堿脅迫對小麥（Triticum aestivum Linn）葉片代謝過程的影響

郭瑞，周際，楊帆，李峰

（1中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所，北京 100081；2農業部旱作節水農業重點實驗室，北京 100081；3國土資源部土地整治中心，北京 100034；4吉林省林業科學研究院，長春 130033）

堿脅迫對小麥（Triticum aestivum Linn）葉片代謝過程的影響

郭瑞1,2，周際3，楊帆4，李峰1

（1中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所，北京 100081；2農業部旱作節水農業重點實驗室，北京 100081；3國土資源部土地整治中心，北京 100034；4吉林省林業科學研究院，長春 130033）

【目的】闡明堿脅迫對小麥葉片離子平衡、初生及次生代謝產物的影響及其涉及的代謝途徑，討論其生長代謝變化規律及應答機制?！痉椒ā恳云胀ㄐ←湥═riticum aestivum Linn）為材料，采用盆栽試驗利用NaHCO3∶Na2CO3=1∶1混合模擬不同鹽度堿脅迫條件，在苗期連續脅迫12 d后測定葉片生長、光合、離子和代謝產物?！窘Y果】當堿脅迫強度超過小麥自身調節能力時，葉片中Na+含量劇增，加上高pH危害，造成葉綠體遭到破壞、葉綠素含量降低、光系統Ⅱ活性受抑制、氣孔導度及碳同化能力急劇下降，最終導致生長率降低。堿脅迫下Na+大量增加的同時陰離子明顯減少，造成葉片內負電荷虧缺和pH不穩定，導致離子平衡遭到破壞，進而引起一系列代謝途徑的協變反應。通過GC-MS檢測出73個代謝物，主要包括碳水化合物、氨基酸、有機酸等，其中，分別有25和48個代謝物在中度和重度堿脅迫下發生明顯改變。主成分分析（PCA）結果顯示全部樣本均分布在95%的置信區間內，2個主成分得分達到89%。單因素方差分析表明，與對照組比較，在高濃度堿脅迫下發生的顯著性變化明顯高于低濃度堿脅迫。堿脅迫導致5種參與三羧酸（TCA）循環和6種參與糖酵解途徑的代謝物含量明顯降低，且引起大部分氨基酸（谷氨酸、丙氨酸、γ-氨基丁酸、天冬氨酸等）和糖類及多元醇（果糖、蔗糖、塔羅糖、肌醇等）大量降低。與此同時，堿脅迫誘導小麥有機酸大量積累，隨脅迫強度的增加而上升，這種現象可能是小麥被動的適應調節過程，主要用于維持離子平衡并調節pH濃度?！窘Y論】堿脅迫引起了TCA循環、糖酵解途徑、卡爾文循環、莽草酸途徑、細胞膜脂代謝、轉氨基反應和γ-氨基丁酸（GABA）途徑等代謝網絡系統廣泛變化，暗示了堿脅迫不僅對糖類、氨基酸類、脂肪和蛋白質合成代謝過程造成負面影響，而且限制C-N轉變過程影響植物對N素的利用，造成營養匱乏抑制植物生長發育。

普通小麥；堿脅迫；葉片；生長特性；光合特性；代謝組

0 引言

【研究意義】至2050年，世界人口將新增2.3億，食物增加70%才能滿足需求，然而食物需求量并不與糧食的增加成正比，人口的快速增長與糧食短缺的矛盾日益加重[1]。同時，人類過渡開發利用自然資源，不僅引起嚴重的生態和環境問題，而且造成作物產量大幅度下降。在各種非生物逆境中，鹽堿脅迫成為制約糧食生產和影響糧食安全的最重要的限制因素[2]。據不完全統計，目前，全世界鹽堿地面積占總陸地面積的6%和灌溉農用地面積的20%，預計到2050年，將會有超過 50%的耕地會變得鹽堿化[1]?！厩叭搜芯窟M展】土壤所含致害鹽類除了以NaCl和Na2SO3為主的鹽土以外，還有NaHCO3和Na2CO3為主的堿土，鹽土和堿土往往同時存在，而且面積日益擴大[3]。堿土中主要致害離子為Na+、Cl-、HCO3-和CO32-，這些離子對植物的危害除了包括直接的脅迫效應外，還包括這些離子間復雜的相互作用[3-4]。另外，堿土的 pH高達9以上[5]。近年來，有關植物抗堿方面的研究越來越受到關注，YANG等[6]模擬不同堿脅迫條件研究小麥體內的pH及離子平衡，表明堿脅迫下小麥莖葉內的pH穩定不變，有機酸積累是小麥體內保持離子平衡和pH穩定的關鍵生理響應。賈娜爾·阿汗等[7]研究認為堿地膚耐堿性強在400 mmol·L-1的堿脅迫下仍能存活并維持一定的生長。趙楠等[8]研究發現堿蓬種子萌發及幼苗生長均隨著堿脅迫濃度升高而降低?！颈狙芯壳腥朦c】目前，這些研究主要涉及堿脅迫下植物的生態適應、生理響應、表觀遺傳學等方面，但很少涉及植物抗堿生理和分子機制，以及堿脅迫下植物代謝網絡調控應答機制。【擬解決的關鍵問題】本研究以普通小麥（Triticum aestivum Linn）為研究對象，依據堿土鹽分組成特點，以NaHCO3和Na2CO3模擬堿性鹽，對堿脅迫下小麥葉片生長、光合生理特性及相關代謝物進行測量，繪制小麥葉片代謝網絡通路，探討小麥葉片對堿脅迫響應的生理代謝調控機制，以期為耐鹽、耐堿小麥品種的篩選、鑒別及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和模擬脅迫

