edu.cn