泛素系統在結核分枝桿菌與宿主相互作用中的調控機制研究進展①

柴琪瑤 劉翠華

(中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫學重點實驗室，北京100101)

·專家述評·

泛素系統在結核分枝桿菌與宿主相互作用中的調控機制研究進展①

柴琪瑤 劉翠華

(中國科學院微生物研究所病原微生物與免疫學重點實驗室，北京100101)

結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)是一種極其成功的胞內病原菌，可通過多種策略實現免疫逃逸，從而在宿主巨噬細胞中長期存活。在對抗病原菌的防御過程中，泛素系統(Ubiquitin system)在激活宿主炎癥免疫反應、細胞自噬、吞噬體成熟和細胞死亡等天然免疫功能及相關信號通路中發揮了重要的調控作用。而另一方面，近年的研究表明Mtb等胞內病原菌可通過分泌效應蛋白(Effector proteins)挾持并利用宿主泛素系統進而抑制宿主的免疫功能，這些病原-宿主互作的界面有望成為抗結核藥物研發的新靶點。

泛素系統；結核分枝桿菌；巨噬細胞；天然免疫；信號通路；效應蛋白

柴琪瑤(1992年-)，2014年本科畢業于浙江大學植物保護專業，同年推薦免試進入中國科學院微生物研究所病原生物學專業，師從劉翠華教授碩博連讀。主要從事結核分枝桿菌和巨噬細胞相互作用的分子機制研究。

劉翠華(1976年-)，中國科學院微生物研究所研究員，課題組長，博士生導師。任“中國防癆協會結核病基礎專業分會”和“中國免疫學會青年工作委員會”等委員以及Scientific Reports等國際期刊編委。主要從事病原菌感染和宿主免疫防御的分子機制等方面的研究，在結核分枝桿菌逃逸宿主固有免疫機制等方面的研究中取得了一系列成果，在Cell、Nat Immunol、PNAS、J Immunol等期刊發表學術論文40余篇，作為編委或編者參編《泛素介導的蛋白質降解》等專著6部。

由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的結核病(Tuberculosis,TB)是全球十大“致死性疾病”之一。世界衛生組織報告顯示，僅2015年全球就有1 040萬新增結核病例和140萬死亡病例；我國的結核患者數量(約91.8萬人)居世界第三位，同時也是耐多藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)病例最多的國家之一[1,2]。由于特殊的潛伏特性以及耐藥結核病的出現和泛濫，結核病的防治工作面臨巨大的挑戰。深入研究Mtb與宿主的相互作用機制、為結核病的快速診斷和新藥研發提供新靶點迫在眉睫。

泛素(Ubiquitin，Ub)是真核生物中的一種由76個氨基酸組成的小分子量蛋白，能夠通過共價結合的方式連接到底物蛋白分子的賴氨酸殘基上而介導靶蛋白的降解[3]。自上世紀70年代被鑒定以來，人們發現泛素不僅是蛋白質降解的信使，而且在細胞增殖和死亡、囊泡運輸、轉錄調控、DNA損傷修復及感染免疫等生理過程中發揮重要的調控作用[4]。本文所討論的泛素系統包括泛素、泛素化(Ubiqu-itination)或去泛素化(Deubiquitination)修飾相關的酶、泛素結合蛋白或受體等，以及上述蛋白參與的各類泛素修飾過程。這些元素構成的泛素系統在機體天然免疫系統抵御病原菌感染的過程中起到了多種調節作用。Mtb作為一種典型的胞內菌在與宿主長期共存的過程中進化出多種免疫逃逸策略，本文將對泛素系統在結核分枝桿菌與宿主互作過程中的調控機制進行論述，以期為結核感染及致病的分子機制研究提供新的思路。

1 結核分枝桿菌與宿主相互作用的分子機制

Mtb是一種強傳染性的胞內病原菌，活動性結核病患者咳出的氣溶膠只要攜帶1～3個活性菌體便可通過呼吸系統感染一個新的健康個體[5]。一般情況下，侵入肺部的非致病分枝桿菌，如恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)等將被肺泡巨噬細胞(Alveolar macrophage)識別和吞噬，最終被溶酶體的各類水解酶、活性氮/氧等物質殺滅。然而，致病性的Mtb卻能避免被宿主完全清除。在肺表面感染Mtb的巨噬細胞將攜帶菌體穿過上皮細胞深入感染肺組織，并不斷地產生分化和聚集。隨后，淋巴細胞(Lymphocyte)和樹突狀細胞(DC)等多種免疫細胞也會集結到周圍，最終在受感染的組織處發展成肉芽腫(Granuloma)[5]。一些學者認為，宿主細胞形成穩固的肉芽腫可在一定程度上限制病原菌的感染和擴散，迫使其進入休止(Quiescence)狀態[5,6]。然而，也有研究表明在感染初期Mtb會主動促進肉芽腫的形成，并利用這種特殊結構來侵入新的細胞和組織，幫助其定殖和擴散[5,7]。雖然諸多生物學特性尚未被揭示，但研究者發現只要機體的免疫功能穩健，肉芽腫對宿主的健康并不顯示負面影響；只有當機體免疫系統發生衰退或缺陷時，Mtb才會結束漫漫“長征”而伺機活化和大量增殖[7]。換言之，肉芽腫實際上是Mtb與宿主免疫系統之間長期博弈最終達到制衡狀態的產物，而Mtb與巨噬細胞的相互作用成為了這場戰役中最核心的部分。