1.1.1 試驗材料 冬小麥品種：石家莊8號。

1.1.2 模擬脅迫 依據中國內陸堿性土壤特點，選取2種堿性鹽NaHCO3和Na2CO3按摩爾比1∶1混合模擬堿脅迫。利用 DDG-2080-S電導儀、美國 Wescor Psypro露點水勢儀和PHS-3C型數字pH計測定處理液的電導率、滲透勢和pH（表1）。

1.2 材料培養

采用盆栽試驗，塑料花盆直徑18 cm，高12 cm，底直徑11 cm，每盆裝2.5 kg洗凈的細砂，挑選飽滿的種子播種，每盆播種10粒。出苗后每盆定苗5株，每天用1倍Hoagland營養液進行澆灌。幼苗生長4周之后，選取長勢均勻的20盆分成4組。一組作為脅迫前的基礎生物量，一組作為對照組，其余兩組作為處理組。對照組只澆灌Hoagland營養液，處理組按照模擬不同鹽濃度脅迫對小麥進行連續12 d處理。整個試驗在溫室內進行，白天溫度設定在（25±1）℃，夜間溫度設定在（19±1）℃，溫室內光照均勻，每日光照時間為15 h。

表1 不同鹽濃度處理液電導率、滲透勢和pHTable 1 The electrical conductivity (EC), osmotic potential and pH of salinity stress treatment solutions

處理結束時，用蒸餾水洗凈全株, 并用吸水紙吸去附著的水分，將葉片與莖分離，稱取葉片鮮重（fresh weight，FW）并記錄。稱取少量鮮樣用于測定代謝物。然后將樣品置于105℃烘箱內殺青15 min處理，殺青后轉置80℃的真空干燥器內干燥至恒重，然后測定干重（dry weight，DW）。

1.3 生理指標測定

1.3.1 生長和光合特性指標測定 葉片相對生長率（relative growth rate，RGR）=（ln堿脅迫后干重- ln堿脅迫前干重）/處理天數；葉片含水量（absolute water content，AWC）=（鮮質量-干質量）/鮮質量[9]。

光合特性：連續12 d處理后利用LI-6400XT（Li-Cor, USA）便攜式光合儀對完全展開的葉片進行凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn）、氣孔導度（stomatal conductance，Gs）、胞間二氧化碳濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，E）的測定，測定時間為早上9：00—11：00，光量子通量設定為1 200 μmol·m-2·s-1，每個處理測定3個葉片。

熒光特性：待光合特性測量完畢后，利用IMAGING-PAM（Walz, Effeltrich, Germany）熒光儀測定葉綠素熒光參數：PSII原初光能轉換效率（Fv /Fm）、PSII電子傳遞量子效率（ΦPSⅡ）、光化學淬滅系數（qP）值。測定前，葉片暗適應20 min，每個處理測定3個葉片，所有操作均在背景光強低于1 μmol·m-2·s-1的環境中進行。儀器的飽和脈沖光的強度為 2 400 μmol·m-2·s-1，測量光低于 0.5 μmol·m-2·s-1[10]。

葉綠素含量：待熒光測量完畢后，將葉片采下洗凈磨碎，稱取樣品0.1 g，用1∶1的丙酮和無水乙醇作為萃取液進行萃取。在波長440、645和663 nm下測定吸光度OD值，應用以下計算公式[11]：葉綠素a（Chl a）= 9.784×OD663-0.99×OD645；葉綠素b（Chl b）= 21.426×OD663-4.65×OD645；類胡蘿卜素（Car）=4.7×OD440-0.27×（20.2×OD645+ 8.02× OD663）。

