黃芩素和U0126體外抗人乳腺癌的作用及機制研究①

安宏元 向川南 喻小蘭 唐小平 張宇驕 夏紀毅⑤

(四川省瀘州市人民醫院乳腺外科，瀘州646000)

·中醫中藥與免疫·

黃芩素和U0126體外抗人乳腺癌的作用及機制研究①

安宏元 向川南 喻小蘭②唐小平③張宇驕④夏紀毅③⑤

(四川省瀘州市人民醫院乳腺外科，瀘州646000)

目的：探討黃芩素和U0126體外對乳腺癌的作用及其機制。方法：用黃芩素、U0126單獨處理以及二者聯合處理人乳腺癌細胞株MCF-7細胞，采用CCK8檢測細胞增殖變化；流式細胞術檢測MCF-7細胞周期以及凋亡變化；顯微鏡觀察細胞數量變化； TUNEL法檢測細胞凋亡改變；劃痕實驗分析細胞遷移情況； Western blot實驗檢測細胞凋亡相關因子的蛋白水平變化，分析黃芩素與U0126對乳腺癌細胞的增殖、凋亡和遷移的影響。結果：黃芩素或U0126可抑制細胞的增殖且具有濃度依賴性(P<0.05)；黃芩素阻滯MCF-7細胞周期進入S期，增加G0～G1期細胞比例(P<0.05)，降低S期細胞比例(P<0.05)，誘導細胞凋亡(P<0.05)；降低ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化水平和CyclinD1的蛋白水平表達；黃芩素與U0126聯合處理MCF-7細胞，與黃芩素單獨處理組相比較，S期細胞比例明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡更加明顯(P<0.05)， ERK1/2和JNK的磷酸化水平(P<0.05)、CyclinD1的蛋白表達量降低更加明顯(P<0.05)；同時黃芩素可有效抑制人乳腺癌細胞株MCF-7細胞的遷移(P<0.05)。結論：黃芩素和U0126通過降低ERK1/2、JNK的磷酸化水平表達，降低CyclinD1的水平表達，有效抑制MCF-7細胞增殖和遷移，誘導MCF-7細胞凋亡并且二者具有協同作用。因此，黃芩素和U0126聯合有望用于臨床治療乳腺癌。

黃芩素；U0126；人乳腺癌細胞株MCF-7；凋亡；遷移

乳腺癌是當前社會的重大公共衛生問題，嚴重威脅著女性身心健康[1]。乳腺癌的增殖、凋亡和轉移受多種信號通路的調控，如CyclinD1、ERK1/2和JNK等[2]。ERK1/2和JNK是有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族的重要成員，二者可被多種蛋白激酶磷酸化并活化，然后進入細胞核，縮短G1期，促進細胞提前進入S期，介導細胞增殖失控、凋亡和惡性轉移[3]。

黃芩素是黃芩中具有活性的黃酮類化合物，具有抗菌消炎和抗感染的功效。目前，已有研究報道，黃芩素抑制部分癌癥細胞的轉移，如宮頸癌、肺癌和前列腺癌等[4-6]，具有良好的臨床應用前景，但其在乳腺癌中的作用效果還知之甚少[7]。U0126是ERK1/2的特異性抑制劑[8]，可抑制與癌癥細胞增殖和轉移相關的信號通路活性，與黃芩素等中藥聯合使用具有協同效應，有望在臨床上得到廣泛應用[9]。

乳腺癌細胞增殖失控和惡性轉移是其致死的重要原因之一，人乳腺癌細胞株MCF-7具有低侵襲、低轉移能力，為體外研究中西藥對乳腺癌轉移的影響提供了很好的細胞模型[10]。抑制乳腺癌細胞惡性增殖和轉移，促進癌細胞凋亡是治療乳腺癌的重要策略之一，因此本研究主要探討黃芩素和U0126對MCF-7增殖、凋亡和轉移的影響以及相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7購于上海肯強儀器有限公司；RPMI1640(美國Gibco公司)胎牛血清購于杭州四季青公司；青霉素和鏈霉素購于北京索萊寶公司；胰酶購于華美公司；黃芩素購于普瑞法科技有限公司；抑制劑U0126購于碧云天生物科技有限公司；TUNEL試劑盒購于ROCHE公司；小鼠抗人GAPDH內參、辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG及辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG 購于碧云天生物科技公司；CyclinD1、ERK1/2、JNK引物均由上海生工合成；兔抗人CyclinD1抗體、兔抗人ERK1/2抗體、兔抗人P-ERK1/2抗體、兔抗人JNK抗體及兔抗人P-JNK抗體均購于CST公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞株MCF-7由上海肯強科技有限公司提供，采用RPMI1640(含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素)培養液培養。培養條件：37℃，5%CO2的培養箱。