進入宿主體內后，Mtb的細胞壁成分如磷脂酰肌醇甘露糖(PIM)、脂質阿拉伯甘露聚糖(LAM)及其他一些外膜分子將被巨噬細胞通過膜表面受體所識別，這些受體有甘露糖受體(MR)、Toll-樣受體(TLR)、補體受體(CR)、凝集素受體(DC-SIGN)和免疫球蛋白Fc段受體(Fc receptor)等，并進一步激活下游效應分子而引發宿主免疫防御。以TLR為例，Mtb細胞壁的脂蛋白(Lipoprotein)、脂多糖(Liposaccharide)及CpG DNA可以作為TLR2的配體被識別而激活下游的NF-κB信號通路，并刺激TNF-α的分泌進而活化巨噬細胞，同時激發維生素D受體及維生素D-1-羥化酶基因的表達誘導抗菌肽(Cathelicidin)的釋放[8]。被吞噬入胞后，Mtb仍將面臨多方面的免疫清除作用。Mtb除了通過內吞/吞噬體途徑(Endocytic/phagocytic pathway)被降解外，逃離吞噬體的病原菌還會觸發細胞自噬(Autophagy)而被重新捕獲和清除。例如，NOD是一類重要的天然免疫胞內識別受體，Mtb的胞壁酰二肽(MDP)受到NOD2的識別后，將激發宿主炎癥因子及氮氧化物(NO)的釋放來起到殺菌作用，同時活化的NOD2將誘導細胞發生自噬[9]。

然而，作為最古老的傳染病之一的Mtb在與宿主長期的協同進化中采取了一系列特殊的免疫逃逸和調控策略來達到對宿主的生境適應(Local adaptation)目的[10]。Mtb有別于其他細菌的一個重要特征是具有復雜的膜結構——由類似革蘭氏陰性菌內膜的質膜(Plasma membrane)、富含糖蛋白的周質區(Periplasmic space)以及高度疏水的外膜(Outer membrane)構成，這讓體內微生境(Niche)中的Mtb能夠有效地隔離有害物質，并使其擁有一套獨特的分泌系統[11]。Mtb具有GSP/SecA1、Tat、SecA2及ESAT6四類分泌系統，其中，ESAT6分泌系統又稱Ⅶ型分泌系統(T7SS)或Esx分泌系統，能夠分泌多種效應蛋白(Effector proteins)，成為抵抗宿主免疫系統的利器[11,12]。Mtb能夠編碼ESX-1～5五種ESAT6分泌系統，以ESX-1為例，該系統由EccB/C/D/E四個膜組分構成跨越細菌質膜的分泌孔道，其中EccC的胞質結構域能夠識別EccA并與之形成AAA+ATPase，而EspG扮演分子伴侶(Chaperone)的角色與底物蛋白結合形成穩定的異二聚體，在胞質中EccA/G兩個輔助因子的幫助下指導底物蛋白結合到分泌通道復合物上；此外，Mtb的膜蛋白酶MycP還能進一步對ESX-1分泌蛋白進行加工，成熟的效應蛋白隨后被遞送到菌表面或宿主細胞內發揮多樣化的免疫調控作用[12]。目前，對于T7SS系統的結構和機制還所知甚少，ESX系統和分泌底物之間、效應蛋白和細菌毒力之間的微妙聯系等都是Mtb致病機制研究的熱點。