1.3.2 陽離子和陰離子含量的測定 應用美國戴安DX-300離子色譜儀（AS4A-SC色譜柱和CDM-Ⅱ電導檢測器），以Na2CO3/NaHCO3= 1.7/1.8 mmol·L-1的混合溶液作為流動相，對葉片中游離陽離子（K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+）和陰離子（NO3-、Cl-、SO42-、H2PO4-）含量進行測定。

1.3.3 代謝物檢測和篩選的測定 萃取衍生化：取100 mg小麥葉片樣本于2 mL離心管里，加入60 μL核糖醇漩渦混勻；再加入0.35 mL甲醇漩渦混勻。70 Hz 5 min研磨儀處理，70℃烘箱10 min；緊接著將樣本離心10 min（4℃，12 000 r/min）；移取0.35 mL上清液于2 mL進樣瓶。利用真空濃縮器干燥提取物（45℃，1.5 h）；干燥后加入80 μL甲氧胺鹽試劑，均勻混合后放入烘箱中孵育（37℃，2 h）；向每個樣品中迅速加入100 μL衍生化試劑N,O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺 Bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide（BSTFA）+ 1%三甲基氯硅烷（trimethylchlorosilane，TCMS），將混合物70℃反應1 h，冷卻至室溫[12]。

上機檢測：利用質譜聯機（GC-MS）進行上機檢測。檢測條件：DN-5MS毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm，J &W Scientific，Folsom，CA，USA）；進樣量 1 μL；載氣：氦氣；前進樣口吹掃流速：3 mL·min-1；流速：1 mL·min-1；柱溫：初始溫度90℃保持15 s，以10℃·min-1升至180℃·min-1，再以5℃·min-1升至240℃·min-1，再以20℃·min-1繼續升至285℃·min-1保持11.5 min。前進樣口溫度，傳輸線溫度和離子源溫度分別為280、245和220℃。電離電壓：-70 eV；掃描方式（全掃描）：20—600 m·z-1；掃描速度：100 spectra·s-1；溶劑延遲：492 s。

定性定量：應用Chroma TOF4.3X軟件和LECOFiehn Rtx5數據庫（LECO公司，USA）對通過GC-MS測量得到的數據進行定性和定量分析，使用內標標準化法處理導出的數據，內標物為核糖醇（純度≥99%）。

1.4 數據分析

生長、光合特性和陰陽離子數據處理及方差分析均用統計學程序SPSS17.0完成。每個數據均是5次重復的平均值及其標準誤差（S.E）表示，P＜0.05被視為顯著性差異。在代謝物分析中，首先采用主成分分析（principal components analysis，PCA）對數據進行分析，觀察樣本分布和異常值，繼而應用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis）進一步分析兩組間區分貢獻顯著的代謝物。根據相似度＞700、VIP（variable importance in the projection）＞1。

2 結果

2.1 堿脅迫對小麥生長和光合特性的影響

堿脅迫下小麥葉片 RGR隨鹽濃度增加而下降，當鹽濃度大于50 mmol·L-1后下降幅度增強；AWC變化趨勢和RGR基本相同（圖1-A和圖1-B，P＜0.05）。與對照相比，堿脅迫使小麥葉片光合作用受到抑制，其光合作用參數Pn、Gs、Ci和E下降明顯，且下降幅度隨鹽濃度增加而加強（圖1-C、圖1-D、圖1-E和圖1-F，P＜0.05）。堿脅迫下葉綠素a含量隨鹽濃度增加而下降，而葉綠素 b含量只有在高鹽度時下降明顯，堿脅迫沒有影響類胡蘿卜素含量變化（圖1-G、圖1-H和圖1-I，P＜0.05）。堿脅迫下Fv/Fm、 ΦPSⅡ和qP下降明顯，表明PSII反應中心利用光能的效率和潛在活性受到顯著影響（圖1-J、圖1-K和圖1-L，P＜0.05）。

2.2 堿脅迫對小麥葉片離子平衡的影響

如表2所示，小麥葉片中Na+含量隨鹽濃度增加呈現上升趨勢，堿脅迫下葉片中K+含量低于對照組，但隨鹽濃度的增加，含量變化不大（表2，P＜0.05）。Ca2+和Mg2+含量變化趨勢相似，含量隨鹽濃度增加下降趨勢加強（表2，P＜0.05）。與其他陽離子相比，Fe2+和Cu2+含量相對較低，Fe2+含量隨鹽濃度增加呈現下降趨勢，對照組中Cu2+含量明顯高于堿脅迫，中低脅迫（50 mmol·L-1）下與重度脅迫（100 mmol·L-1）沒有統計學上的差異（表2，P＜0.05）。隨著鹽濃度的增加，葉片中大部分的陰離子含量呈現下降的趨勢，包括 Cl-、NO3-和 H2PO4-含量；SO42-含量基本保持不變（表2，P＜0.05）。

