多花黃精有效成分與主要環境因子的相關性

葉 錢，蔣燕鋒，馮家駿，馮愷俊，謝彩香，劉京晶

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安311300；2.浙江省麗水市林業科學研究院，浙江 麗水323000；3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193）

多花黃精有效成分與主要環境因子的相關性

葉 錢1，蔣燕鋒2，馮家駿1，馮愷俊1，謝彩香3，劉京晶1

（1.浙江農林大學 亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，浙江 臨安311300；2.浙江省麗水市林業科學研究院，浙江 麗水323000；3.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193）

多花黃精Polygonatum cyrtonema的根莖是藥食同源的中藥材，用途廣泛，目前多利用野生資源。收集了不同種源的多花黃精，采用蒽酮-濃硫酸比色法和香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法分別測定根莖中總多糖和總皂苷質量分數，并分析這2種有效成分與環境因子間的相關性。結果表明：多花黃精總多糖質量分數為97.0～363.2 mg·g－1，總皂苷質量分數為24.0～62.6 mg·g－1，來源于17個不同種源地的多花黃精化學質量存在較大的差異：浙江金華磐安種源的多糖質量分數最高，浙江麗水蓮都區皂苷質量分數最高；環境因子中活動積溫與多糖質量分數呈極顯著負相關（r=0.618，P=0.008），生長期適當的低溫有利于多糖的積累。表3參11

植物學；多花黃精；多糖；皂苷；環境因子

百合科Liliaceae植物多花黃精Polygonatum cyrtonema是中藥材黃精的基源物種之一，根莖入藥，又名姜形黃精。始載于《雷公炮炙論》，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等傳統功效［1］。多花黃精根莖中的主要化學成分包括多糖和甾體皂苷。多糖具有免疫調節、降血糖、抗衰老、抗化學性肝損傷、保護癡呆小鼠海馬區線粒體結構等活性，甾體皂苷具有降血脂、抗病毒、改善記憶障礙等作用［2－3］。黃精為常用中藥材，是藥食同源物種，可作為臨床配方、中成藥生產、保健食品配伍及藥膳原料使用。由于市場需求量的增加、資源蘊藏量的減少等原因，黃精價格逐漸上漲，但其引種馴化、豐產栽培技術尚不成熟，目前藥材仍主要來源于野生［4］。多花黃精廣泛分布于浙江、江蘇、安徽、江西、福建、四川、貴州等地，浙江省為多花黃精的主產區之一，種質資源豐富［2］。本研究通過種質資源收集、質量評價、主要有效成分質量分數與生態環境因子的逐步回歸分析和相關性分析，為多花黃精的種源篩選、品種選育，規范中藥材生產質量管理（good agricultural practice of medicinal plants and animals，GAP）提供研究基礎，為黃精資源的可持續利用提供科學依據。

1 材料

1.1 試驗材料

不同種源的多花黃精根莖供試品來自浙江、安徽、湖北等地，采樣點信息見表1。利用《中藥材產地適宜性分析地理信息系統》（TCMGIS），基于數字高程模型（digital elevation model，DEM）的多元線性回歸插值方法，根據采樣點經緯度提取氣候、土壤等主要環境因子［5］。種源地采集后選擇有芽的根莖，用刀切成有2~3個節的小段進行種植，于浙江省麗水市蓮塘區麗水市林業科學研究院中藥材種質資源圃栽培1 a，2013年11月收集地下部分（根莖），60℃烘干，粉碎，過60目篩，干燥器保存。

1.2 儀器與試藥

UV 2500紫外-可見分光光度計（上海第三分析儀器廠）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）；AB104-N電子分析天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；SWB5200型超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司）。D-葡萄糖、菝契皂苷對照品 （中國藥品生物制品檢定所）；甲醇、無水乙醇、濃硫酸、冰醋酸、香草醛、高氯酸均為分析純。

表1 多花黃精種源采樣點氣候因子Table 1 Climatic factors of Polygonatum cyrtonema sites

2 測定方法

2.1 總多糖的測定

2.1.1 樣品溶液制備 取多花黃精根莖粉末0.25 g，精密稱定，加入體積分數為80%乙醇150.0 mL，80℃水浴回流提取1.0 h，過濾，取濾渣加入蒸餾水150.0 mL，100℃水浴回流提取1.0 h，過濾，取濾液定容至250 mL。另精密稱取干燥至恒量的D-無水葡糖糖對照品8.3 mg于25.0 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配制成0.332 g·L－1的對照品溶液，置冰箱中備用。