2 泛素系統調控宿主天然免疫信號通路的機制

2.1 泛素修飾的分子機制 經典的泛素化過程一般需要三種泛素化酶的參與，即通過泛素激活酶(Ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素偶聯酶(Ubiquitin-conjugating enzyme，E2)和泛素連接酶(Ubiquitin-ligase enzyme，E3)的協助來活化泛素分子并將其轉移到靶蛋白上，形成多聚泛素化(Polyubiquitination)或單泛素化(Monoubiquitionation)修飾[3]。多聚泛素化修飾按泛素之間所連接的賴氨酸位點的不同可以分為K6、K11、K27、K29、K33、K48及K63泛素鏈；泛素也能夠被一類特殊的E3，即線性泛素鏈組裝復合物LUBAC通過N端甲硫氨酸與另一泛素分子的羧基相連，形成線性泛素化(Linear ubiquitination)[13]。然而，最近發現嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)分泌的一類SidE家族效應蛋白SdeA具有單-ADP-核糖轉移酶模序(Mono-ADP-ribosyltransferase motif)，能夠通過ADP-核糖基化來活化泛素分子，在無需E1、E2的參與下直接泛素化宿主的多種Rab GTPase，被稱為一體化泛素連接酶(All-in-one E3)[14]。此外，蛋白質的泛素化修飾實際上也是一個可逆的過程，與泛素化酶功能相反，真核生物和一些原核生物能夠編碼一些去泛素化酶(DUBs)來水解并破壞底物蛋白與泛素之間或多聚泛素鏈內的硫酯鍵[13]。

泛素除了可以通過共價結合的方式連接到靶蛋白上以外，某些蛋白可直接通過非共價作用結合上單個泛素或泛素鏈。這類泛素結合蛋白往往存在一個或多個泛素結合域(UBD)，雖然這些UBD在三級結構上呈現出多樣性，如α-螺旋結構的泛素互作模序(UIM)、鋅指(ZnF)結構、pleckstrin同源(PH)折疊結構和泛素偶聯酶變體(UEV)等，大部分UBD都是通過識別并結合泛素分子由Leu8、Ile44、His68及Val70組成的疏水氨基酸簇而產生相互作用[15]。綜上所述，泛素系統復雜多變的蛋白修飾和互作方式奠定了其在天然免疫信號網絡中進行精確調控的分子基礎。

2.2 泛素系統對炎癥免疫信號通路的調控 模式識別受體(PRR)是一類能夠識別病原相關分子模式(PAMP)和損傷相關分子模式(DAMP)的重要免疫受體，包括上述的TLR、NOD樣受體(NLR)及RIG-Ⅰ樣受體(RLR)等。PRR感應到病原菌入侵后，將通過信號級聯網絡刺激促炎細胞因子和Ⅰ型干擾素的釋放，并刺激NF-κB和MAPK等炎癥相關信號通路的活化。例如，巨噬細胞膜表面受體TLR4以病原菌表面的脂多糖(LPS)作為配體，在接頭蛋白TIRAP的幫助下集聚轉接分子MYD88，后者通過結合IRAK4和IRAK1兩類激酶來招募TNF受體相關因子TRAF3/6及凋亡抑制因子cIAP1/2，最終在質膜內側形成信號級聯復合物[16]。其中，具有E3連接酶功能的TRAF6在Ubc13-Uev1a組成的E2復合物的作用下連接K63泛素鏈而活化，并同時泛素化IRAK1和cIAP1/2[17]。這些K63泛素鏈在信號網絡中起到了腳手架的作用，能夠通過結合底物分子(如TAB2/3和NEMO)來進一步募集和激活TAK1和IKK兩類激酶復合物；此外，LUBAC介導的NEMO在Lys285與Lys309位點的線性泛素化對NF-κB通路中的信號傳遞也具有重要意義[18]。TAK1活化后，能夠通過激活MAPK激酶MKK4/6/7來刺激JNK及p38信號通路，同時磷酸化激活IKK；而活化的IKK能夠磷酸化IκBα并介導其被SCFβTrCP E3連接酶K48泛素化降解，從而解除對NF-κB的抑制，使后者入核調控免疫相關基因的表達[19]。