2.3 堿脅迫下小麥葉片代謝組變化軌跡

利用GC-MS技術檢測小麥葉片對堿脅迫生理代謝響應過程，主成分分析（PCA）得分圖顯示，全部樣本均分布在 95%置信區間的 Hotelling T2 ellipsehr橢圓形內，2個主成分得分為 88.6%，不僅表明對照組與處理組有明顯差異，而且不同鹽濃度處理樣品分別聚為不同簇（圖2-A）。利用OPLS-DA進一步分析對照組與處理組GC-MS數據，R2和Q2分別代表模型的擬合度和預測能力。結果顯示，不同鹽濃度處理的小麥與對照組間明顯分開，各模型的擬合度和預測值均表明這些模型的可靠性，表明對照組和堿脅迫組小麥葉片代謝物發生了顯著性變化（圖2-B、圖2-C和圖2-D）。

表2 堿脅迫對小麥葉片干物質中陽離子和陰離子含量的影響(平均值±標準誤差，n = 5)Table 2 Effects of alkaline stress on the contents of free cation and anion in the dry mass of leaves of wheat seedlings (mean ± SE, n = 5)

圖1 堿脅迫對小麥葉片生長特征、光合特性、葉綠素含量和熒光特性的影響Fig. 1 Effects of alkaline stress on the growth, photosynthesis, chlorophyll content and fluorescence in wheat

圖2 小麥葉片在不同堿脅迫強度下代謝變化過程的PCA得分圖Fig. 2 Principal component analysis (PCA) score plots showing the metabolomic trajectory of leaves of wheat seedlings under different salinity concentration treatments

2.4 堿脅迫對小麥葉片代謝產物及代謝通路的影響

根據PCA和OPLS-DA分析結果，小麥在堿脅迫12 d后各處理組之間的代謝物存在明顯差異。與對照組相比，在檢測出的73個代謝物中，中度脅迫下，25個代謝物含量發生顯著性變化，其中，12個代謝物含量增加，13個代謝物含量減少；重度堿脅迫下，48個代謝物含量發生顯著性變化，其中，14個代謝物含量增加，34個代謝物含量減少（圖3-A和圖3-B，電子附表1）。另外，中度與重度脅迫之間有57個代謝物未發現明顯差異，在16個差異代謝物中，重度脅迫造成2個代謝物含量上升和14個代謝物含量下降（圖3-C，電子附表1）。堿脅迫對小麥葉片糖代謝產生明顯抑制作用，堿脅迫導致參與TCA循環的代謝物檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸以及參與糖酵解的代謝物葡萄糖、果糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、3-磷酸甘油酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸含量下降，100 mmol·L-1鹽濃度條件下的下降趨勢明顯大于50 mmol·L-1（圖4和電子附表 1）?？栁难h受堿脅迫影響較大，堿脅迫明顯抑制其代謝過程。在莽草酸代謝中堿脅迫促使莽草酸和奎尼酸的積累，但卻抑制其他參與代謝物的合成，尤其在重度脅迫下。高濃度堿脅迫造成肌醇、甘氨酸和絲氨酸含量大量降低，表明細胞膜代謝受到明顯抑制。

3 討論

3.1 堿脅迫對小麥生長和光合特性的影響

圖3 堿脅迫下小麥葉片代謝物比較Fig. 3 Comparison of metabolic profiles in leaves under alkaline stress

圖4 PCA和OPLS-DA分析提出堿脅迫下小麥葉片中代謝途徑網絡變化圖Fig. 4 Proposed metabolic network changes in wheat leaves under alkaline stress obtained from PCA and OPLS-DA analysis

堿脅迫主要包括滲透脅迫、離子毒害及高pH脅迫，導致泡內質子減少、破壞細胞膜、影響跨膜電化學勢梯度[13]。植物相對生長率（RGR）和含水量（WC）可反映植物體受到外界環境脅迫時的基本生理反應[6]。本研究結果表明，中度堿脅迫已經明顯抑制小麥葉片RGR和WC，而且隨鹽濃度增加急劇下降（圖1-A和圖1-B）。小麥葉片中Na+大量積累，高pH使得Ca2+和Mg2+沉淀進一步加劇離子毒害，導致生長、發育受到抑制（表 2）。小麥受到堿脅迫后，其光合作用受到明顯抑制，盡管葉片氣孔導度下降，但氣孔限制并不是光合作用降低的主要原因（圖 1-C、圖 1-D、圖1-E和圖1-F）。堿脅迫引起Mg2+沉淀從而抑制了葉綠素的合成，尤其是在高濃度堿脅迫下下降明顯；同時，高pH阻礙卡爾文循環過程，因此，堿脅迫下光合作用下降的主要原因是葉綠體功能障礙（圖1-G和圖1-H）。堿脅迫導致葉綠素含量降低，使得PSII、ΦPSⅡ和qP明顯下降，這表明堿脅迫影響光系統Ⅱ原初光能轉換效率及光系統Ⅱ潛在活性受到抑制，直接影響了光合作用的電子傳遞和CO2同化過程[6,14]。

