一種以蝦原肌球蛋白為致敏原的Th2反應小鼠模型的建立①

方 蕾 侯 睿 費巧玲 高 源 蔡潤蘭 齊 云

(中國醫學科學院藥用植物研究所，北京100193)

·免疫學技術與方法·

一種以蝦原肌球蛋白為致敏原的Th2反應小鼠模型的建立①

方 蕾 侯 睿 費巧玲 高 源 蔡潤蘭 齊 云

(中國醫學科學院藥用植物研究所，北京100193)

目的：采用蝦原肌球蛋白為致敏原建立Th2反應小鼠模型。方法：蝦原肌球蛋白腹腔注射小鼠6周誘導Th2反應，ELISA測定小鼠血清總IgE、sIgE和sIgG水平、脾淋巴細胞分泌Th1和Th2細胞因子的含量，采用流式細胞術檢測血液中嗜堿性粒細胞的活化。結果：與對照組比較，致敏6周的小鼠血清總IgE、sIgE和sIgG(sIgG1、sIgG2a和sIgG2b)均顯著升高；脾淋巴細胞在抗原刺激后分泌Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)增加，而Th1細胞因子INF-γ則出現明顯降低；血液中嗜堿性粒細胞表面標志物CD200R和CD41表達增強。結論：成功建立一種以蝦原肌球蛋白為致敏原的Th2反應小鼠模型。

Th2反應；蝦原肌球蛋白；嗜堿性粒細胞；IgE

輔助T細胞(T helper，Th)是由初始CD4+T細胞分化而來。初始CD4+T細胞在胸腺內成熟后遷移至外周淋巴器官，與激活的抗原呈遞細胞相互作用分化為Th1、Th2、Th17和調節性T細胞等多種功能亞群，Th細胞通過細胞因子網絡維持動態平衡。目前認識到Th1/Th2細胞失衡現象存在于感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病和變態反應性疾病等多種疾病中[1]，而Th2優勢反應最常見于過敏性疾病，與IgE生成密切相關。在實驗研究中，Ⅰ 型過敏反應動物模型通常以卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)和二硝基苯酚(Dinitrophenol，DNP)與載體蛋白的偶聯物誘導。前者模擬大分子致敏，后者則模擬小分子(半抗原)致敏。但我們的研究結果卻顯示OVA對嚙齒類動物IgE的誘導情況并不理想，尤其在沒有佐劑的情況下更為明顯[2]。這與普通鼠飼料含蛋粉，長期食用致免疫耐受有關[3]。而小分子DNP誘導的過敏模型代表半抗原致敏，并不能完全替代臨床上對大分子(蛋白質、多肽)致敏的情形。因此，實驗研究中迫切需要一種致敏性高的大分子抗原物質。蝦蛋白也是食品中極重要的一類變應原[4]，且不是普通鼠飼料中的必須組分。通過與相同劑量條件下的OVA進行比較，小鼠對蝦蛋白的響應性遠高于OVA[2]。據此，我們提取了蝦的主要過敏原成分——原肌球蛋白，誘導小鼠模型，從與IgE生成密切相關的Th2效應來探討蝦原肌球蛋白致敏模型的特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 雌性BALB/c小鼠(6～8周齡)，16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證編號：SCXK(京)2012-0001]。于中國醫學科學院藥用植物研究所SPF級動物房常規飼養。

1.1.2 主要試劑 小鼠IgE ELISA試劑盒購自美國Biolegend公司，protein G PLUS-Agarose購自美國Santa cruz biotechnology公司，HRP標記的大鼠抗小鼠IgE二抗購自英國Abcam公司，兔抗小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b抗體購自美國OriGene Technologies公司，FITC標記的抗小鼠IgE、PerCP-eFluor 710標記的抗小鼠CD41、PE標記的抗小鼠CD200R抗體購自美國BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 鋁佐劑的配制 分別配制質量分數5%的Al2(SO4)3溶液和NaOH溶液，取Al2(SO4)31.0 g，溶于20 ml無菌三蒸水中，即NaOH 0.4 g，溶于8 ml無菌三蒸水中；在強烈攪拌下，將NaOH加入Al2(SO4)3中，4 000 r/min離心15 min，無菌生理鹽水重懸2次，最終以生理鹽水定容至20 ml，-20℃分裝保存。