2.1.2 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL分別至試管中，加蒸餾水補足至2.0 mL，于冰浴中加入體積分數為0.2%蒽酮硫酸溶液8 mL，搖勻，靜置至室溫，100℃水浴10 min后冰浴10 min冷卻。以蒸餾水為空白對照，同法操作，在520 nm波長處測定吸光度值。以質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線，測得總多糖的標準曲線方程為y=1.194 9x－0.012 0，r=0.999（n=6），線性范圍為0.033 2～0.199 2 mg。取同一供試品溶液，按2.1.2操作進行顯色穩定性試驗，隔0.5 h測定其吸光度值，結果的相對標準偏差為3.25%（n=5），表明供試品溶液在顯色后2 h內穩定。按2.1.1平行制備6份供試品溶液進行重復性試驗，測定其吸光度值，結果相對標準偏差為1.54%，表明試驗重復性良好。

2.1.3 樣品質量分數測定 樣品按2.1.1制成供試品溶液，平行3份，精密吸取1.0 mL至試管中，按2.1.2測定吸光度值，計算其質量分數。

2.2 總皂苷測定

2.2.1 樣品溶液制備 取多花黃精根莖粉末0.5 g，精密稱定，加入甲醇25.0 mL，80℃水浴回流提取1.0 h，過濾即得。精密稱取干燥至恒量的菝契皂苷對照品2.0 mg，置于10.0 mL容量瓶內，加入甲醇定容，配制成0.2 g·L－1的對照品溶液，置冰箱中備用。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液0.05，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL分別至試管中，加甲醇補足至1.0 mL，100℃水浴蒸干，分別加入體積分數為5%香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴20 min，取出后于冰浴中加入冰乙酸5.0 mL，搖勻，室溫放置15 min。以甲醇溶液為空白對照，同法操作，在452 nm波長處測定吸光度值。以質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線，結果總皂苷的標準曲線方程為y=9.718 2x－0.021 7，r=0.999（n=5），線性范圍為0.01～0.20 mg。取同一供試品溶液，按2.2.2操作進行顯色穩定性試驗，隔0.5 h測定其吸光度值，結果相對標準偏差為2.62%（n=5），表明供試品溶液在顯色后2 h內穩定。精密吸取對照品溶液5份，各0.6 mL，按2.2.2連續測定進行精密度試驗，結果相對標準偏差為3.20%，表明儀器精密度良好。按2.2.1平行制備6份供試品溶液，分別測定其吸光度值進行重復性試驗，結果相對標準偏差為4.38%，表明方法重復性良好。

2.2.3 加樣回收率試驗 精密稱取已知質量分數的同一供試品6份各0.25 g，分別加入適量菝葜皂苷元對照品溶液，按2.2.1制成供試品溶液，按2.2.2測定吸光度值，計算回收率為99.3%～104.1%，相對標準偏差為1.63%。

2.2.4 樣品質量分數測定 樣品按2.2.1制成供試品溶液，平行3份，精密吸取0.1 mL至試管中，按

2.2.2測定吸光度值，計算其質量分數。

2.3 數據分析

在Excel 2003統計軟件中進行數據處理和表格制作。在SPSS 17.0統計軟件中進行單因素方差分析，比較不同種源多花黃精根莖主要有效成分的差異，并進行有效成分與主要環境因子的相關性分析。

3 結果與分析

3.1 不同種源多花黃精根莖主要有效成分質量分數差異

不同種源多花黃精根莖多糖及皂苷質量分數存在顯著差異（P＜0.05）（表2），多糖質量分數范圍為97.0～363.2 mg·g－1，皂苷質量分數的范圍為24.0～62.6 mg·g－1。來自浙江金華磐安縣種源的多花黃精根莖多糖質量分數最高，安徽池州青陽縣、浙江麗水景寧縣和浙江溫州文成縣次之，浙江麗水蓮都區的多糖質量分數最低但皂苷質量分數最高，安徽池州市青陽縣和浙江金華磐安縣盤峰鄉的皂苷質量分數最低。

相關性分析表明，多花黃精根莖多糖和皂苷質量分數呈顯著的負相關關系（P=0.018），表明多花黃精根莖中這2類有效成分質量分數均高的種源難以兼得，引種馴化及優良品種選育時需注意多指標綜合評價，而臨床及生產應用時應根據適應癥及質量控制指標進行原料藥材的篩選。

表2 不同種源多花黃精根莖多糖和皂苷質量分數Table 2 Contents of polysaccharides and saponins of Polygonatum cyrtonema from different provenances（±s，n=3）

表2 不同種源多花黃精根莖多糖和皂苷質量分數Table 2 Contents of polysaccharides and saponins of Polygonatum cyrtonema from different provenances（±s，n=3）

說明：同一列所注不同小寫英文字母表示新復極差測驗5%顯著水平。

3.2 影響多花黃精根莖主要有效成分質量分數的主要環境因子

將12個生態因子分別規定為x1（經度），x2（緯度），x3（活動積溫），x4（年平均氣溫），x5（平均相對濕度），x6（年日照時數），x7（年降水量），x8（土壤），x9（7月最高溫），x10（7月平均氣溫），x11（1月最低溫），x12（1月平均氣溫）。設y1為多糖質量分數，y2為皂苷質量分數。