1.2.2 CCK8檢測細胞增殖 對數生長期細胞制備細胞懸液，將100 μl 含2×104ml-1的MCF-7細胞懸液接種至96孔板中，貼壁后，按照不同濃度加入0、1、2、5、10、20、50、100、200、300 μmol/L的黃芩素和按照使用說明書給出的適用范圍分別加入0、2、5、10、20 μmol/L的U0126，同時設置空白對照以及DMSO對照組， 37℃培養4 h；加入10 μl CCK8,混勻，培養4 h，生成Formazan，測定450nm吸光度(OD值)。設定空白對照1：在不含細胞的培養基中加入CCK8，測定450nm的吸光度(OD值)，空白對照2：在不含細胞加入黃芩素或U0126的培養基中加入CCK8，測定450nm的吸光度，實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞周期以及細胞凋亡情況 將1 ml 1.25×105ml-1的MCF-7細胞接種至12孔板，貼壁后，用黃芩素、U0126及黃芩素聯合U0126處理細胞24 h，收集細胞，室溫PBS洗滌兩次，加入1 ml 70%預冷乙醇固定，過夜，離心去除乙醇；PBS重懸，加入RNase至終濃度為100 mg/L， 37℃水浴30 min，加入PI染色液至終濃度為50 mg/L，4℃避光染色3 min，用488nm的激發波長檢測細胞周期分布。用細胞周期擬合軟件進行分析結果，記錄亞二倍體峰，即凋亡細胞峰sub-G1期、G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例。檢測早期凋亡和晚期凋亡按照相關的試劑盒步驟進行操作。結果采用CellQuest軟件進行分析。實驗重復3次。

1.2.4 細胞顯微攝影檢測細胞數量變化 分別加入0、1、2、5、10、20、50、100、200、300 μmol/L黃芩素處理MCF-7細胞24 h，低倍鏡下觀察黃芩素對MCF-7細胞的數量變化。

1.2.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 MCF-7細胞經10 μmol/L黃芩素及10 μmol/L U0126處理24 h后，移除培養液，PBS漂洗2遍，4%PFA室溫固定10 min，PBS漂洗2遍，3%過氧化氫浸泡10 min，抑制內源性過氧化氫酶，PBS漂洗2遍，蛋白酶室溫孵育30 min，PBS洗2遍，加入50 μl TUNEL反應液，室溫濕盒中孵育1 h，PBS洗3遍，加convert-POD，室溫30 min后，PBS再漂洗3遍，DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下攝片分析結果。

1.2.6 Western blot檢測增殖和凋亡相關蛋白水平 20 μmol/L黃芩素和10 μmol/L U0126處理MCF-7細胞后，用4℃預冷的PBS沖洗細胞2次，離心去上清，加入含5%蛋白酶抑制劑的裂解液(RIPA強)，置冰上裂解30 min，轉移蛋白液至已標記的Eppendorf管中，超聲破碎后，10 000 r/min離心后取上清液，沸水變性5 min后，降至室溫，-20℃保存備用。取5 μl蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，轉膜到0.2 μmol/L PVDF膜上，5%脫脂奶粉的1×TBST封閉1 h，去除封閉液,PBS漂洗2次，10 min/次。一抗(ERK1/2稀釋比例為1∶1 000，P-ERK1/2稀釋比例為1∶800，JNK稀釋比例為1∶1 000，P-JNK稀釋比例為1∶800,CyclinD1稀釋比例為1∶700，GAPDH稀釋比例為1∶2 000)4℃孵育過夜。1×TBST漂洗3次，10 min/次，HRP羊抗小鼠IgG及HRP羊抗兔IgG(二抗稀釋比例均為1∶2 000)室溫孵育1 h，1×TBST漂洗3次，10 min/次，BIO-RAD凝膠成像儀成像后，Quantity one軟件進行平均光密度值(Mean optical dengsity,MOD)分析，計算相關因子蛋白水平表達，實驗重復3次。

