ADC值反映EB病毒LMP1基因表達(dá)的可行性

李 卉，王德玲，尹韶晗，耿志君，謝傳淼

(中山大學(xué)腫瘤防治中心影像介入中心 華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510060)

ADC值反映EB病毒LMP1基因表達(dá)的可行性

李 卉，王德玲，尹韶晗，耿志君，謝傳淼*

(中山大學(xué)腫瘤防治中心影像介入中心 華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510060)

目的 探討ADC值反映EB病毒潛伏膜蛋白質(zhì)1(LMP1)基因表達(dá)的可行性。方法 建立LMP1(+)組[包括CNE2-LMP1(+)亞組、HONE1-LMP1(+)亞組]和LMP1(-)組[包括CNE2-LMP1(-)亞組、HONE1-LMP1(-)亞組]的皮下種植瘤裸鼠模型(每組15只)。待移植瘤體積達(dá)90～110 mm3后，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行常規(guī)MR及DWI檢查，分別獲得兩組腫瘤的ADC值，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察兩組實(shí)驗(yàn)裸鼠種植瘤病理組織學(xué)改變。結(jié)果 LMP1(+)組腫瘤體積[(98.23±11.42)mm3]明顯大于LMP1(-)組[(87.42±15.14)mm3；t=6.31，P=0.03]。常規(guī)MR掃描示LMP1(+)組腫瘤內(nèi)壞死較LMP1(-)組更明顯。LMP1(+)組腫瘤ADC值為(0.68±0.12)×10-3mm/s2，LMP1(-)組腫瘤ADC值為(0.87±0.23)×10-3mm/s2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.34，P<0.01)。腫瘤病理組織學(xué)檢查顯示與LMP1(-)組相比，LMP1(+)組腫瘤細(xì)胞更密集，壞死更多見。結(jié)論 ADC值可有效反映裸鼠移植瘤中EB病毒LMP1基因的表達(dá)。

模型，動物；潛伏膜蛋白基因1；擴(kuò)散磁共振成像；表觀擴(kuò)散系數(shù)

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，發(fā)病有明顯地區(qū)性，是一種高度異質(zhì)性的疾病。研究[1]表明相同TNM分期、WHO分型的鼻咽癌患者其分子遺傳學(xué)不盡相同，從而導(dǎo)致腫瘤治療反應(yīng)和患者的預(yù)后差異。EB病毒潛伏膜蛋白質(zhì)1(latent membrane protein 1, LMP1)基因已被證明是與鼻咽癌患者生存預(yù)后最密切的基因之一，并被應(yīng)用于基于分子標(biāo)記物的鼻咽癌預(yù)后評估系統(tǒng)[1]。本研究主要在動物實(shí)驗(yàn)水平探討DWI中ADC值反映EB病毒LMP1基因表達(dá)的可行性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取4～6周齡BALB/C雌性裸鼠共30只，每只體質(zhì)量約20 g。購于中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。在恒溫(25～27 ℃)、恒濕(45%～50%)、新鮮空氣、高度除塵除菌、無特殊支原體環(huán)境下飼養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)動物置于專用培養(yǎng)箱，安放于層流式超凈架內(nèi)。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)倫理審查。

1.2方法

1.2.1裸鼠皮下種植瘤的建立 分別以CNE2和HONE1作為載體細(xì)胞。取對數(shù)生長期的CNE2和CNE2-LMP1以及HONE1和HONE1-LMP1細(xì)胞株，經(jīng)胰酶消化后，采用pH值為7.4的PBS液洗滌，調(diào)整濃度為5×107個/ml。將細(xì)胞株以0.2 ml細(xì)胞混懸液分別接種于裸鼠的雙側(cè)臀部皮下。為比較兩種載體(CNE2和HONE1)成瘤的有效性，將CNE2[包括CNE2-LMP1(+)和CNE2-LMP1(-)]和HONE1[包括HONE1-LMP1(+)和HONE1-LMP1(-)]作為載體細(xì)胞的細(xì)胞株，分別接種于15只實(shí)驗(yàn)鼠。攜帶LMP1細(xì)胞株[CNE2-LMP1(+)或HONE1-LMP1(+)]接種于裸鼠右側(cè)臀部皮下，LMP1(-)細(xì)胞株[CNE2-LMP1(-)或HONE1-LMP1(-)]接種于裸鼠左側(cè)臀部皮下。建立分別以CNE2和HONE1作為載體細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤對照模型，LMP1(+)組包括CNE2-LMP1(+)亞組、HONE1-LMP1(+)亞組，LMP1(-)組包括CNE2-LMP1(-)亞組、HONE1-LMP1(-)亞組。記錄兩組皮下種植瘤的大小、形態(tài)、局部毛發(fā)情況，并繪制生長曲線。用游標(biāo)卡尺測量裸鼠移植瘤的長(L)、寬(W)和高(H)，計算腫瘤近似體積(V)：V=1/2·L·W·H。待移植瘤體積達(dá) 90～110 mm3后，對實(shí)驗(yàn)動物行常規(guī)MR及DWI檢查。