近年來，炎癥小體(Inflammasome)信號通路在調節炎癥免疫方面的功能愈來愈受到研究者的重視。炎癥小體復合物由受體、凋亡相關斑點樣蛋白ASC以及前體caspase-1(pro-caspase-1)所組成。NLR家族如NLRP3、NLRP1、NLRC4及胞質中的DNA感受器AIM2是目前已發現的幾類炎癥小體受體，感應刺激后，將通過激活caspase-1介導促炎細胞因子IL-1β和IL-18的釋放并誘導細胞焦亡(Pyroptosis)[20]。與凋亡(Apoptosis)不同的是，細胞焦亡是炎性caspase(caspase-1和/或caspase-11)活化后發生的炎癥性細胞死亡方式，將導致細胞膜破裂出現孔隙，引起細胞溶脹裂解，從而破壞胞內寄生菌定殖的微生境，使其出胞后被其他免疫細胞所吞噬和殺滅。目前，泛素系統對于NLRP3炎癥小體的調控機制較為清楚。巨噬細胞在靜息狀態時，胞內的 E3連接酶SCF的FBXL2催化亞基能夠通過K48泛素化修飾NLRP3而介導其降解；當受到病原菌配體LPS刺激時，細胞將誘導提高E3連接酶FBXO3的表達，后者通過泛素化降解FBXL2來維持NLRP3的蛋白水平，起到炎癥上調作用[21]。其次，胞質中一類K63去泛素化酶BRCC3能夠通過直接去泛素化穩定NLRP3的蛋白水平[21]。另一方面，泛素系統對炎癥小體信號通路存在有效的負調控機制，從而避免過度活化的炎癥反應導致細胞損傷。例如，巨噬細胞內的去泛素化酶A20可抑制炎癥小體復合物中caspase-1對前體IL-1β(pro-IL-1β)的切割活性，同時能夠去除pro-IL-1β的K63泛素化而起到負調節作用[22]。另一項對神經遞質多巴胺(Dopamine)的研究發現，其能夠通過活化細胞內E3連接酶MARCH7來泛素化降解NLRP3而起到抑炎作用[23]。此外，巨噬細胞中存在一類Cullin環E3連接酶抑制子GLMN，對NLRP3和NLRC4兩類炎癥小體的活化具有抑制功能；然而，這個特性也被腸上皮細胞寄生菌志賀氏桿菌(Shigella)所利用，其分泌的具有E3連接酶功能的IpaH7.8效應蛋白能夠通過泛素化介導GLMN的降解，進而解除后者對炎癥因子的活化抑制[24]。

2.3 泛素系統對自噬信號通路的調控 自噬發生時，胞質內產生一種稱為自噬體(Autophagosome)的雙層膜泡結構，能夠在自噬相關信號調控下逐漸與溶酶體相融合并降解所包裹的內容物。自噬調控核心由一類自噬相關蛋白(Atg)所組成。哺乳動物細胞中，自噬體的形成主要受到了ULK(酵母Atg1同源)蛋白激酶復合體及VPS34脂激酶復合體的調控。ULK復合體由ULK1/2、FIP200(酵母Atg17同源)、ATG13及ATG101等組成，并受到對細胞營養條件敏感的mTORC1激酶復合體的直接調控[25]。此外，胞質中mTOR激酶的另一種復合體形式mTORC2能夠磷酸化Akt激酶，通過活化PI3K-Akt-mTOR信號級聯促進mTORC1對自噬的抑制活性，并且該通路中Akt與mTOR的激酶活性還受到了TRAF6介導的K63泛素化的正向調節[26]。脂激酶VPS34通過與p150及Beclin-1形成激酶復合物磷酸化磷脂酰肌醇形成PI3P，PI3P在胞內的膜結構與胞質交界處聚集，為募集自噬體發生相關蛋白提供錨定點，同時能夠介導多種效應分子有秩序地調控自噬體的轉運和成熟[27]。Beclin-1作為一個重要的轉接分子能夠結合多種調控蛋白來增強(如UVRAG、ATG14L、Bif-1及AMBRA1等)或抑制(如Bcl-2、TAB2/3及Rubicon等)VPS34的激酶活性，從而起到調節自噬的功能[28]。ULK及VPS34復合體中的多個組分都受到了泛素調控。例如，自噬發生時胞質中的AMBRA1能夠募集TRAF6并與ULK1或Beclin-1結合使其K63泛素化，一方面能夠穩定及活化ULK復合體，另一方面通過引起Beclin-1寡聚化并阻礙其與Bcl-2結合而起到對VPS34的正調控；相反地，mTORC1則能夠通過磷酸化AMBRA1來阻礙其招募TRAF6而起到自噬抑制作用[29]。此外，Beclin-1還受到E3連接酶RNF216的K48泛素化修飾，從而減弱其與VPS34復合物的結合；相反地，去泛素化酶USP19則能夠特異性降解Beclin-1的K11泛素鏈從而維持其穩定性[29]。