1.2.7 劃痕實驗檢測MCF-7細胞遷移 將0.5 ml 5×105個/ml的MCF-7細胞接種于24孔板，培養24 h后，形成單層細胞。用10 μl移液槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，用PBS洗3遍，然后加入所需的黃芩素或U0126，每組處理平行3個樣本。培養24 h后，顯微鏡下觀察黃芩素或U0126對MCF-7細胞遷移的影響。

2 結果

2.1 黃芩素或U0126抑制人乳腺癌細胞株MCF-7

細胞增殖 MCF-7細胞經不同濃度的黃芩素、U0126處理24 h后，CCK8實驗結果表明，黃芩素或U0126可顯著抑制MCF-7細胞增殖且具有濃度依賴性(P<0.05)，見圖1。

2.2 黃芩素或U0126阻滯人乳腺癌細胞株MCF-7細胞周期 與空白對照組和DMSO對照組相比，人乳腺癌細胞株MCF-7經20 μmol/L黃芩素處理24 h后，G0～G1期細胞比例明顯增多(P<0.05，圖2)，S期細胞比例明顯下降(P<0.05，圖2)，采用20 μmol/L黃芩素與10 μmol/L U0126聯合處理MCF-7細胞24 h后，S期細胞比例明顯降低(P<0.05，圖2)。此研究結果表明，黃芩素可顯著增加MCF-7細胞G1期細胞比例，降低S期細胞比例，U0126可顯著降低S期細胞比例。

圖1 黃芩素或U0126抑制人乳腺癌細胞株MCF-7細胞增殖Fig.1 Baicalein or U0126 inhibited human breast cancer cell line MCF-7Note: *.P<0.05 vs control.

圖2 黃芩素或U0126阻滯人乳腺癌細胞株MCF-7細胞周期Fig.2 Effect of Baicalein or U0126 on cell cycle of MCF-7Note: 1.Control；2.DMSO；3.Baicalein-20 μmol/L；4.20 μmol/L-baicalein+10 μmol/L-U0126；*.P<0.05 vs 1.

2.3 黃芩素或U0126誘導人乳腺癌細胞株MCF-7細胞凋亡 為進一步探討黃芩素和U0126聯合抗乳腺癌的作用，我們鏡下觀察黃芩素/U0126對乳腺癌細胞凋亡的影響。與空白對照組和DMSO組相比，不同濃度黃芩素處理MCF-7細胞24 h后， MCF-7細胞數量明顯減少，且隨著使用黃芩素濃度越高，乳腺癌細胞的數量減少越明顯(圖3)。

2.4 TUNEL法檢測黃芩素或U0126誘導人乳腺癌細胞株MCF-7細胞凋亡 與空白對照組和DMSO組相比，TUNEL實驗結果表明人乳腺癌細胞株MCF-7經20 μmol/L黃芩素單獨處理24 h后，細胞凋亡現象明顯(P<0.05)，MCF-7經20 μmol/L黃芩素和10 μmol/L U0126聯合處理后，細胞凋亡現象更明顯(P<0.05)(圖4)。

2.5 黃芩素或U0126對MCF-7早期凋亡和晚期凋亡的影響 為進一步確認黃芩素/U0126影響細胞凋亡的具體過程，我們利用流式細胞術檢測 MCF-7細胞經20 μmol/L黃芩素單獨處理24 h后，MCF-7細胞的早期凋亡和晚期凋亡情況，結果顯示黃芩素處理MCF-7細胞組與空白組或者DMSO組相比，早期凋亡和晚期凋亡均顯著增多(P<0.05)，MCF-7細胞經20 μmol/L黃芩素和10 μmol/L U0126聯合處理后，與兩者單獨處理組相比，早期凋亡和晚期凋亡均顯著增多(P<0.05)。此研究結果表明，黃芩素和U0126均可誘導人乳腺癌細胞株MCF-7早期凋亡和晚期凋亡，且二者具有協同效應(圖5)。

2.6 劃痕實驗檢測黃芩素對人乳腺癌細胞株MCF-7細胞遷移的影響 與空白對照組和DMSO組相比，人乳腺癌細胞株MCF-7經20 μmol/L黃芩素處理0、1、3和6 h后，劃痕實驗表明，細胞遷移距離受到明顯抑制(P<0.05)。此研究結果表明，黃芩素可顯著抑制人乳腺癌細胞株MCF-7遷移能力(圖6)。

圖3 黃芩素誘導人乳腺癌細胞株MCF-7細胞數量減少Fig.3 Effect of Baicalein on number of MCF-7 cells in human breast cancer cell lineNote: *.P<0.05 vs control.