以種源地的生態因子為自變量，17個樣品的多糖和皂苷質量分數為因變量，采用逐步回歸分析方法，剔除沒有顯著效應的自變量，建立比較簡化和相對準確的多元線性回歸方程：y1=66.948－0.000 9 x3（r=0.618，P=0.008），表明多花黃精根莖中多糖質量分數與活動積溫呈極顯著（P＜0.01）負相關關系。

由多花黃精根莖中多糖、皂苷質量分數與環境因子的相關系數統計分析（表3）可知，多花黃精根莖中多糖積累明顯與溫度有關，包括活動積溫（P=0.008），年平均氣溫（P=0.038），7月最高溫（P=0.064），7月平均氣溫（P=0.075），1月最低溫（P=0.024），1月平均氣溫（P=0.037）；而皂苷質量分數與12個生態環境因子均無顯著相關性，其積累變異規律有待進一步研究。

4 結論與討論

本研究建立了以菝葜皂苷元為標準品的多花黃精根莖總皂苷質量分數測定方法；通過對回流提取、超聲提取2種提取法，及甲醇、二氯甲烷和乙酸乙酯3種提取溶劑的綜合比較，確定了供試品溶液制備的甲醇回流方法；經過方法學考察后，應用于多花黃精種質資源的質量評價。

多花黃精根莖中總甾體皂苷質量分數與總多糖質量分數顯著負相關（P＜0.05）。在初生代謝比較旺盛的條件下，多糖大量積累，皂苷、生物堿等次生代謝合成受到抑制的現象在黃芪Astragali radix，石斛Dendrobii caulis等多種中藥材中均有出現［6-8］。活動積溫是影響多花黃精根莖中多糖積累的最主要環境因子，與多糖質量分數呈負相關關系，表明生長期適當的低溫有利于多糖類成分的積累，與低溫刺激植物多糖合成與積累的報道相一致［6］。

中藥材生長過程中受到適當的逆境脅迫有利于次生代謝產物的積累，氣候地理環境變異與中藥材化學生態型的形成與分化相關［9］；不同種源藥材在同一實驗地栽培后測試分析結果表明：因種源特殊環境因子產生的化學生態型變異，具有一定的遺傳潛力，有效成分與種源環境和遺傳多樣性的關聯可為中藥優良品種的選育提供參考［10-11］。本研究未發現影響皂苷積累的關鍵環境因子，需要擴大樣本量進一步深入研究；多花黃精中高多糖和高皂苷質量分數難以兼顧，在引種栽培、制定育種和遺傳改良方案時，要根據具體改良目標權衡考慮。

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Correlation between environmental factors and active constituents of Polygonatum cyrtonema

YE Qian1,JIANG Yanfeng2,FENG Jiajun1,FENG Kaijun1,XIE Caixiang3,LIU Jingjing1
（1.The Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.Lishui Academy of Forestry,Lishui 323000,Zhejiang,China;3.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science,Peking Union Medical College,Beijing 100193,China）

Polygonatum cyrtonema,a widely used traditional Chinese herbal medicine that mainly comes from the wild,could also be used as a food specific environmental factors influence the formation and the accumulation of active constituents,therefore an appropriate environment is a prerequisite for production of high-quality genuine this medicinal materials.This study aimed to explore the impact of environment factors on polysaccharide and saponin accumulation to enhance the quality of P.cyrtonema.Rhizomes of P.cyrtonema were collected from 17 different provenances of Zhejiang,Anhui and Hubei Provinces,China.Total polysaccharides were determined by the anthrone-sulfuric acid colorimetric method and total saponins by the vanillin-glacial acetic acid-perchloric acid colorimetric method.In addition,a correlation analysis between the main active constituents and environmental factors was also conducted.Results showed that the content range of total polysaccharides was 97.0－363.2 mg·g－1,and total saponins was 24.0－62.6 mg·g－1.Among the provenances tested,total content of these two effective constituents differed.Of all 17 samples,those from Pan’an in Jinhua,Zhejiang exhibited the highest polysaccharide content,and the sample from Liandu in Lishui,Zhejiang had the maximum saponin content.Moreover,active accumulated temperature significantly affected polysaccharide accumulation（r=0.618,P=0.008）.The results indicated an appropriate low temperature could improve the polysaccharide content in cultivated P.cyrtonema.［Ch,3 tab.11 ref.］

botany;Polygonatum cyrtonema;polysaccharide;saponin;environmental factors

S718.3；R282

A

2095-0756（2017）01-0192-05

2015-06-12；

2016-04-06

浙江省公益技術研究農業項目（2012C22096）；浙江省教育廳資助項目（kg2013219）

葉錢，從事中藥材質量評價及品種選育研究。E-mail：237715099@qq.com。通信作者：劉京晶，講師，博士，從事中藥材質量評價及品種選育研究。E-mail：jing_jing_6@163.com