近年來，異體自噬(Xenophagy)和線粒體自噬(Mitophagy)這兩類選擇性自噬機制受到了格外關注。線粒體自噬過程中，PINK1激酶能夠在去極化的線粒體外膜聚集，通過磷酸化被泛素化修飾的線粒體蛋白上的泛素分子來招募選擇性自噬受體，如OPTN、NDP52等[30]。這些受體由泛素結合域UBA與泛素化蛋白結合，同時通過LIR(LC3 interacting region)模序結合LC3，從而和底物蛋白一起經自噬體轉運至溶酶體中發生降解。同時，PINK1也能在線粒體外膜上募集E3連接酶Parkin，后者泛素化多類線粒體蛋白底物(如VDAC、Miro及mitofusin-2等)并介導降解[30]。有趣的是，Parkin也能夠介導胞內病原菌的異體自噬。例如，Mtb能通過ESX-1系統在吞噬體上造成孔洞從而釋放細菌DNA激活cGAS-STING依賴的胞質DNA感應信號通路，進而誘發Parkin聚集到Mtb吞噬體上并對其標記上K63泛素化修飾引起自噬降解[31]。然而，Parkin針對病原菌或吞噬體膜上的泛素化底物，以及其在菌表面募集和活化的機制目前尚不清楚。除了OPTN及NDP52外，還發現有SQSTM1(p62)和NBR1等多種選擇性自噬受體，這些受體在介導選擇性自噬時可能并非功能冗余。例如，p62更傾向于介導K63而非K48泛素化標記的底物降解，OPTN則傾向于結合線性泛素鏈；p62能夠與NBR1形成異二聚體協作完成對泛素化底物的自噬介導，同時NBR1也能自身形成低聚化介導過氧化物酶體自噬(Pexophagy)；然而p62在介導一些胞內菌如志賀菌、李斯特菌(Listeria)及沙門氏菌(Salmonella)的自噬清除時僅需要NDP52而非NBR1的協助[32]。

2.4 泛素系統對吞噬體成熟信號通路的調控 宿主的巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞等專職吞噬細胞對病原菌具有很強的吞噬清除作用。吞噬發生時，首先由Fcγ受體(FcγR)、補體受體3(CR3)等膜表面受體接受病原菌攜帶的吞噬信號而引起胞內側的免疫受體模序ITAM的活化，并進一步誘發一系列吞噬相關激酶(如Syk、Cdc42、Rac1/2及PI3K等)的信號級聯反應，從而介導肌動蛋白重組和質膜內化形成吞噬體(Phagosome)[33]。隨后，吞噬體經歷早期和晚期階段逐漸酸化和成熟，最終與溶酶體融合形成吞噬溶酶體(Phagolysosome)介導菌的降解。

目前發現，哺乳動物細胞存在超過60個成員的Rab家族GTPase，它們是指導吞噬體成熟過程的核心機制。例如，Rab5對介導質膜處發生的初期吞噬體與早期內體(Endosome)的融合具有推進作用。一方面，鳥苷酸交換因子(GEF)Rabex-5在早期吞噬體膜上的募集能夠促進Rab5的活化；另一方面活化的Rab5則可通過招募效應分子Rabaptin-5進一步促進Rabex-5的活性，從而形成一個正反饋循環[34]。在這個循環中，泛素調控起到了關鍵作用。Rabex-5是一類具有E3連接酶活性的泛素結合蛋白，能夠通過ZnF及一個反泛素結合模序(IUIM)從胞質中結合到泛素化的吞噬體膜蛋白上行使對Rab5的激活功能；當內體融合完成后， Rabex-5將被單泛素化修飾并轉位回到胞質中[34]。此外，內體相關的一類DUBs，如AMSH和UBPY則可通過去泛素化Rabex-5來恢復該循環[35]。伴隨早期吞噬體發展為晚期吞噬體的一個重要標識是Rab5向Rab7的轉變。Rab7通過募集諸多效應分子來協助吞噬體的進一步成熟，并介導晚期吞噬體與溶酶體的融合。研究發現，Rab7是E3連接酶Parkin的一個底物，被泛素化修飾后的Rab7能夠增強其在膜上的穩定性及招募效應分子的能力，從而促進吞噬體成熟[36]。

在胞質中，有一類具有封閉膜結構并包裹大量腔內小泡的多泡小體(MVB)也受到了吞噬體的識別和降解，并影響吞噬體的發展和病原菌的清除能力。例如，由ESCRT-0/Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ組成的轉運相關內體分選復合物(ESCRT)是指導MVB形成的主要分子機制，而Mtb的Esx-3效應蛋白EsxH和EsxG能夠形成復合物靶向破壞ESCRT的功能，從而抑制吞噬體的成熟[37]。實驗表明，泛素系統在調控ESCRT復合物介導的MVB生物合成過程具有重要作用。ESCRT-0/Ⅰ/Ⅱ復合物能夠通過募集多種含不同類型UBD的泛素結合蛋白，如STAM1/2(UIM)、Hrs(UIM)、Tsg101(Uev)及EAP45(GLUE)等捕獲和聚集泛素化貨物于分隔小泡中，隨后ESCRT-Ⅲ啟動膜泡出芽和分裂，促使包被貨物小泡的MVB形成[38]。