1.2.2MR檢查 MR檢查：采用GE Discovery MR 750 3.0T磁共振掃描儀，小動物專用線圈。對實(shí)驗(yàn)鼠采用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，注射劑量0.5～0.6 ml/100 g體質(zhì)量。

將實(shí)驗(yàn)鼠俯臥位保定，裸鼠皮下移植瘤位于射頻線圈的中心位置。常規(guī)進(jìn)行軸位T1WI和軸位、冠狀位及矢狀位T2WI掃描；采用SE-EPI序列的多b值DWI行軸位掃描。掃描參數(shù)：TR 3 300 ms，TE 97 ms，層厚2 mm，層間距0，層數(shù)10層，F(xiàn)OV 62 mm×62 mm；b值分別為0、600、800 s/mm2。

1.2.3圖像后處理與數(shù)據(jù)測量 采用GE ADW 4.6后處理工作站。測量冠狀位病灶A(yù)DC值，ROI為病灶最大層面的80%，盡量避開腫瘤內(nèi)壞死區(qū)，對所有病灶均重復(fù)測量3次取平均值。

1.2.4病理學(xué)檢查 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對裸鼠斷頸，并剝離腫瘤，測得腫瘤質(zhì)量。生理鹽水洗凈離體腫瘤表面血跡，經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋后切片。

2 結(jié)果

裸鼠皮下接種不同細(xì)胞懸液后，7～10天移植瘤體積達(dá)90～110 mm3。30只裸鼠中，成功建立雙側(cè)對照皮下種植瘤模型25只，并完成常規(guī)MR以及DWI檢查；其中CNE2作為載體細(xì)胞株裸鼠13只，HONE1作為載體細(xì)胞裸鼠12只，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2<0.01，P=1.000)。LMP1(+)組腫瘤大小為 (98.23±11.42)mm3，LMP1(-)組腫瘤大小為(87.42±15.14)mm3，LMP1(+)組明顯高于LMP1(-)組(t=6.31，P=0.03)，見表1。

常規(guī)MR掃描示LMP1(+)組腫瘤體積較LMP1(-)組大，腫瘤內(nèi)壞死更明顯。LMP1(+)組腫瘤ADC值為(0.68±0.12)×10-3mm/s2，LMP1(-)組腫瘤ADC值為(0.87±0.23)×10-3mm/s2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.34，P<0.01)，見表1和圖1。

圖1 裸鼠皮下移植瘤T2WI(A)、DWI(B)以及ADC(C)圖像 箭示右側(cè)LMP1(+)腫瘤，左側(cè)為LMP1(-)腫瘤，右側(cè)腫瘤體積明顯大于左側(cè)，腫瘤內(nèi)見壞死區(qū)，右側(cè)腫瘤壞死區(qū)范圍大于左側(cè)，DWI圖示腫瘤彌散受限呈高信號，ADC圖上腫瘤呈低信號

組別成瘤情況(側(cè))腫瘤體積(mm2)ADC值(×10-3mm/s2)LMP1(+)組 CNE2?LMP1(+)亞組1495．44±9．380．62±0．24 HONE1?LMP1(+)亞組1599．98±12．760．69±0．13LMP1(-)組 CNE2?LMP1(-)亞組1388．59±17．330．83±0．14 HONE1?LMP1(-)亞組1284．87±8．590．89±0．19

圖2 裸鼠皮下移植瘤病理組織切片(HE，×100) A.LMP1(+)組織切片； B.LMP1(-)組織學(xué)切片，LMP1(+)較LMP1(-)腫瘤細(xì)胞密度更高，更易見散在凝固性壞死區(qū)

光鏡下LMP(+)組與LMP1(-)組相比，腫瘤體積較大，腫瘤內(nèi)壞死較多，腫瘤細(xì)胞體積較大，核分裂象易見，腫瘤細(xì)胞更密集，凝固性壞死區(qū)更多見(圖2)。

3 討論

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，該病的發(fā)生主要與EB病毒的感染、遺傳易感性、飲食習(xí)慣等多種因素有關(guān)，同時其也是一個多基因參與、多步驟的復(fù)雜過程[1]。由LMP基因編碼的LMP1是重要的致瘤蛋白，在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，且與放化療抗性及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是一個潛在的分子靶向治療靶點(diǎn)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過建立LMP1(+)組[包括CNE2-LMP1(+)亞組、HONE1-LMP1(+)亞組]和LMP1(-)組[包括CNE2-LMP1(-)亞組、HONE1-LMP1(-)亞組]裸鼠模型，并對其進(jìn)行常規(guī)MR及DWI掃描，計算ADC值，評估ADC值是否能有效反映該基因的表達(dá)。

CNE2和HONE1細(xì)胞株為鼻咽癌常用的載體細(xì)胞株，在前期實(shí)驗(yàn)中，筆者已獲得可穩(wěn)定表達(dá)LMP1以及LMP1空載體細(xì)胞株。本研究分別以CNE2和HONE1為載體細(xì)胞建立皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)兩種載體細(xì)胞的成瘤率無明顯差異，均可用于裸鼠皮下移植瘤模型的建立。