1.2.2 蝦原肌球蛋白的提取和鑒定 取新鮮的刀額新對蝦(Metapenaeusensis)，去頭去殼，蝦肉研碎勻漿，參照文獻[5]采用等電點沉淀的方法提取原肌球蛋白，通過SDS-PAGE對其分子量進行鑒定。

1.2.3 蝦原肌球蛋白誘導小鼠Th2反應 小鼠隨機分為佐劑對照組和模型組。蝦原肌球蛋白配制成400 μg/ml(生理鹽水配制)，再加入等體積的鋁佐劑，蝦原肌球蛋白的終濃度為200 μg/ml。模型組小鼠腹腔注射0.1 ml蝦原肌球蛋白，即20 μg/只，每周1次，共6周。佐劑對照組則給予等體積含佐劑的生理鹽水。

1.2.4 ELISA法測定小鼠血清總IgE及抗原特異性IgE(antigen-special immunoglobulin E，sIgE) 小鼠6周末摘眼球取血，分離血清，參照ELISA測定試劑盒說明書測定總IgE的含量。sIgE的檢測參考文獻[6]所述，并加以改進：待測血清先與protein G PLUS-Agarose以體積比1∶9混合，除去血清中的IgG。室溫反應30 min，期間每隔5 min混懸1次；2 500 r/min 離心10 min，取上清；將上清以PBS稀釋10倍后取100 μl加入預包被蝦原肌球蛋白的ELISA板(1 μg/孔)中，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入HRP-大鼠抗小鼠IgE二抗(1∶5 000稀釋)，100 μl/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板5次，TMB顯色37℃孵育10 min，每孔加100 μl 2 mol/L H2SO4終止，于450 nm處讀數。

1.2.5 ELISA法測定小鼠抗原特異性IgG(antigen-special immunoglobulin G，sIgG) 取6周末小鼠血清檢測sIgG，方法與上述測定sIgE的方法相似：待測血清稀釋后直接加入包被蝦原肌球蛋白的ELISA板中，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入兔抗小鼠IgG1(1 ng/ml)或IgG2a(2 μg/ml)或IgG2b抗體(1 ng/ml)，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，37℃ TMB孵育10 min顯色，H2SO4終止，于450 nm處讀數。

1.2.6 流式細胞術檢測血液中嗜堿性粒細胞CD200R和CD41的表達 小鼠摘眼球取血，全血置于EDTA-K2抗凝管中，取抗凝血100 μl加入終濃度為5 μg/ml的蝦原肌球蛋白，37℃孵育。2 h后，加入FITC標記的抗小鼠IgE、PerCP-eFluor 710標記的抗小鼠CD41和PE標記的抗小鼠CD200R抗體，4℃避光孵育15 min，再加入流式專用紅細胞裂解液2 ml避光孵育5 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加2 ml PBS洗1次，離心，最后加0.3 ml PBS重懸細胞，FACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)檢測，收集1 000個IgE+細胞，于流式分析軟件Flowjo 7.6.1中分析CD200R和CD41的表達(Mean fluorescence intensity，MFI)。

1.2.7 蝦原肌球蛋白刺激小鼠脾淋巴細胞72 h分泌細胞因子 小鼠于6周末處死后，于75%酒精中浸泡5 min消毒皮毛。參照文獻[5]，無菌條件下取脾臟，制備脾細胞懸液，以4×106個/孔鋪24孔板，各孔加入終濃度為4 μg/ml蝦原肌球蛋白，37℃孵育培養。蛋白刺激72 h后，取上清采用ELISA法測定IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ的含量。

2 結果

2.1 模型小鼠血清總IgE和sIgE 經電泳鑒定提取的刀額新對蝦原肌球蛋白分子量為36 kD，與文獻報道吻合[7]。采用蝦原肌球蛋白誘導小鼠模型，與對照組比較，第6周的動物血清總IgE和sIgE含量均明顯升高(P<0.01)，見圖1。

2.2 模型小鼠血清sIgG1、sIgG2a和sIgG2b 由圖2可見，與對照組比較，模型組小鼠血清sIgG2a、 sIgG2b和sIgG1均明顯升高(P< 0.01)。從血清稀釋倍數可見，以sIgG1含量最高。

圖1 小鼠血清總IgE和sIgE含量Fig.1 Levels of total IgE and sIgE in serum of ST-sensitized miceNote: Mice were sensitized by ST intraperitoneally once a week.At day 42,sera from different groups of mice were obtained.The total IgE (A) and sIgE (B) levels were determined by using ELISA.Data present the ±s(n=6).##.P< 0.01 vs control group.