2.5 泛素系統對細胞死亡信號通路的調控 如前所述，泛素系統能夠通過炎癥及自噬信號通路來影響細胞焦亡和自噬性細胞死亡；而凋亡和壞死(Necrosis)作為天然免疫信號通路中一類重要機制同樣受到了泛素系統的精密調控。細胞凋亡根據誘發的起始因素的不同可分為外源性凋亡途徑(Extrinsic pathway)和內源性凋亡途徑(Intrinsic pathway)。外源途徑誘導凋亡時，最先通過細胞表面一類接受凋亡信號(如TNF-α、FasL及TRAIL等)的死亡受體(DR)，如TNFR1、DR3、DR4、DR5及Fas等介導激活。例如，TNF-α與TNFR1形成復合體激活后可以通過受體結合激酶RIPK1依賴或非依賴的兩種途徑傳遞凋亡信號，且都受到了泛素系統的調控。其中，RIPK1依賴的凋亡信號通路被認為可能發生在線粒體介導的內源性凋亡途徑的下游。因為當接受凋亡信號后，線粒體外膜通透性改變而促使一類凋亡相關蛋白Smac被釋放到胞質中，隨后與凋亡抑制蛋白cIAP結合并使后者發生自降解而喪失對多種caspase的抑制作用；同時去泛素化酶CYLD、USP7或USP2a通過介導RIPK1的去泛素化使其脫離TNFR1受體復合物，轉而在胞質中招募含有死亡結構域(DD)的接頭蛋白FADD及caspase-8，最終形成另一種死亡誘導信號復合物(DISC)并介導凋亡[39,40]。相應的研究表明，通過線性泛素鏈被招募到TNFR1復合物中的另一種去泛素化酶A20則能夠通過自身的ZnF與泛素分子相互作用來起到穩定泛素鏈的作用[41]。RIPK1非依賴的凋亡信號通路則是由胞質中一類通過競爭性結合FADD而抑制caspase-8活性的蛋白c-FLIP所決定，且受到了泛素系統的調控。c-FLIP包括c-FLIPL、c-FLIPS及c-FLIPR三種亞型，例如在Mtb引起的活性氧(ROS)依賴的巨噬細胞凋亡途徑中，涉及到ASK1、p38及c-Abl三類激酶的激活并引發c-FLIPS的酪氨酸/絲氨酸磷酸化，促進后者與E3連接酶c-Cbl的結合及泛素化降解，從而解除對caspase-8的抑制作用[42]。

在感染初期，Mtb能夠通過抑制細胞凋亡來促進自身的胞內存活，而感染晚期的Mtb卻通過誘導細胞自噬來逃離衰竭的細胞并擴散感染[43]。與凋亡所不同的是，細胞發生壞死時將出現質膜破裂和內容物的外溢，同時引起炎癥免疫反應。近年來，人們發現非caspase或細胞色素C介導的死亡實際上也受到了復雜的信號網絡調控，并把這類細胞死亡方式歸入程序性細胞壞死(Necroptosis)的范疇。程序性壞死的調控核心是RIPK3及MLKL激酶。在TNFR1介導的凋亡信號通路中，若caspase-8活性降低或胞質中RIPK3和MLKL蛋白水平較高時，RIPK3將通過RHIM結構域與RIPK1結合并自磷酸化，活化后的RIPK3通過招募特異性底物MLKL作為壞死執行者激活壞死信號通路[44]。如前所述，泛素系統能夠通過對RIPK1的修飾起到對胞質中caspase-8活化水平的調節，從而決定細胞凋亡或程序性壞死的發展方向。近年來還發現胞內調控p53和p21泛素化降解而起到凋亡調控作用的E3連接酶MKRN1也能通過泛素化FADD來抑制caspase-8的活性，同時影響壞死小體(Necrosome)的形成[45]。另一方面，RIPK3和MLKL本身也存在泛素化修飾的現象，例如鼠源RIPK3在K5位置能夠被A20泛素化從而促進其與RIPK1形成復合物，然而MLKL的泛素化修飾機制目前尚不清楚[46]。