3.2 堿脅迫對小麥葉片代謝產物的影響

生長在鹽漬土壤中的植物通常在體內積累大量Na+，這與滲透調節能力密切相關[15]。由于 Na+和 K+水合半徑相似，因此，它們之間存在拮抗競爭[16-17]。本研究結果顯示，堿脅迫下葉片中 Na+含量增加不僅可能直接引起K+和Mg2+、Ca2+和微量元素含量降低，還可能影響Cl-、NO3-和H2PO4-積累（表2，P＜0.05）。這些重要營養元素的缺乏，可能直接或間接地影響光合作用及其他代謝途徑[18-20]。本研究利用 GC-MS代謝組學分析方法，對堿脅迫下小麥葉片代謝物進行系統分析，結果表明，堿脅迫引起小麥代謝組改變，包括許多代謝過程如光合作用、TCA循環、糖酵解/糖異生和氨基酸代謝。

鹽漬條件誘導植物產生大量活性氧（ROS），包括氧化氫（H2O2）和氧（O2-）；它們會激活蛋白酶并誘導細胞內部產生過量的NH4+[21]。植物體通常為避免NH4+過量會把多余的 NH4+通過轉氨作用轉化成谷氨酸/谷氨酰胺，或者通過谷氨酸脫氫酶轉化為α-酮戊二酸進入 TCA循環[22]。研究發現與對照組比較，在堿脅迫條件下5種TCA循環代謝中產物含量顯著下降，明顯抑制TCA循環，表明能量代謝遭到破壞（圖4）。由于 TCA循環是糖、脂肪酸和氨基酸代謝過程的樞紐，因此，堿脅迫不僅對糖、脂肪和蛋白質合成代謝過程造成負面影響，而且限制C-N轉變過程，直接影響谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等部分氨基酸的合成[23-24]。轉氨基產物（天冬酰胺、天冬氨酸和谷氨酰胺）降低進一步證明堿脅迫阻礙C-N轉化，影響N素的積累（圖 4）。糖類是光合作用的初級產物，為植物的生長發育提供能量及C骨架。本研究結果顯示，在堿脅迫條件下，小麥葉片內參與糖酵解過程的代謝物合成受到抑制，如葡萄糖、果糖-6-磷酸、丙酮酸等；與此同時，堿脅迫迫使小麥葉片內糖類及多元醇含量顯著性下降，如果糖、蔗糖、塔羅糖、肌醇、木糖醇等（圖4，電子附表1）。結合堿脅迫下小麥光合速率、葉綠素含量及PSⅡ反應顯著下降的研究結果，表明堿脅迫對糖類的合成和貯存有明顯的負效應，在高 pH環境下植物細胞中 Na+大量積累造成離子毒害，不僅破壞光合器官影響卡爾文循環，同時對糖酵解途徑也產生了嚴重的抑制作用，這意味著高pH使得植物體本身清除活性氧（ROS）能力明顯下降[25]。

GABA作為N代謝中間產物，在pH調節、滲透調節、TCA循環回補以及提高植物抗逆性等方面起著重要作用[26-27]。一般情況下植物在干旱或熱脅迫環境中積累大量GABA，但高堿脅迫造成GABA含量明顯下降，這暗示著高堿脅迫抑制谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GDC）活性的同時，阻礙腐胺的降解轉化過程[21]。另外，結合丙氨酸和琥珀酸的大量減少，研究結果進一步證明堿脅迫破壞GABA對TCA循環回補作用，加劇堿脅迫對TCA循環的抑制作用。莽草酸代謝途徑是產生多種次生代謝產物的重要途徑之一，對細胞壁生物合成起重要作用[28]。盡管堿脅迫下莽草酸和奎尼酸大量積累，但苯丙氨酸和酪氨酸含量降低，結合PEP結果表明堿脅迫抑制木質素、苯丙酸類化合物等次生代謝產物，而莽草酸和奎尼酸的增長可能并不是用于合成木質素以及細胞外壁，而更可能是用于細胞內滲透調節。堿脅迫造成參與細胞膜脂代謝產物含量降低，尤其是肌醇大量減少，這表明高pH和大量 Na+抑制細胞膜脂代謝過程，進而破壞細胞膜穩定性降低植物抗堿性[29]。