圖4 黃芩素或U0126誘導人乳腺癌細胞株MCF-7細胞凋亡Fig.4 Baicalein or U0126 induced MCF-7 apoptosis in human breast cancer cell lineNote: 1.Control；2.DMSO；3.Baicalein-20 μmol/L-24 h；4.Baicalein-20 μmol/L+U0126-10 μmol/L；*.P<0.05 vs 1.

圖5 黃芩素或U0126對MCF-7早期凋亡和晚期凋亡的影響Fig.5 Effect of baicalein or U0126 on early apoptosis and late apoptosis of MCF-7Note: 1.Control；2.DMSO；3.Baicalein-20 μmol/L-24 h；4.Baicalein-20 μmol/L+U0126-10 μmol/L；*.P<0.05 vs 1.

圖6 黃芩素對人乳腺癌細胞株MCF-7細胞遷移的影響Fig.6 Effect of baicalein on migration of MCF-7 cells in human breast cancer cell lineNote: *.P<0.05 vs baicalein 0 μmol/L.

圖7 黃芩素或U0126降低MCF-7凋亡抑制蛋白活性及表達水平Fig.7 Effect of baicalein or U0126 on inhibition of MCF-7 apoptosis and expression level in human breast cancer cell lineNote: 1.Control;2.Control+DMSO;3.Baicalein-20 μmol/L;4.U0126-10 μmol/L;5.Baicalein-20 μmol/L+U0126-10 μmol/L;*.P<0.05 vs 1.

2.7 黃芩素/U0126體外抗乳腺癌的分子機制 為探討黃芩素與U0126抑制MCF-7細胞增殖的分子機制，我們利用Western blot檢測 ERK1/2、JNK蛋白的磷酸化情況，利用Real-time PCR和Western blot 檢測周期、增殖相關的蛋白CyclinD1表達水平，結果顯示，與對照組以及黃芩素/U0126單獨處理MCF-7細胞組相比，黃芩素與U0126聯合作用MCF-7細胞24 h可以明顯降低ERK1/2、JNK蛋白的磷酸化水平以及CyclinD1的mRNA和蛋白水平(圖7)。

3 討論

乳腺癌在乳腺疾病中是常見的惡性腫瘤，致死率較高。乳腺癌的惡性增殖、凋亡以及遷移是多基因參與的、復雜的病理學過程，因此探究乳腺癌的增殖、凋亡和遷移的分子機制，尋找乳腺癌的新療法具有重要意義。

黃芩素和U0126具有明顯的抗癌作用，前期研究表明黃芩素作為一種中藥，通過增加凋亡相關蛋白Bax表達，抑制CDC2激酶活性等多種途徑抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡[11]。U0126通過特異性抑制ERK信號通路活性誘導細胞凋亡[8]。我們的研究表明黃芩素/U0126可以抑制乳腺癌細胞MCF-7細胞株的增殖并誘導細胞凋亡且具有濃度依賴性，二者聯合使用組，相對于單獨使用組，誘導乳腺癌細胞凋亡的作用更加顯著。

已有研究報道，高轉移傾向乳腺癌細胞和組織中，ERK1/2的表達水平和磷酸化水平增高[12]。ERK1/2的磷酸化激活是細胞周期進入S期的關鍵，它促進細胞由G1期向S期轉化，從而促進細胞增殖[13]。CyclinD1是經典Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，可促進細胞進入S期，Halleskog等[14]報道ERK1/2可促進β-catenin進入細胞核，從而調控CyclinD1的表達，進而影響乳腺癌細胞生長和細胞周期改變。這與本研究實驗結果一致：黃芩素/U0126可以降低ERK1/2和JNK的磷酸化水平，進一步調控其信號通路下游分子CyclinD1，降低其表達水平。CyclinD1作為周期相關蛋白，表達量降低阻滯細胞進入S期，從而導致S期細胞所占比例降低同時G1期細胞增多。

