混合皮膚移植中自體角朊細(xì)胞表達(dá)B7-H1誘導(dǎo)免疫抑制的相關(guān)研究①

蔡偉棟 柏 瑩 祝先進(jìn) 鄭培烝 曹穎平 周光炎

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,福州350001)

混合皮膚移植中自體角朊細(xì)胞表達(dá)B7-H1誘導(dǎo)免疫抑制的相關(guān)研究①

蔡偉棟 柏 瑩 祝先進(jìn) 鄭培烝 曹穎平 周光炎②

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科,福州350001)

目的：探討自體角朊細(xì)胞表達(dá)的B7-H1分子在混合皮膚移植中的作用和相關(guān)機(jī)制。方法：體外模擬混合皮膚移植模擬系統(tǒng)(MELC體系)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)角朊細(xì)胞B7-H1和淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)淋巴細(xì)胞IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在有自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系中，隨著作用時(shí)間增加，角朊細(xì)胞上B7-H1的表達(dá)和淋巴細(xì)胞上PD-1的表達(dá)水平均明顯升高，且具有時(shí)間依賴性(P<0.01)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著作用時(shí)間增加，與無(wú)自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系相比，在自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系中，淋巴細(xì)胞IL-10、GATA-3、Foxp3 mRNA的表達(dá)水平均明顯升高，且具有時(shí)間依賴性(P<0.01)。結(jié)論：在體外混合皮膚移植模擬系統(tǒng)中，自體角朊細(xì)胞通過表達(dá)共刺激分子B7-H1，上調(diào)淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，二者相結(jié)合，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞和Foxp3+的Treg細(xì)胞分化，從而負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

角朊細(xì)胞； B7-H1；混合皮膚移植；免疫抑制

在上世紀(jì)七十年代初，我國(guó)外科醫(yī)生創(chuàng)新性地運(yùn)用自體皮與異體皮鑲嵌的混合皮膚移植技術(shù)，抑制了免疫排斥反應(yīng)，大幅度提高了燒傷治愈率[1,2]，但其免疫機(jī)制目前尚未明確。大量研究證實(shí)，構(gòu)成皮膚主要細(xì)胞的角朊細(xì)胞在皮膚移植排斥反應(yīng)中扮演重要的角色[1]。角朊細(xì)胞屬于兼職抗原提呈細(xì)胞(APC)，與通常意義上的APC不同，其并不表達(dá)B7-1/B7-2，而是表達(dá)B7-H1。B7-H1是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)B7分子，其受體不是CD28和CTLA-4而是PD-1，B7-H1與PD-1結(jié)合具有下調(diào)免疫應(yīng)答的活性[3,4]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，自體角朊細(xì)胞的免疫抑制作用確實(shí)與B7-H1 及其受體PD-1 有關(guān)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們首先建立體外模擬混合皮膚移植模擬系統(tǒng)(MELC體系)，然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在有無(wú)自體角朊細(xì)胞的MELC體系中角朊細(xì)胞B7-H1和淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)有無(wú)自體角朊細(xì)胞的MELC體系中淋巴細(xì)胞IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的表達(dá)，從而探討B(tài)7-H1分子在自體角朊細(xì)胞誘導(dǎo)的混合皮膚移植免疫抑制中的作用和相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 取新生KM乳鼠按照文獻(xiàn)[5]的方法分離皮塊中的角朊細(xì)胞和表皮細(xì)胞；分離脾臟中的淋巴細(xì)胞。

1.1.2 試劑與儀器 小鼠B7-H1、PD-1流式檢測(cè)抗體(Biolegend公司)，離心柱型總RNA提取試劑盒(Qiangen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promaga公司)，實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒(TaKaRa公司),FACScan 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，Lightcycle480熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 將角朊細(xì)胞接種于完全K-SFM培養(yǎng)基中，置37℃ 5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。表皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃ 5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，以備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)整角朊細(xì)胞的細(xì)胞濃度至1×106ml-1，表皮細(xì)胞至2×106ml-1，淋巴細(xì)胞至1×106ml-1，按如下比例進(jìn)行混合培養(yǎng)(表1所示)，建立實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面PD-1和角朊細(xì)胞表面B7-H1的表達(dá) 收集各組待測(cè)細(xì)胞,用PBS洗滌2次，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，用PBS 控制細(xì)胞懸液總體積為100 μl。向待測(cè)組中加入20 μl PE Anti-mouse PD-1或PE Anti-mouseCD274(B7-H1)，加入同體積同型對(duì)照抗體作為陰性對(duì)照管，混勻后置于4℃孵育30 min，用PBS洗2遍，再加入500 μl PBS 重懸細(xì)胞。上流式細(xì)胞儀分別對(duì)懸浮細(xì)胞的PD-1和貼壁細(xì)胞的B7-H1進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的