圖2 模型小鼠血清sIgG1、sIgG2a和sIgG2b含量Fig.2 Levels of sIgG1,sIgG2a and sIgG2b in serum of ST-sensitized miceNote: Mice were sensitized by ST intraperitoneally once a week.At day 42,sera from different groups of mice were obtained.The levels of sIgG1 (A),sIgG2a (B) and sIgG2b (C) were determined by using ELISA.Sera were diluted 1∶2×105 for sIgG1,1∶1 000 for sIgG2a,and 1∶4×104 for sIgG2b.Data present the ±s(n=6).##.P< 0.01 vs control group.

圖3 蝦原肌球蛋白刺激模型小鼠脾細胞分泌細胞因子Fig.3 Splenocyte cytokine secretion in response to STNote: Spleen cells from control or ST-sensitized mice were cultured for 72 h in the presence of ST.Cytokines in culture supernatants (A.IL-4,B.IL-5,C.IL-10,D.IL-13 and E.IFN-γ) were measured by ELISA.Data present the ±s(n=5).##.P< 0.01 vs control group.

圖4 模型小鼠血液中嗜堿性粒細胞CD200R和CD41的表達Fig.4 Basophil CD200R and CD41 expression in response to STNote: Whole blood was incubated with ST.MFI of CD200R (A,C-F) and CD41 (B,G-J) on basophils were analyzed by flow cytometry.).#.P< 0.05,##.P< 0.01 vs control group.

2.3 蝦原肌球蛋白刺激模型小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子 通過預實驗我們考察了蝦原肌球蛋白(0.5～8 μg/ml劑量范圍)的最佳刺激量為4 μg/ml。在該造模劑量條件下，如圖3所示，與對照組比較，抗原刺激模型小鼠脾淋巴細胞72 h可見上清中IL-4、IL-5、IL-10和IL-13含量均顯著升高(P<0.01)，而模型組的IFN-γ則顯著降低(P<0.01)。

2.4 模型小鼠血液中嗜堿性粒細胞CD200R和CD41的表達 通過預實驗我們考察了5～20 μg/ml劑量范圍內蝦原肌球蛋白的體外刺激小鼠抗凝血合理劑量為5 μg/ml?？乖c抗凝血孵育2 h后，模型組CD200R的表達較對照組明顯增強(圖4E、F：CD200R+嗜堿性粒細胞對照組2.17% vs 模型組52.9%)；CD41的表達也增加，但是不如CD200R趨勢顯著(圖4I、J：CD41+嗜堿性粒細胞對照組18.3% vs 模型組33.0%)。

3 討論

Ⅰ型過敏反應常見Th2優勢反應，Th2細胞因子是促進B細胞發生抗體類型轉換生成IgG1和IgE類抗體的關鍵因子。過敏患者可見血清sIgG、sIgG1和sIgE的明顯升高[8]；Th2細胞因子IL-4在哮喘患兒血清中濃度升高，而Th1細胞因子IFN-γ濃度則下降，出現Th1/Th2細胞免疫失衡[9]。在本文建立的以蝦原肌球蛋白為抗原的小鼠Th2模型中，小鼠血清總IgE、sIgE和sIgG(sIgG以sIgG1含量最高)含量均顯著增加(圖1～2)；同時，抗原刺激模型小鼠脾細胞分泌的Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13均顯著升高，而Th1效應則受到抑制，IFN-γ的含量明顯下降(圖3)，可見該模型呈現典型的Th2反應亢進。

