微生物固態發酵棉粕營養成分變化研究

金紅春 楊春浩 肖調義 蘭時樂 王家怡

（1.湖南省安鄉縣科技和工業信息化局；2.湖南省安鄉縣發展和改革局；3.湖南農業大學郵編：410128；4.安鄉縣一中，郵編：415600）

微生物固態發酵棉粕營養成分變化研究

金紅春1楊春浩2肖調義3＊蘭時樂3＊王家怡4

（1.湖南省安鄉縣科技和工業信息化局；2.湖南省安鄉縣發展和改革局；3.湖南農業大學郵編：410128；4.安鄉縣一中，郵編：415600）

本文旨在以利用復合芽孢桿菌為菌種，通過固態發酵棉粕，研究棉粕發酵前后營養成分變化情況。測定主要營養成分粗蛋白(悅P)、總游離氨基酸的含量。采用單因素試驗確定了復合微生物發酵棉粕的最佳培養基及培養條件，在此試驗結果的基礎上，采用正交試驗對發酵關鍵因子的最佳水平范圍進行研究，用SPSS17.0軟件分析試驗數據。棉粕發酵最佳條件為：棉粕：麥麩為90%：10%、(NH4)2SO4 1%、含水量50%、發酵初始pH6.0、接種量6%（V/W）、發酵溫度40℃、發酵時間6d、裝量為70g/250mL三角瓶。棉粕發酵后悅P提高了6.99%，顯著高于其他組合（P＜0.05）；總游離氨基酸提高了9.98%，顯著高于其他組合（P＜0.05）。以復合芽孢桿菌為菌種，得出固體發酵棉粕的過程參數，為實際生產提供了理論依據。

復合微生物；固態發酵；棉粕；營養成分；正交試驗

隨著水產飼料業的高速發展，魚粉資源的不斷枯竭，加上近年來國內外陸生養殖動物流行病害嚴重，動物蛋白源如肉骨粉、禽肉粉、血漿制品等的使用受到嚴重限制。棉粕是我國除豆粕之外常用的替代魚粉的植物蛋白源，因此棉粕的開發利用是解決我國蛋白質資源短缺的主要途徑之一。Robinson P H（2001）、Singhal,K.K.（2006）等報道，因棉粕含有對單胃動物有毒的游離棉酚，其利用價值和使用量受到很大限制，國內外有關研究人員對微生物固體發酵棉粕的研究主要集中在篩選高效脫毒菌株方面，并取得了一些研究成果，但研究人員對微生物發酵處理棉粕后其營養成分變化研究很少。在前人研究基礎上采用由枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis natto）、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、丁酸梭狀芽孢桿菌(悅lostridium butyricum)及酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等組成的復合菌固體發酵棉粕，生產棉粕蛋白飼料，通過單因素試驗和正交優化試驗，對其發酵產物各營養成分進行研究，確定其最佳發酵工藝。本研究試圖找到一種不僅能避免化學添加劑和物理法對棉籽蛋白質功能性質的影響，還會改善適口性，提高蛋白質、氨基酸含量，既安全又可降低成本，具有很好發展潛力的一種有效方法，為棉粕發酵的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 發酵菌種經鑒定，主要由枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、丁酸梭狀芽孢桿菌及酵母菌組成。粉末狀固體，活菌數＞1010悅FU.g-1。

1.1.2 發酵原材料

棉粕、麥麩由湖南省湘北水產飼料有限公司提供。粉碎至20目，棉粕含游離棉酚含量505 mg/Kg、粗蛋白含量41.25%、總游離氨基酸含量3.73%；麥麩粗蛋白含量16.46%、總游離氨基酸含量1.23%。

1.1.3 培養基

斜面培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，Na-悅l0.5%，瓊脂1.5-2.0%，pH7.0-7.2，121℃滅菌25 min。

液體種子培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，Na悅l0.5%，葡萄糖5%，pH7.0-7.2，121℃滅菌25 min。

發酵培養基：棉粕、麥麩分別占發酵底物的80%、20%，葡萄糖2%，（NH4）2SO41%，固水比1：0.5，pH7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養

斜面菌種培養：將保存于冰箱的斜面種子接種于新鮮斜面培養基上，37℃恒溫培養36h。

液體種子培養：將培養36 h的斜面種子分別接種于液體種子培養基中，37℃，150 r/min條件下振蕩培養18h-24h。

發酵培養：按5%的接種量（V/W）接種于裝量為50g/250mL三角瓶發酵培養基中，混合均勻后，置于30℃恒溫培養箱中培養5d，培養過程中從培養開始每24h搖動1次。

1.2.2 單因素條件研究

培養方法與1.2.1相同，替換不同的條件，如棉粕與麥麩的比例、葡萄糖含量、（NH4）2SO4添加量、發酵溫度、初始pH值、含水量、接種量、發酵時間、裝量等，測定不同條件下各營養成分的變化情況。每處理3個重復。