表達(dá) 收集混合培養(yǎng)后12、24、36 h不同時(shí)間段的懸浮淋巴細(xì)胞，用離心柱法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用于定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)，并以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。各基因引物序列由Primer express 2.0軟件設(shè)計(jì)，委托TaKaRa公司合成(引物序列詳見表2)。定量PCR體系總體積為20 μl，包括SYBE GREEN熒光Mix 10 μl,cDNA 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，ddH2O 7 μl。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在Lightcycle480熒光定量PCR儀上擴(kuò)增：95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，68℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-10、Foxp3、GATA-3的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 在MELC體系中，有自體角朊細(xì)胞參與的實(shí)驗(yàn)組MELC中，角朊細(xì)胞B7-H1表達(dá)增高 在MELC體系中混合培養(yǎng)12、24、36 h后，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)角朊細(xì)胞B7-H1表達(dá)，結(jié)果如表3、圖1所示：在有自體角朊細(xì)胞參與的實(shí)驗(yàn)組中，角朊細(xì)胞B7-H1的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，且具有時(shí)間依賴性(F=220，P<0.01)；而在無(wú)自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系中(對(duì)照組1和對(duì)照組2)角朊細(xì)胞B7-H1的表達(dá)無(wú)增高趨勢(shì)(F值分別為1.25和3.55，P>0.05)。

2.2 在MELC體系中，有自體角朊細(xì)胞參與的實(shí)驗(yàn)組MELC中，淋巴細(xì)胞PD-1表達(dá)增高 在MELC體系中混合培養(yǎng)12、24、36 h后，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)，結(jié)果如表4、圖2所示：在有自體角朊細(xì)胞參與的實(shí)驗(yàn)組MELC 體系中，淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)呈遞增趨勢(shì)，且具有時(shí)間依賴性(F=464，P<0.01)；而無(wú)自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系中(對(duì)照組1、對(duì)照組2和對(duì)照組3)淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)無(wú)明顯增高(F值分別為0.898、2.540、0.695,P>0.05)。

表1 混合皮膚移植細(xì)胞模型

Tab.1 Intermingled skin grafting model(MELC)

ItemExperiencegroupControlgroup123ComponentLa∶Eb∶KaLa∶Eb∶KbLa∶KaLaProportion1∶1∶051∶1∶051∶051

Note：La.auto-lymphocytes;Ka.auto-keratinocytes;Kb.allo-keratino-cytes;Eb.allo-epidermal cell.

表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

Tab.2 Real-time quantitative PCR primer sequence

NameForwardprimerReverseprimerβ?actin5′?CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC?3′5′?ATGGAGCCACCGATCCACA?3′IL?105′?ACCTGCTCCACTGCCTTGCT?3′5′?GGTTGCCAAGCCTTATCGGA?3′Foxp35′?ACAACCTGAGCCTGCACAAGT?3′5′?GCCCACCTTTTCTTGGTTTTG?3′GATA?35′?ACCGGGTTCGGATGTAAGTC?3′5′?GTTCACACACTCCCTGCCTTCT?3′

2.3 在MELC體系中，有自體角朊細(xì)胞參與的實(shí)驗(yàn)組MELC中，淋巴細(xì)胞IL-10及GATA-3mRNA表達(dá)增高 如表5所示，在MELC 體系中混合培養(yǎng)12、24、36 h后，有自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系與無(wú)自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系相比，IL-10及GATA-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均明顯升高，且具有時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 在MELC體系中，有自體角朊細(xì)胞參與MELC體系中淋巴細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)增高 如表6所示，混合培養(yǎng)12、24、36 h后，有自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系與無(wú)自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系相比，F(xiàn)oxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，且具有時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 MELC體系中B7-H1的表達(dá)水平

Tab.3 Expressions of B7-H1 in MELC

TimeExperiencegroup(La+Eb+Ka)Controlgroup1(La+Eb+Kb)Controlgroup2(La+Ka)12h(2500±153)%(309±123)%(210±075)%24h(3950±182)%(439±161)%(473±166)%36h(5600±217)%(494±155)%(463±152)%F/Pvalue220/0001)

Note：1)Compare among 12，24，36 h experience group,F=220,P<0.01.

圖1 MELC體系中B7-H1表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of proportion of B7-H1 in MELC

圖2 MELC體系中PD-1表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of proportion of PD-1 in MELC

表4 MELC體系中PD-1的表達(dá)水平

Tab.4 Expressions of PD-1 in MELC

TimeExperiencegroupLa+Eb+KaControlgroup1La+Eb+KbControlgroup2La+KaControlgroup3La12h(515±106)%(225±104)%(328±093)%(389±127)%24h(2700±203)%(343±126)%(474±085)%(424±133)%36h(4770±188)%(248±112)%(317±102)%(314±084)%F/Pvalue464/0001)

Note：1) Compare among 12，24，36 h experience group,F=220,P<0.01.