促進癌細胞凋亡是治療癌癥的策略之一。Bcl-2家族蛋白由抑制細胞凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-x/L)和促進細胞凋亡蛋白(Bax、Bad等)組成，兩者相互作用調控細胞凋亡[15]。已有研究報道，ERK激酶活化后可調節線粒體途徑引起的凋亡[16]。本研究結果表明：不同濃度的黃芩素和U0126處理MCF-7細胞后，降低ERK1/2和JNK的磷酸化水平，促進癌細胞凋亡，包括早期凋亡和晚期凋亡。

癌癥惡性轉移是導致高致死率的重要原因，乳腺癌最常發生轉移的部位有骨轉移(肋骨、胸骨等)、肺及胸膜轉移、肝轉移和腦轉移[17]。目前，已經研制了多種癌癥抗轉移藥物，如血小板凝集抑制劑、血管生成抑制因子、內皮穩定因子、干擾素-α和其他化學藥物[18]，但由于藥物的局限性，尋找新型抗轉移的藥物是十分必要的。黃芩素聯合小分子抑制劑U0126可以顯著抑制乳腺癌細胞MCF-7的遷移作用，這為二者在臨床使用提供重要的理論依據。

綜上所述，黃芩素和U0126可通過調控ERK1/2和JNK信號通路，顯著抑制人乳腺癌細胞株MCF-7增殖、凋亡和轉移，因此二者有望用于乳腺癌臨床治療。

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[收稿2016-08-08]

(編輯 倪 鵬)

Anti-cancer by baicalein combined with U0126 on human breast cancer in vitro

ANHong-Yuan,XIANGChuan-Nan,YUXiao-Lan,TANGXiao-Ping,ZHANGYu-Jiao,XIAJi-Yi.

TheDepartmentofBreastSurgery,SichuanProvinceLuzhouPeople′sHospital，Luzhou646000，China

Objective:To investigate the effects and mechanisms of anti-cancer by bacailein combined with U0126 on human breast cancer in vitro.Methods: The human breast cancer cell line MCF-7 was treated by baicalein,U0126 and baicalein combined with U0126 respectively.CCK8 assay measured cell proliferation of MCF-7;flow cytometry tested the cell cycle and apoptosis of MCF-7;microscopy observed the amount;TUNEL assay evaluated the apoptosis of MCF-7;Western blot detected the protein level of proliferation and apoptosis related protein；scratch assay measured the ability of migration.Results: Human breast cancer cell line MCF-7 was treated by baicalein or U0126 at different concentration for 24 h,CCK8 assay suggested that both of them can dramatically inhibit MCF-7 proliferation in a dose-dependent way (P<0.05).Compared to the blank and DMSO groups,the human breast cancer cell line MCF-7 was treated with baicalein for 24 h,the cellular rate at G0-G1 phase increased a lot (91%) (P<0.05),while the cellular rate at S phase reduced dramatically (P<0.05),cell apoptosis increased dramatically by microscopy and TUNEL assay(P<0.05),the level of ERK1/2,CyclinD1 and JNK reduced quickly (P<0.05).Compared to the baicalein group,MCF-7 was treated by baicalein combined with U0126,the cellular rate at S phase decreased remarkably (P<0.05),apoptosis was much obvious (P<0.05),the phosphorylation level of ERK1/2 and JNK reduced a lot (P<0.05),and the proliferation accelerator CyclinD1 highly decreased (P<0.05);the scratch assay demonstrated that cell migration was dramatically inhibited when MCF-7 was treated by 20 μmol/L baicalein(P<0.05).Conclusion: Both of baicalein and U0126 can inhibit the proliferation and migration,induce the apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7 through decreasing the level of ERK,JNK and CyclinD1.Baicalein and U0126 can provide some novel avenues to treat breast cancer in clinic.

Baicalein;U0126;Human breast cancer cell line MCF-7;Apoptosis

安宏元(1985年-)，女，在讀碩士，醫師，主要從事乳腺癌的機制研究。

及指導教師：夏紀毅(1979年-)，男，碩士，高級實驗師，主要從事腫瘤的分子機制研究，E-mail：xjyi0615@163.com。

R73

A

1000-484X(2017)02-0206-06

①本文為四川省科技廳項目(14JC01353-LH67)和四川省瀘州市科技局項目(2014-S-44)。

②西南醫科大學附屬中醫醫院婦產科，瀘州646000。

③西南醫科大學附屬醫學實驗中心，瀘州646000。

④西南醫科大學附屬醫院婦產科，瀘州646000。

⑤西南醫科大學信息與工程學院現代教育技術中心，瀘州646000。