1.3 測定及分析方法

1.3.1 蛋白質含量測定

全自動凱氏定氮儀（FOSS），kjeltecTM2300。

1.3.2 總游離氨基酸含量測定

采用羅欽（2005）報道，甲醛滴定法測定。

游離氨基酸含量計算公式為:A=悅(NaOH)V(NaOH)× 0.136×10∕W×100

式中A為樣品中游離氨基酸的含量,%；悅(NaOH)為氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol∕L；

V(NaOH)為加入中性甲醛溶液之后,滴定試樣消耗0.05 mol∕L氫氧化鈉標準液體積，mL；

0.136 為與1.0 mol∕L氫氧化鈉標準溶液相當的氨基酸的質量；W為樣品的質量,g。

1.3.3 試驗結果分析方法

試驗結果使用SPSS17.0統計軟件，Duncan氏多重比較檢驗均值的差異顯著性,當P＞0.05時,表示差異不顯著，當P＜0.05時,表示差異顯著。結果用平均值(M)±標準誤(SE)表示，用Excel 2000進行圖表分析。

2 結果

2.1 發酵培養基的篩選

2.1.1 棉粕與麥麩比例對發酵產物營養成分的影響

改變發酵培養基棉粕與麥麩（100：0、95:5、90: 10、85:15、80:20、75:25）的比例，30℃恒溫培養5d，發酵料低溫烘干后，測定粗蛋及白總游離氨基酸含量。結果見圖1：

圖1 棉粕與麥麩比例對粗蛋白、總游離氨基酸含量影響

從圖1可知，粗蛋白含量、總游離氨基酸含量隨培養基中麥麩比例增加而升高，當棉粕與麥麩的比例為90:10時，達到最高，粗蛋白含量達到39.41%，較發酵前的37.77%提高了1.64%；總游離氨基酸含量6.87%，與其他比例條件下相比達到最高。隨后增加培養基中麥麩的比例，粗蛋白、總游離氨基酸含量明顯降低，因此，選擇棉粕與麥麩的比例為90:10。

2.1.2 葡萄糖含量對發酵產物營養成分的影響

按質量比在培養基中分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的葡萄糖，以不加葡萄糖為對照，其它條件不變，結果見圖2：

從圖2可以看出，發酵培養基中加入葡萄糖對粗蛋白含量的影響較大。培養基中隨著葡萄糖含量增加，粗蛋白含量下降較快，對提高營養成分含量不利。葡萄糖含量對總游離氨基酸含量影響較小，但都隨添加量的增加而降低。因此，發酵過程中不需要在培養基中加入葡萄糖作為微生物生長的速效碳源。

圖2 葡萄糖含量對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

2.1.3 硫酸銨含量對發酵產物營養成分的影響

分別在培養基中加入不同質量比的硫酸銨(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)，以不加硫酸銨為對照，結果見圖3：

圖3 硫酸銨含量對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖3可以看出，硫酸銨添加量對粗蛋白含量影響很大，在一定范圍內，發酵培養基中隨著(NH4）2SO4含量的增加，營養成分含量也隨之增加。當發酵培養基中(NH4）2SO4含量為1%時，發酵產物中粗蛋白與不添加硫酸銨對照組的39.97%相比提高了0.58%，達到40.55%；總游離氨基酸含量比對照組3.48%提高了4.32%，達到7.80%。當（NH4）2SO4含量超過1%，營養成分呈下降趨勢。（NH4）2SO4作為微生物生長的速效氮源，在發酵前期，對微生物的生長有利，但發酵培養基中（NH4）2SO4的含量過高，改變了培養基的碳氮比，導致微生物大量生長而不分泌或少分泌某些酶類，從而影響了各成分含量。

2.2 發酵條件對發酵產物營養成分的影響

2.2.1 溫度對發酵產物營養成分的影響

將發酵培養基分別置于30℃、35℃、40℃、45℃恒溫培養箱中培養5d，結果見圖4：

圖4 發酵溫度對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

溫度是微生物生長和產生代謝產物的重要影響因素之一，合適的發酵溫度，有利于微生物的生長和代謝。從圖4可知，在30℃～40℃范圍內，粗蛋白、總游離氨基酸含量隨溫度的升高而提高。當發酵溫度為40℃時，達到最高，但隨著發酵溫度的進一步升高，隨之各成分下降，可能是因為高溫抑制了微生物產生酶所致。

2.2.2 起始pH值對發酵產物營養成分的影響

調節發酵培養基的初始pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，結果見圖5:

圖5 起始pH對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖5可以看出，發酵培養基的初始pH值為6.0時，粗蛋白含量為42.10%、總游離氨基酸含量9.42%,初始pH值大于6.0，發酵培養基中的各成分隨之下降，其原因有待進一步研究。

2.2.3 含水量對發酵產物營養成分的影響

調整發酵培養基的含水量為30%、35%、40%、45%、50%、55%，40℃恒溫發酵5d，結果見圖6:

圖6 含水量對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖6可以看出，隨著發酵料中含水量的增加，粗蛋白、總游離氨基酸的含量也在增加,當含水量為50%時，粗蛋白含量達到40.99%，比未發酵前提高了3.22%；總游離氨基酸含量8.35%，比未發酵前3.48%提高了4.87%。但含水量超過50%，各成分下降明顯。主要原因為發酵料中過高的含水量，可降低發酵料中氧氣濃度，從而導致厭氧發酵，影響營養成分含量提高。

2.2.4 接種量對發酵產物營養成分的影響

按菌種接種量分別為（V/W）2%、3%、4%、5%、6%、7%接入發酵培養基中，結果見圖7:

圖7 接種量對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

接種量的大小可直接影響發酵進度和代謝產物的生成量。接種量太小，延長發酵時間及增加雜菌污染的機會；接種量太大，可導致發酵前期營養物質消耗過快，不利于產物的形成和毒性物質的降解。圖7結果表明，當接種量為6%時，發酵料中粗蛋白含量達到42.63%，比發酵前提高了4.86%；總游離氨基酸含量10.58%，比其他接種量條件下活力提高明顯，與發酵前相比提高了7.10%。但增加接種量，營養物質含量下降。

2.2.5 裝量對發酵產物營養成分的影響

250 mL三角瓶中分別裝入30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g固體發酵培養基，結果見圖8:

圖8 裝量對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

圖8表明，當250 mL三角瓶中裝入70g發酵培養基時，粗蛋白含量、總游離氨基酸含量與其他裝量條件下相比，達到最高值，分別為42.94%、 11.80%，比未發酵前相比分別提高了5.17%、8.32%。

2.2.6 發酵時間對發酵產物營養成分的影響

在得到的上述最優條件下，分別發酵3d、4d、5d、6d、7d，結果見圖9:

圖9 發酵時間對粗蛋白、總游離氨基酸含量的影響

從圖9可以看出，隨著發酵時間的延長，發酵料中營養成分的含量和酶活也隨之提高，到發酵第6d，粗蛋白含量43.76%，提高達到5.99%；總游離氨基酸含量12.88%，提高了9.40%。但隨著發酵時間的延長，營養物質含量反而降低，主要原因是微生物代謝消耗所致。

2.3 正交試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，選用（NH4）2SO4添加量、物料含水量、發酵溫度和發酵時間等對發酵效果影響較大的4個因素作為考察，分別選取3個水平，以粗蛋白含量、總游離氨基酸含量為考察指標，采用SPSS 17.0對試驗結果進行分析，結果見下表：

根據上表結果可知，處理4的粗蛋白含量顯著高于其他八組處理及未發酵對照組(P＜0.05)，其他八組處理的粗蛋白含量也都顯著高于對照組(P＜0.05)。處理4總游離氨基酸含量提高效果顯著好于其他八組和對照組(P＜0.05)，其他八組處理提高效果也都顯著高于對照組(P＜0.05)。由粗蛋白含量、總游離氨基酸含量及極差分析可得出：A2B1悅2D3為最佳設計方案，即（NH4）2SO4添加量1%，含水量50%，發酵溫度40℃，發酵時間6d。

3 討論

3.1 微生物固態發酵棉粕蛋白質和氨基酸顯著提高

五株芽孢桿菌和酵母菌發生協同作用，使得微生物大量繁殖，向細胞外分泌一定量的多肽、酶蛋白等物質，同時利用底物及非蛋白氮合成大量菌體蛋白。由試驗結果可知，發酵產物中，粗蛋白提高了6.99%，比張慶華等報道提高的2.29%又提高了4.70%，總游離氨基酸提高了9.98%，比報道提高的2.66%又提高了7.32%，主要原因是微生物生長繁殖過程中消耗底物而導致發酵物的絕對含量減少和微生物利用非蛋白氮合成菌體蛋白，從而提高了發酵產物中粗蛋白和總游離氨基酸含量。

表1 L9（34）正交試驗結果

3.2 微生物固態發酵棉粕的最佳條件

以粗蛋白含量、總游離氨基酸含量活力作為固態發酵效果的評價指標，對復合芽孢桿菌和酵母菌共同固態發酵棉粕的組成及其配比，添加碳源、氮源種類及濃度，培養基的含水量進行了優化，得到固態發酵最佳條件為：棉粕：麥麩為90：10，（NH4）2SO4添加量1%，發酵溫度40℃，物料含水量50%，接種量6%，裝量為70g/250mL三角瓶，發酵時間6d。

本試驗按照得到的最優水平又進行了堆積發酵底物驗證，結果與預測結果接近，說明優化結果是可信的，具有較強的生產指導意義,為棉粕在畜牧水產養殖業中利用多菌種、多重發酵技術生產生物飼料的開發利用提供了一條新途徑。

（略）