TimeIL?10ABCGATA?3ABC12h087±007090±003085±035627±017655±003733±00224h1250±1441620±0042490±046718±013991±009794±00436h6020±0047560±0416050±0071050±0021060±003870±008F/Pvalue4269/0001)82160/0001)23932/0001)9657/0001)4239/0001)5048/0001)

Note：A.Expreience group compared with control group1;B.Experience group comared with control group 2;C.Experience groupcompared with control group 3.1)Compared among 12,24,36 h group,P<0.01.Experience group.La+Eb+Ka;Control group 1.La+Eb+Kb;Control group 2.La+Ka;Control group 3.La.

TimeABC12h1390±0062280±0773260±07724h1840±0513530±0208820±02336h11000±0319610±1908990±010F/Pvalue74099/0001)3264/0001)14618/0001)

Note：A.Experience group compared with control group 1;B.Experience group compared with control group 2;C.Experience group compared with control group 3.1)Compared among 12,24,36 h group,P<0.01.Experience group.La+Eb+Ka;Control group 1.La+Eb+Kb;Control group 2.La+Ka;Control group 3.La.

3 討論

我國(guó)外科醫(yī)生創(chuàng)造的混合皮膚移植(即在給受者移植入異體皮的同時(shí)嵌入受者的自體皮片)可以大大降低移植排斥反應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在MELC體系中，自體角朊細(xì)胞可以誘導(dǎo)性表達(dá)B7-H1，且自體角朊細(xì)胞對(duì)混合皮膚移植排斥反應(yīng)的抑制功能可以被抗B7-H1單抗完全遏止[5]。這一結(jié)果提示，B7-H1分子參與了自體角朊細(xì)胞對(duì)混合皮膚移植排斥反應(yīng)的抑制過程。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有自體角朊細(xì)胞參與的混合培養(yǎng)體系中，自體角朊細(xì)胞B7-H1呈高表達(dá)趨勢(shì)，而未有自體角朊細(xì)胞參與的各對(duì)照組，角朊細(xì)胞B7-H1極低表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示混合皮膚移植的免疫抑制作用與自體角朊細(xì)胞表達(dá)B7-H1分子有關(guān)。至于引起自體角朊細(xì)胞B7-H1表達(dá)升高的原因，目前尚不清楚。Ritprajak等[6]研究發(fā)現(xiàn)體外用IFN-γ刺激角朊細(xì)胞，其B7-H1表達(dá)上升，并抑制了浸潤(rùn)皮膚處T細(xì)胞的增殖反應(yīng)。而在我們前期的研究中也證實(shí)IFN-γ確實(shí)可以刺激細(xì)胞表達(dá)B7-H1[7,8]。因而自體角朊細(xì)胞B7-H1表達(dá)升高可能與炎癥因子的刺激有關(guān)：在生理狀態(tài)下，角朊細(xì)胞不表達(dá)B7-H1，當(dāng)皮膚組織受到外來(lái)刺激，局部分泌炎癥因子IFN-γ，誘導(dǎo)其角朊細(xì)胞B7-H1的表達(dá)，從而反饋調(diào)節(jié)局部組織炎癥反應(yīng)強(qiáng)度。

那么，B7-H1分子是如何參與自體角朊細(xì)胞抑制混合皮膚移植排斥反應(yīng)的？

現(xiàn)階段研究認(rèn)為B7-H1分子的受體并不與B7-1/B7-2相同，即不能通過與CTLA-4的相互作用而產(chǎn)生免疫抑制。PD-1是B7-H1的主要受體，有研究發(fā)現(xiàn)，PD-1與誘導(dǎo)移植耐受有關(guān)[9]。那么，混合皮膚移植是否也是通過PD-1分子的作用大大降低移植排斥反應(yīng)呢？因而在本實(shí)驗(yàn)中用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)，結(jié)果顯示在未有自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系中，淋巴細(xì)胞PD-1呈極低表達(dá)狀態(tài)，而在有自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系中，淋巴細(xì)胞PD-1的表達(dá)明顯增高，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)。有國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，B7-H1與PD-1的結(jié)合，可抑制T細(xì)胞的活化，維持外周免疫耐受[3]。故在混合皮膚移植體系中，某種作用因素增加淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，上調(diào)B7-H1與PD-1的結(jié)合率，從而介導(dǎo)免疫抑制，最終對(duì)混合皮膚移植排斥反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