在堿脅迫引起小麥葉片氨基酸含量減少，其主要原因可能是由高 pH對氮吸收的抑制造成的[30-31]。研究發現堿脅迫誘導小麥葉片中積累大量有機酸，結合糖類和氨基酸類代謝產物的變化情況，這表明有機酸積累是一個重要調節過程，當堿脅迫超過植物體 pH調節能力時，導致 Na+大量累積陰離子嚴重虧缺，植物體被動積累有機酸用于細胞內離子平衡和pH調節（電子附表 1）。因此，推測在堿脅迫條件下植物體有機酸積累量以及對堿脅迫強度的反應速度可以用來指示植物抗堿性和堿害程度。

4 結論

與鹽脅迫相比，堿脅迫對植物的影響更大。堿脅迫下 Na+大量積累和高pH環境破壞細胞膜和跨膜電化學勢梯度，抑制葉綠素合成造成葉綠體功能障礙，影響光系統Ⅱ原初光能轉換效率、光合作用和CO2同化過程，最終導致植物生長受阻甚至死亡。堿脅迫致使葉片中Na+含量激增，K+含量驟降，同時造成礦質元素和陰離子吸收受阻，進而導致離子嚴重失衡，推測其與SOS信號系統受到干擾有關。與對照組比較，分別有25和48個代謝物在中度和重度堿脅迫下發生明顯改變。堿脅迫下小麥葉片中糖類代謝物含量顯著性下降，結合光合特性結果表明堿脅迫顯著降低植物對氮代謝的利用。同時堿脅迫引起代謝通路改變，如TCA循環、糖酵解、卡爾文循環、氨基酸代謝和細胞膜脂代謝等，表明堿脅迫明顯抑制小麥葉片中多數代謝途徑，造成碳水化合物和氨基酸含量降低，消耗大量的能量，但堿脅迫誘導積累大量有機酸。因此，堿脅迫不僅對糖類、氨基酸類、脂肪和蛋白質合成代謝過程造成負面影響，同時限制C-N轉變過程影響植物對N素的利用，造成營養匱乏抑制植物生長發育；而有機酸的積累是一個重要調節過程，用于細胞內離子平衡和pH調節。

[1] FAO. FAO land and plant nutrition management service. FAO, Rome. http://wwwfaoorg/ag/agl/agll/spush. 2009.

[2] FAO. Global network on integrated soil management for sustainable use of salt affected soil. FAO, Rome. http://www.fao.org/ag/agl/agll/ spush.2005.

[3] 李彬, 王志春, 孫志高, 陳淵, 楊福. 中國鹽堿地資源與可持續利用研究. 干旱地區農業研究, 2005, 23(2): 152-158. LI B, WANG Z C, SUN Z G, CHEN Y, YANG F. Resources and sustainable resource exploitation of salinized land in China. Agricultural Research in the Arid Areas, 2005, 23(2): 152-158. (in Chinese)

[4] 俞仁培. 我國鹽漬土資源及其開發利用. 土壤通報, 1999, 30(4): l58-159. YU R P. Saline soil resources in China and their exploitation. Chinese Journal of Soil Science, 1999, 30(4): l58-159. (in Chinese)

[5] SHI D C, WANG D. Effects of various salt-alkaline mixed stresses on Aneurolepidium chinense (Trin.). Plant Soil, 2005, 271: 15-26.

[6] YANG C, SHI D, WANG D. Comparative effects of salt stress and alkali stress on growth, osmotic adjustment and ionic balance of an alkali resistant halophyte Suaeda glauca (Bge.). Plant Growth Regulation, 2008, 56: 179-190.

[7] 賈娜爾·阿汗, 楊春武, 石德成, 王德利. 鹽生植物堿地膚對鹽堿脅迫的生理響應特點. 西北植物學報, 2007, 27: 79-84. JIANAER·A H, YANG C W, SHI D C, WANG D L. Physiological response of an alkali resistant Halophyte Kochia sieversiana to salt and alkali stresses. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2007, 27: 79-84. (in Chinese)

[8] 趙楠, 蘆艷, 左進城, 魯周民. 堿脅迫對堿蓬種子萌發的影響. 北方園藝, 2012, 1: 45-47. ZHAO N, LU Y, ZUO J C, LU Z M. Effect of alkali stress on seed germination of Suaeda glauca Bunge. Northern Horticulture, 2012, 1: 45-47. (in Chinese)

[9] KINGSBURY R W, EPSTEIN E, PEARY R W. Physiological responses to salinity in selected lines of wheat. Plant Physiology, 1984, 74: 417-423.