人們很早就認識到肥大細胞是 Ⅰ 型過敏反應的主要參與者，通過IgE介導其激活。然而，和肥大細胞表型和功能相似的嗜堿性粒細胞，由于占白細胞總數的比例不到1%，在很長一段時期內，都被認為是血液循環中殘余的肥大細胞，對其功能關注并不多。近年來，國內外學者發現多種過敏性疾病的發生以及發病的嚴重程度與人體內能夠激活的致敏嗜堿性粒細胞(其表面標志物CD63的表達增強)的比例以及脫顆粒的程度相關[10，11]。隨著嗜堿性粒細胞條件性缺失技術的發展和高純度細胞分選技術的應用，嗜堿性粒細胞的新生物學作用被逐一闡明：目前已發現它不僅是Th2細胞因子IL-4的主要來源細胞，而且可能具有潛在獨立的或協同樹突狀細胞的抗原提呈作用，調節Th2應答[12]。進一步的研究則明確了嗜堿性粒細胞參與過敏性哮喘小鼠Th2反應：抗原致敏和激發導致了小鼠血液和肺組織中嗜堿性粒細胞的數量明顯增加，同時伴隨其激活標志物CD200R的表達上調。然而，采用MAR-1或Ba103抗體清除嗜堿性粒細胞后氣道炎癥明顯減輕，脾臟和引流淋巴結Th2亞群減少，肺組織IL-4和血清sIgE均顯著降低[13]。目前，小鼠嗜堿性粒細胞激活標志物研究并不多，研究顯示小鼠的嗜堿性粒細胞CD200R的激活和胞內IL-4的水平成正相關[14]；CD41是血小板和巨核細胞的標志物，還表達于人和小鼠骨髓來源的肥大細胞，2014年有研究者首次嘗試將CD41作為寄生蟲感染性疾病嗜堿性粒細胞活化的標志物[15]。在本文建立的以蝦原肌球蛋白為抗原的Th2模型中，我們檢測到小鼠血液中嗜堿性粒細胞表面活化標志物CD200R和CD41表達明顯增強(圖4)，表明嗜堿性粒細胞處于激活狀態。

綜上所述，蝦原肌球蛋白克服了傳統大分子抗原OVA在嚙齒類動物中的免疫耐受問題，具有更高的致敏性，可能是經典致敏原的一個更好的替代品。經腹腔注射蝦原肌球蛋白能夠成功誘導小鼠發生明顯的Th2優勢反應，產生與臨床Ⅰ型過敏反應患者類似的免疫學改變，表現為脾淋巴細胞分泌Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13增加，分泌Th1細胞因子IFN-γ的含量明顯下降，呈現Th1/Th2免疫反應的明顯失衡；血清抗體水平總IgE、sIgE和sIgG的含量升高；血液中嗜堿性粒細胞活化，其表面活化標志物CD200R和CD41表達明顯增強。該模型的應用價值在于，研究者們能夠利用這種以Th2反應為主的動物模型為基礎選擇進行多種實驗，例如可直接以抗原激發建立全身(經靜脈)或局部(經呼吸道)的主動過敏模型，或采用其富含IgE的致敏血清可用于被動皮膚過敏反應模型；而脾細胞反應以及嗜堿性粒細胞激活實驗均可用于體外抑制Th2反應藥物的評價，這些將為抗過敏性疾病創新藥物的機制研究提供良好的應用平臺。

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[收稿2016-06-16 修回2016-08-25]

(編輯 倪 鵬)

A murine model of Th2 response induced by shrimp tropomyosin

FANGLei,HOURui,FEIQiao-Ling,GAOYuan,CAIRun-Lan,QIYun.

InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193，China

Objective:To develop murine models of Th2 response induced by shrimp tropomyosin (ST).Methods: Mice were sensitized with ST for 6 weeks.The serum antigen-special IgE (sIgE),total IgE and sIgG level,Th1/Th2 cytokines production were measured by ELISA.The basophil activation in mice was measured by flow cytometry.Results: The intraperitoneal sensitization with ST for 6 weeks induced significant increase of serum sIgE,total IgE and sIgG (sIgG1,sIgG2a and sIgG2b) level in mice.Th2 cell response was induced and cytokines (IL-4,IL-5,IL-10 and IL-13) production increased in splenocytes stimulated by ST,while Th1 cytokine (IFN-γ) production decreased.As the markers of basophil activation,CD200R and CD41 expression also increased in response to ST.Conclusion: The Th2 response is dominant in ST-induced anaphylaxis in mice.

Th2 response;Shrimp tropomyosin;Basophil;IgE

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.014

①本文受國家科技重大專項(2014ZX09201022-006)和北京市自然科學基金項目(7142112)資助。

方 蕾(1983年-)，女，博士，講師，主要從事抗過敏中藥藥理學研究，E-mail：fanglei@yzu.edu.cn，就職于揚州大學醫學院。

及指導教師：齊 云(1964年-)，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事抗炎免疫藥理學研究，E-mail：yqi@implad.ac.cn。

R392.8

A

1000-484X(2017)02-0233-05