另外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，自體角朊細(xì)胞可行使非專業(yè)性抗原遞呈細(xì)胞的功能，由B7-H1提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)IL-10分泌的Th2型細(xì)胞分化，進(jìn)而抑制Th1型細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞向Th2型細(xì)胞極化[10,11]。GATA-3為Th2型細(xì)胞的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子[12]。我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測(cè)GATA-3和IL-10mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在MELC體系中淋巴細(xì)胞GATA-3和IL-10mRNA均呈明顯的高表達(dá)趨勢(shì)，從另一角度驗(yàn)證了先前的觀點(diǎn)：角朊細(xì)胞可能通過表達(dá)B7-H1誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞向Th2型細(xì)胞極化，分泌Th2型細(xì)胞因子，最終對(duì)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抑制。

Treg細(xì)胞是一類具有負(fù)調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，其中Foxp3是其特異性調(diào)節(jié)因子[13,14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，角朊細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞，負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。那么，在MELC體系中角朊細(xì)胞是否能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg細(xì)胞，從而介導(dǎo)免疫抑制呢？本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)MELC體系中淋巴細(xì)胞Foxp3基因的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)在有自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系與無(wú)自體角朊細(xì)胞參與的MELC體系相比，F(xiàn)oxp3呈高表達(dá)趨勢(shì)。鑒于有報(bào)道認(rèn)為B7-H1能夠促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，并能維持Foxp3的表達(dá)及成熟Treg細(xì)胞的抑制功能[15,16]，故我們推測(cè)在MELC體系中淋巴細(xì)胞Foxp3基因表達(dá)增高的原因可能與自體角朊細(xì)胞表達(dá)B7-H1有關(guān)，這可能也是混合皮膚移植中自體角朊細(xì)胞誘導(dǎo)局部免疫耐受的機(jī)制之一。但這種Treg細(xì)胞與之前MELC體系中檢測(cè)出的可分泌IL-10的淋巴細(xì)胞是否為同一群細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)由于細(xì)胞分離技術(shù)的限制并未探討，尚需更深入的研究。

本研究通過建立體外混合皮膚移植模擬系統(tǒng)(MELC體系)，研究發(fā)現(xiàn)，自體角朊細(xì)胞通過表達(dá)共刺激分子B7-H1，上調(diào)淋巴細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)，二者相結(jié)合，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞和Foxp3+的Treg細(xì)胞分化，從而負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。這些研究闡明了混合皮膚移植中角朊細(xì)胞誘導(dǎo)局部耐受的機(jī)制，為燒傷移植的治療提供了新的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)指標(biāo)和思路。

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[收稿2016-04-06 修回2016-06-24]

(編輯 許四平)

Related research of immunosuppression in intermingled skin transplantation induced by B7-H1 expressed on auto-keratinocytes

CAIWei-Dong,BAIYing,ZHUXian-Jin,ZHENGPei-Zheng,CAOYing-Ping,ZHOUGuang-Yan.

DepartmentofClinicalLaboratory，F(xiàn)ujianMedicalUniversityUnionHospital，F(xiàn)uzhou350001,China

Objective:To explore the role and mechanism of the B7-H1 expressed by auto-keratinocytes in the intermingled skin grafting model in vitro(MELC).Methods: The intermingled skin grafting model(MELC) was established in vitro.Flow cytometry was performed to detect the expressions of B7-H1 in keratinocytes.The expressions of PD-1 in lymphocytes were measured at the same time.The levels of IL-10,Foxp3 and GATA-3 mRNA in lymphocytes were detected by Real-time quantitative PCR.Results: Through flow eytometry,in the MELC with auto-keratinocytes,the expression of B7-H1 in auto-keratinocytes and the PD-1 in lymphocytes were rising trend and the rising rate was in time-dependent manners(P<0.01).RT-PCR assay indicated that the relative levels of IL-10,Foxp3,GATA-3mRNA expression were significant raised and the rising rate was in time-dependent manners (P<0.01).Conclusion: In the intermingled skin grafting model,the auto-keratinocytes could express B7-H1 to enhance the expression of PD-1 in T cells.When B7-H1 combined with PD-1,the Th2 cells and Foxp3+Tregs were induced and suppressed the immune response in the intermingled skin grafting model.

Keratinocytes;B7-H1;Intermingled skin transplantation；Immunosuppression

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.003

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81171656)。

蔡偉棟(1990 年-)，男，在讀碩士，主要從事免疫調(diào)節(jié)和移植免疫的研究。

及指導(dǎo)教師：曹穎平(1970 年-)，男，博士，主任檢驗(yàn)師，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫調(diào)節(jié)和移植免疫的研究，E-mail:caoyingping@ailyun.com。

R392.4

A

1000-484X(2017)02-0174-05

②上海市免疫學(xué)研究所，上海200025。