3 結核分枝桿菌利用泛素系統逃避免疫清除的機制

效應蛋白是Mtb在宿主體內長期存活并逃逸免疫清除的最大助力(圖1)。目前所發現的Mtb效應蛋白的功能至少有6個方面：①促進Mtb的侵染入胞，如Erp、FbpA、Mce3家族等細胞壁蛋白能夠被分泌到環境中幫助Mtb黏附和感染宿主[11,47]；②具有抗氧化/氮化應激作用，如SodA、KatG、AhpC及TpX等酶類能夠抵抗胞內的活性氧/氮介質(ROI/RNI)對Mtb的脅迫[11,48]；③參與細胞凋亡的調控，近年來鑒定出MPT64、Rv3354及PtpA等多種效應蛋白具有凋亡抑制功能，例如MPT64能夠增強宿主巨噬細胞Bcl-2蛋白家族的表達水平，而PtpA則能夠去磷酸化增強GSK3α的抗凋亡活性[49]；④抑制吞噬體的成熟，如Mtb分泌的一類核苷二磷酸激酶Ndk能夠抑制Rab5和Rab7與各自的效應分子EEA1或RILP的結合[50]；又如PtpA及Mtb分泌的另一種磷酸酶SapM，前者能夠去磷酸化宿主的膜泡轉運蛋白VPS33B，同時結合溶酶體膜上的V-ATPase的H亞基來阻止吞噬體與吞噬體膜相融合[51]；后者則能去磷酸化吞噬體膜上的PI3P阻礙吞噬體發展[52]；⑤抑制炎癥信號通路的活化，例如，PknE能夠抑制人THP-1巨噬細胞的TNF-α和IL-6炎癥因子的分泌水平[11,53]；而Mtb分泌的金屬蛋白酶Zmp1則能夠抑制caspase-1的活性，進而抑制pro-IL-1β的切割活化，并阻礙炎癥小體的形成[54]。最近發現Mtb膜效應蛋白Mce3E在感染過程中會進入巨噬細胞內靶向結合MAPK信號通路的關鍵激酶Erk1/2，并滯留活化的Erk1/2在內質網中而阻礙其入核調控基因轉錄，同時抑制TNF-α和IL-6的表達水平[55]；⑥抑制細胞自噬，例如Mtb效應蛋白EIS能夠增強組蛋白H3的乙酰化水平來上調巨噬細胞的IL-10的基因表達水平，通過活化Akt/mTOR/p70S6K信號通路來抑制細胞自噬[56]。最近還鑒定出分枝桿菌效應蛋白PE_PGRS47也具有自噬抑制功能，該蛋白缺失的Mtb感染巨噬細胞將顯著增多胞質中LC3的聚集，且p62自噬受體的降解明顯增強[57]。

利用泛素系統逃避宿主的免疫清除是近年來發現的一種Mtb的重要免疫逃逸機制，該機制有賴于Mtb效應蛋白PtpA等的調控功能。研究發現：PtpA存在一個全新的類泛素結合模序UIML，能夠通過非共價結合到單泛素分子的疏水氨基酸簇上來增強自身磷酸酶活性，并靶向宿主MAPK信號通路中兩類關鍵激酶JNK和p38，或吞噬體成熟相關蛋白VPS33B起到去磷酸化抑制的作用；同時還可通過競爭性結合TAB3的NZF鋅指結構抑制后者與K63泛素化的結合進而阻斷NF-κB信號通路，并降低TNF-α及IL-1β的表達水平[58]。近年來，還鑒定出Mtb的一類蛋白激酶Rv3354具有保護Mtb分泌蛋白不被宿主泛素化降解的功能。Rv3354能夠靶向結合宿主的一類蛋白質降解調控復合物——COP9信號小體(CSN)的JAMM結構域并抑制其對泛素樣蛋白Nedd8的切割活性，而Nedd8的切割是CNS調控宿主CRL家族E3連接酶復合物活化的關鍵[59]。此外，在Mtb感染過程中，諸多泛素相關基因出現了明顯的上調(如mkrn1、cops5等)或下調(zfp91、ndfip2、ube2f、rnft1、psmb6和psmd13等)現象，這暗示泛素系統在Mtb-宿主相互作用過程中具有極為重要的調控功能[60]。

圖1 結核分枝桿菌效應蛋白的免疫抑制功能Fig.1 Immunosuppressive functions of M.tuberculosis effector proteinsNote: Mtb effector proteins play a pivotal role in orchestrating host innate immune signaling pathway.Erp,FbpA and Mce3 are essential for maintaining Mtb virulence during the infection[11,47].The antioxidant enzymes SodA,KatG,AhpC and TpX confer Mtb resistance to host oxidative/nitrosative stresses[11,48].SapM,Ndk and PtpA arrest phagosome by targeting PI3P,Rab5/7 and V-ATPase,respectively[50-52].The Rab7 recruitment is also undermined by ESAT-6 and PhoP[64].PE_PGRS47 reduces LC3 puncta and p62 degradation,whereas EsxH and EsxG impair MVB formation to inhibit autophagy[57].PtpA competitively interacts with TAB3 to prevent the binding of K63 Ub chains and directly dephosphorylates phos-p38 and phos-JNK to inhibit both NF-κB and MAPK pathway[58].MPT64,Rv3354 and PtpA have different apoptotic regulatory functions when delivered into cytoplasm[49].ZMP1 acts as a Zn2+ metalloprotease with the ability to restrain the host inflammasome development and suppress the activity of caspase-1[54].