[10] GENTY B, BRIANTAIS J M, BAKER N R. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electrontransport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochimica et Biophysica Acta, 1989, 990: 87-92.

[11] ARNON D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts phenoloxidases in Beta vulgaris. Plant Physiology, 1949, 24: 1-15.

[12] LISEC J, SCHAUER N, KOPKA J, WILLMITZER L, FERNIE A R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols, 2006, 1: 387-396.

[13] 石德成, 李玉明, 楊國會, 李毅丹, 趙可夫. 鹽堿混合生態條件的人工模擬及其對羊草脅迫作用因素分析. 生態學報, 2002, 22(8): 1317-1326. SHI D C, LI Y M, YANG G H, LI Y D, ZHAO K F. A simulation of salt and alkali stress mixed ecological conditions and analysis of their stress factors in the seedlings of Aneurolepidium Chinense. Acta Ecological Sinica, 2002, 22(8): 1317-1326. (in Chinese)

[14] SHI D C, ZHAO K F. Effects of NaCl and Na2CO3on growth of Puccinellia tenuiflora and on present state of mineral elements in nutrient solution. Acta Prataculturae Sinica, 1997, 6: 51-61.

[15] MUNNS R, TESTER M. Mechanisms of salinity tolerance. Annual Review of Plant Biology, 2008, 59: 651-681.

[16] PARIDA A K, DAS A B. Salt tolerance and salinity effects on plants: A review. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2005, 60: 324-349.

[17] ZHU J K. Regulation of ion homeostasis under salt stress. Current Opinion in Plant Biology, 2003, 6: 441-445.

[18] 楊春武, 李長有, 張美麗, 劉杰, 鞠淼, 石德成. 鹽、堿脅迫下小冰麥體內的pH及離子平衡. 應用生態學報, 2008, 19(5): 1000-1005. YANG C W, LI C Y, ZHANG M L, LIU J, JU M, SHI D C. pH and ion balance in wheat-wheatgrass under salt-or alkali stress. Chinese Journal of Applied Ecology, 2008, 19(5): 1000-1005. (in Chinese)

[19] WANG X P, GENG S J, RI Y J, CAO D H, LIU J, SHI D C, YANG C W. Physiological responses and adaptive strategies of tomato plants tosalt and alkali stresses. Scientia Horticulturae, 2011, 130: 248-255.

[20] 郭瑞, 李峰, 周際, 李昊儒, 夏旭, 劉琪. 亞麻響應鹽、堿脅迫的生理特征. 植物生態學報, 2016, 40(1): 69-79. GUO R, LI F, ZHOU J, LI H R, XIA X, LIU Q. Eco-physiological responses of linseed (Linum usitatissimum) to salt and alkali stresses. Chinese Journal of Plant Ecology, 2016, 40(1): 69-79. (in Chinese)

[21] CUI Q, LEWIS I A, HEGE A D, ANDERSON M E, LI J, SCHULTE C F, WESTLER W M, EGHBALNIA H R, SUSSMAN M R, MARKLEY J L. Metabolite identification via the Madison mrtabolomics consortium database. Nature Biotechnology, 2008, 26: 162-164.

[22] DAI H, XIAO C, LIU H, TANG H. Combined NMR and LC-MS analysis reveals the metabonomic changes in Salvia miltiorrhiza Bunge induced by water depletion. Journal of Proteome Research, 2010, 9: 1460-1475.

[23] 郭偉, 于立河. 鹽堿脅迫對小麥幼苗根系活力和苯丙氨酸解氨酶活性的影響. 作物雜志, 2012, 1: 31-34. GUO W, YU L H. Effects of salinity-alkalinity stress on root activity and phenylalanine ammonia-lyase activity of wheat seedlings. Crops, 2012, 1: 31-34. (in Chinese)

[24] 胡海燕, 賀杰, 趙俊杰, 茹振剛. 堿性 pH條件下小麥幼苗保護酶活性的變化動態. 河南科技學院學報(自然科學版), 2013, 41: 1-5. HU H Y, HE J, ZHAO J J, RU Z G. Dynamic change of cell defense enzyme activity in wheat seedling under different alkaline pH conditions. Journal of Henan Institute of Science and Technology (Natural Science), 2013, 41: 1-5. (in Chinese)

[25] YANG C W, WAND P, LI C Y, SHI D C, WANG D L. Comparison of effects of salt and alkali stresses on the growth and photosynthesis of wheat. Photosynthetica, 2008, 46(1): 107-114.

[26] BOUCHE N, FROMM H. GABA in plants: Just a metabolites? Trends in Plant Sciences, 2004, 9: 110-115.