研究[4]表明對于Ⅲ～Ⅳa期鼻咽癌患者，LMP1陽性表達(dá)患者生存時間明顯低于該基因陰性患者。研究[5-7]認(rèn)為LMP陽性表達(dá)患者腫瘤更具有侵襲性，更易出現(xiàn)放化療抗性，并出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)中LMP1(+)組腫瘤的體積明顯大于LMP1(-)組，提示攜帶LMP1基因細(xì)胞株細(xì)胞活性、增殖力均明顯高于LMP1(-)組，提示LMP1(+)組顯著的細(xì)胞增殖活力可能與LMP1陽性表達(dá)者預(yù)后較差以及腫瘤的侵襲性、放療抗性有關(guān)。

DWI是一種可反映水分子微觀運(yùn)動的MR成像方法，研究[8-9]表明DWI可為腫瘤或淋巴結(jié)性質(zhì)的鑒別、治療前敏感性評價以及治療中腫瘤療效的早期評價提供重要信息。有研究[10]分析DWI與肝癌增殖細(xì)胞核抗原基因(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)對兔VX2肝臟腫瘤模型進(jìn)行化學(xué)栓塞治療后，腫瘤組織ADC值與PCNA基因表達(dá)水平呈線性相關(guān)，表明腫瘤組織基因表型的差異可能通過ADC值反映。研究[11]表明ADC值與浸潤性乳腺癌的腫瘤分級具有相關(guān)性，可用于評估其惡性程度。也有研究[12]證實(shí)兒童高級別膠質(zhì)瘤的ADC值明顯低于低級別膠質(zhì)瘤，ADC值可用于術(shù)前兒童腦膠質(zhì)瘤的病理分級評估。本研究對25只成功建瘤裸鼠均成功完成常規(guī)磁共振以及DWI掃描，發(fā)現(xiàn)LMP1(+)組腫瘤ADC值明顯低于LMP1(-)組，結(jié)合病理結(jié)果，與LMP1(-)組相比，LMP(+)組腫瘤內(nèi)壞死較多，光鏡下LMP(+)組腫瘤細(xì)胞體積較大，腫瘤細(xì)胞更密集，凝固性壞死更多見，表明LMP1(+)組腫瘤水分子彌散運(yùn)動受限程度明顯高于LMP1(-)組，提示ADC值可反映LMP1基因的表達(dá)。

總之，在本研究的裸鼠皮下移植瘤模型中，ADC值可有效反映EB病毒LMP1基因的表達(dá)，可為腫瘤治療前在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上進(jìn)一步了解與腫瘤預(yù)后相關(guān)的基因表型、預(yù)測患者的預(yù)后以及療效提供依據(jù)。

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Feasibility of apparent diffusion coefficient values in reflecting expression of Epstein-Barr virus-latent membrane protein 1 gene

LIHui,WANGDeling,YINShaohan,GENGZhijun,XIEChuanmiao*

(DepartmentofMedicalImagingandInterventionalRadiology,CancerCenterofSunYat-senUniversity,StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthernChina,Guangzhou510060,China)

Objective To evaluate the feasibility of ADC in reflecting the expression of Epstein-Barr virus (EBV)-latent membrane protein 1 gene (EBV-LMP1). Methods A total 30 nude mice model were divided into two groups, namely LMP1(+) group (included CNE2-LMP1 [+] subgroup, HONE1-LMP1 [+] subgroup) and LMP1 (-) group (included CNE2-LMP1 [-] subgroup and HONE1-LMP1 [-] subgroup; eachn=15). The MRI and DWI were performed when the tumor volumes were 90—110 mm3. The ADC values of each group were obtained and statistical analysis. Histological specimens of each group were obtained after the completion of image acquisition. Results The tumors volume of LMP1 (+) group [98.23±11.42]mm3) were significant larger than that of LMP1 (-) group [87.42±15.14]mm3;t=6.31,P=0.03). LMP1 (+) group had more necrosis in the lesions than LMP1 (-) group in MRI scan. The ADC values of LMP1 (+) ([0.68±0.12]×10-3mm/s2) were significant lower than that of LMP1 (-) group ([0.87±0.23]×10-3mm/s2;t=9.34,P<0.01). Histopathological examination showed the cells of the LMP (+) group were more dense and necrosis were more easily to be detected, compared to LMP1 (-) group. Conclusion ADC value can effectively reflect the expression of EVB-LMP1.

Models, animal; Latent membrane protein 1 gene; Diffusion magnetic resonance imaging; Apparent diffusion coefficient

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2015377)。

李卉(1980—)，女，廣東廣州人，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：分子影像學(xué)。E-mail: lihui@sysucc.org.cn

謝傳淼，中山大學(xué)腫瘤防治中心影像介入中心 華南腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，510060。E-mail: xchuanm@mail.sysu.edu.cn

2016-07-28

2016-11-24

實(shí)驗(yàn)研究

10.13929/j.1003-3289.201607065

R-332; R445.2

A

1003-3289(2017)02-0167-04