有趣的是，宿主并不甘于被動地接受Mtb對泛素系統的挾持。最近的一項研究發現，宿主的一類E3連接酶Trim27能夠通過RING結構域結合PtpA，對PtpA等Mtb效應蛋白引起的巨噬細胞天然免疫抑制功能產生對抗作用，進而限制分枝桿菌的胞內存活，這類具有抵御病原菌作用的宿主蛋白被稱為限制因子(Restriction factors)[61]。事實上，宿主泛素系統威脅Mtb胞內存活的另一張王牌是依賴泛素系統的選擇性自噬機制。除了Parkin介導的Mtb泛素化，最近還發現宿主范醌蛋白1(UBQLN1)也能夠通過Mtb的ESAT-6效應蛋白EsxA與菌表面發生相互作用，進而促進泛素、p62及LC3在Mtb表面聚集并介導Parkin非依賴性的自噬降解[62]。此外，宿主對Mtb的選擇性自噬也可能通過TLR2活化的DNA損傷相關自噬調節子DRAM1介導而聚集LC3，該過程無需泛素及p62等受體的參與[32,63]。然而，巨噬細胞胞質中的Mtb強毒株H37Rv和弱毒株H37Ra雖然都能被自噬體捕獲，但前者明顯能夠抑制自噬體的進一步成熟及與溶酶體融合。研究發現，Mtb強毒株能夠通過阻止自噬體招募Rab7來抑制其與內體形成中間囊泡(Amphisome)的成熟過程，而這種能力有賴于ESAT-6分泌系統及其調節因子PhoP的協助[64]。此外，Mtb通過調控宿主miRNA影響自噬相關基因的表達是新近發現的一種免疫逃逸機制。Mtb感染過程中將誘導增強巨噬細胞miR-33及其過客鏈(passenger strand)miR-33*的表達水平，而miR-33和miR-33*的上調表達將負向調控一系列自噬相關蛋白(如ATG5、ATG12、LC3B及LAMP1等)編碼基因的表達水平，改變宿主的自噬調控程序[65]。

4 展望

綜上所述，越來越多的研究表明：泛素系統的免疫調控功能對宿主抵御病原菌感染具有重要作用，但這一特點也能被病原菌所利用。目前已在沙門氏菌、李斯特菌、志賀菌、嗜肺軍團菌、耶爾森氏菌(Yersinia)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)及腸致病性大腸桿菌(EPEC)等多種病原菌中鑒定出一系列具有真核細胞E3連接酶或DUBs活性的效應蛋白，這些病原菌可通過模擬宿主泛素系統的功能進而擾亂宿主防御機制并達到免疫逃逸的目的[66]。然而，有關這些病原菌效應蛋白在病原-宿主互作過程中的調控機制方面的研究僅是冰山一角，很多未知的問題有待進一步探尋。例如，這些效應蛋白在原核生物中是否普遍存在或具有同源性蛋白？在感染過程中它們究竟受到何種時間或空間依賴性的精細調控？其作用是否具有宿主和細胞特異性？宿主又有哪些限制因子用來規避或降解這些病原菌效應蛋白？針對以上一系列問題，建立合適的病原-宿主感染模型，并應用多學科交叉的手段從病原菌感染免疫、蛋白分子生化修飾、細胞信號通路級聯調控等角度深入研究病原菌效應蛋白的調控功能和機制，將有望為感染性疾病的防控提供新策略以及為抗感染藥物研發提供新靶點。

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[收稿2016-11-18]

(編輯 倪 鵬)

Regulatory mechanisms of ubiquitin system in Mycobacterium tuberculosis-host interactions

CHAIQi-Yao,LIUCui-Hua.

CASKeyLaboratoryofPathogenicMicrobiologyandImmunology,InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is an extremely successful intracellular bacterial pathogen that engages multiple strategies to escape host immune surveillance,so as to survive within host macrophages for long period.Upon the invasion of pathogenic bacteria,the host ubiquitin system plays a critical role in activating the host innate immune responses and associated signaling pathways such as inflammatory and immune responses,autophagy,phagosome maturation and cell death,etc.On the other hand,recent studies have demonstrated that intracellular pathogenic bacteria such as Mtb can secrete a variety of effector proteins into host cells to hijack or co-opt the ubiquitin system to suppress host immune responses.Those pathogen-host interacting interfaces could provide potential novel targets for the development of anti-tuberculosis drugs.

Ubiquitin system;Mycobacterium tuberculosis;Macrophage;Innate immunity;Signaling pathway;Effector proteins

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.001

R392

A

1000-484X(2017)02-0161-09

①本文受國家自然科學基金(No. 81371769, 81571954)、國家973基礎科學項目(2014CB744400)和中國科學院“青年創新促進會優秀會員”項目(Y12A027BB2)資助。