[27] SHELP B J, BOWN A W, FAURE D. Extracellular gamma-Aminobutyrate mediates communication between plants and other organisms. Plant Physiology, 2006, 142: 1350-1352.

[28] 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長法. 生物化學(第三版). 北京: 高等教育出版社, 2002. WANG J Y, ZHU S G, XU C F. Biochemistry (3rd). Beijing: Higher Education Press, 2002. (in Chinese)

[29] ROOSENS N H, WILLEM R, LI Y, VERBRUGGEN I, BIESEMANS M, JACOBS M. Proline metabolism in the wild-type and in a salt-tolerant mutant of Nicotiana plumbaginifolia studied by 13C-nuclear magnetic resonane imaging. Plant Physiology, 1999, 121: 1281-1290.

[30] 鄧若磊, 徐海榮, 曹云飛, 肖凱. 植物吸收銨態氮的分子生物學基礎. 植物營養與肥料學報, 2007, 13(3): 512-519. DENG R L, XU H R, CAO Y F, XIAO K. The molecular basis of ammonium transporters in plants. Plant Nutrition and Fertilizer Science, 2007, 13(3): 512-519. (in Chinese)

[31] 駱媛嬡, 柳參奎. 植物中銨轉運蛋白的研究進展. 基因組學與應用生物學, 2009, 28(2): 373-379. LUO Y Y, LIU S K. Research progress of ammonium transporter in plants. Genomics and Applied Biology, 2009, 28(2): 373-379. (in Chinese)

（責任編輯 李莉）

Effects of Alkaline Stress on Metabonomic Responses of Wheat (Triticum aestivum Linn) Leaves

GUO Rui1,2, ZHOU Ji3, YANG Fan4, LI Feng1
(1Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Key Laboratory of Dryland Agriculture, Ministry of Agriculture, Beijing 100081;3Land Consolidation and Rehabilitation Centre, The Ministry of Land and Resources, Beijing 100034;4Jilin Provincial Academy of Forestry Science, Changchun 130033)

【Objective】 A pot experiment was conducted to investigate the alkaline stress in ion balance and metabolic profiles of wheat, to determine the physiological adaptive mechanisms of wheat in tolerance to alkali stress. 【Method】 In a pot experiment with control and alkaline stress (NaHCO3∶Na2CO3=1∶1), the growth and photosynthetic characters, ion and 73 key metabolites ofwheat were studied. 【Result】The results showed that when alkaline stress intensity exceeded the capacity of wheat adjustment, Na+accumulation in cells in a high-pH environment resulted in damage of the photosynthetic system, reduced photosynthetic pigments, inhibited the activity of photosystem II, and reduced high stomatal conductance and net photosynthetic rate. Alkaline stress caused massive influx of Na+, a decrease of inorganic negative charge and pH value homeostasis, thus resulting ionic unbalance and leading to a series of strain metabolic response. In addition, 73 metabolites were detected in different alkaline stress treatments according to GC-MS analysis, and these metabolites were sugars/polyols, organic acids, amino acids and others. Compared with the control sample, the response of 25 and 48 metabolites in moderate and severe alkaline stress treatments remarkably changed, respectively, in leaves of wheat seedlings. The results of one-way ANOVA analysis indicated that the changes of metabolites were more significant under high alkaline stress than that under moderate alkaline stress. The results revealed that alkaline stress caused an significant decrease in levels of 5 and 6 metabolites, which are involved in TCA cycle and glycolysis; it also caused amino acids (glutamate, alanine, γ-aminobutyric acid, aspartic acid) and sugars/ploys (fructose, sucrose, talose, myo-inositol) decreased dramatically. Meanwhile, alkaline stress induced organic acids accumulation in wheat, and it maybe a passive adaptive response to alkaline stress, and organic acids kept ionic balance and pH homeostasis. 【Conclusion】 The results suggested that alkaline stress caused systems alterations in metabolic networks including TCA cycle, glycolysis, calvin cycle, shikimic path way, metabolism of plasma membrane, GS/GOGAT cycle and GABA path way, implying alkaline stress not only had side effect on synthesis of sugars, amino acids, fats and proteins, but also inhibited the translation between C and N, thus resulted in nutrients deficiency and caused decrease of plant growth and development.

wheat (Triticum aestivum Linn); alkali stress; leaves; growth characters; photosynthetic characters; metabonomic

2016-06-01；接受日期：2016-08-12

國家自然科學基金青年基金（31200243）、國家自然科學基金面上項目（31570328）、國家“863”計劃（2011AA100503）、中央公益性科研業務費（BSRF201201）

聯系方式：郭瑞，Tel：010-82105981；E-mail：guor219@yahoo.com