尿蛋白質(zhì)組學(xué)在IgA腎病中的研究進展

章永，羅軍，歐陽艷，曹婷婷

(1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北宜昌443000；2.監(jiān)利縣人民醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北荊州433300；3.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院兒科，湖北宜昌443000)

尿蛋白質(zhì)組學(xué)在IgA腎病中的研究進展

章永1，2，羅軍3，歐陽艷3，曹婷婷3

(1.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北宜昌443000；2.監(jiān)利縣人民醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北荊州433300；3.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院兒科，湖北宜昌443000)

以往IgA腎病的臨床診斷主要依賴于腎活檢，而腎活檢不僅費用高、有相對和絕對禁忌證，而且為有創(chuàng)操作，風(fēng)險較高。近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)，尤其是尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，使得人們能夠全面、動態(tài)地考察疾病發(fā)生過程中蛋白質(zhì)種類及數(shù)量的改變，對IgA腎病的研究也有了長足的進步。本文就有關(guān)尿蛋白質(zhì)組學(xué)在IgA腎病的相關(guān)研究進展進行綜述。

尿蛋白質(zhì)組學(xué)；IgA腎病；禁忌證

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是我國乃至世界范圍內(nèi)最常見的一種原發(fā)性腎小球疾病，其預(yù)后欠佳[1]，20%～50%的IgA腎病患者都會在20年內(nèi)進展至終末期腎臟疾病(end-stage renal disease，ESRD)[2]。以往IgA腎病通常都是依靠腎活檢來確診，而腎活檢不僅費用高、有相對和絕對禁忌證，而且為有創(chuàng)操作，風(fēng)險較高。如何采用非侵入性的生物標(biāo)記物來研究IgA腎病，是相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者們需要攻克的難題，尿蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)及發(fā)展對該項研究的突破提供了重要的理論基礎(chǔ)和新思路，我們將就此進行綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

隨著人類科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對人類疾病的研究已不僅僅局限于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，逐漸發(fā)展出多種組學(xué)技術(shù)，包括功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和脂類組學(xué)等[3]，這其中的代謝組學(xué)和脂類組學(xué)都是在前二者的研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型學(xué)科，尚存在很多未知領(lǐng)域，而專注于多肽和蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)，較其他學(xué)科顯現(xiàn)出越來越多的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)功能基因組學(xué)只是以靜止的細胞為研究對象，而蛋白質(zhì)組學(xué)研究的對象是真正有執(zhí)行功能的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)的功能需要經(jīng)過眾多復(fù)雜的過程才能形成，比如復(fù)制、重排、轉(zhuǎn)錄及翻譯等，也就是說蛋白質(zhì)的復(fù)雜程度遠甚于基因的表達。因此如何直接而全面的了解蛋白質(zhì)這種生命的呈現(xiàn)者，將對理解疾病的發(fā)生發(fā)展過程起到至關(guān)重要的作用，蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)對解決上述問題提供了重要的理論基礎(chǔ)和新思路。

2 選擇尿蛋白質(zhì)組學(xué)作為IgA腎病研究方法的原因

尿液是人體的一種重要的生物標(biāo)記物來源，當(dāng)腎臟發(fā)生病變時，尿液中蛋白成分的變化會反映出腎損傷的一些信息[4]。然而，尿液中的成分較復(fù)雜，且大多數(shù)生物標(biāo)記物往往是小分子蛋白甚至多肽，常規(guī)的檢測方法比如蛋白電泳等均很難檢測和鑒定，而先進的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)則不會受此影響[5]。尿液之所以能成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的理想來源，還有以下幾點原因：(1)尿液為無創(chuàng)檢查方法，患者易于接受；(2)尿液標(biāo)本不需要過度處理就能分析；(3)尿液標(biāo)本相對穩(wěn)定，在適宜的條件下可以穩(wěn)定保存相對較長時間；(4)成分不如血漿等其他體液復(fù)雜[6]。有鑒于此，在本綜述中，我們采用尿蛋白質(zhì)組學(xué)作為IgA腎病的研究方法。

3 尿蛋白質(zhì)組學(xué)對IgA腎病的研究

3.1 IgA腎病IgA腎病(IgA nephropathy)由Berger和Hinglais[7]在1968年首次報道，又稱為Berger病。Ig A腎病發(fā)病的四重打擊模型由Suzuki等[8]于2011年首先提出，至今仍被普遍認可，新的臨床和基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)豐富了該發(fā)病機制模型。該理論模型包括4個階段：①IgA1產(chǎn)生異常，導(dǎo)致體內(nèi)Gd-IgA1升高；②引起自身免疫反應(yīng)，激發(fā)識別Gd-Ig A1上Gal-NAc抗原上的抗體IgG和IgA產(chǎn)生；③升高的Gd-IgA1和抗糖基化抗體形成免疫復(fù)合物并沉積于系膜區(qū)；④激活補體途徑，刺激系膜細胞，引起細胞因子、趨化因子和細胞外基質(zhì)蛋白的分泌，最終導(dǎo)致炎癥和纖維化的形成。但IgA腎病的產(chǎn)生并不是單一的異常IgA1類分子所造成的，還涉及遺傳因素、免疫學(xué)因素、細胞因子機制[9]等等。想要搞清Ig A腎病的致病原因是一項龐雜的工程，但蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用可能對此提供幫助。

3.2 尿蛋白質(zhì)組學(xué)對IgA腎病發(fā)病機制的研究IgA腎病的發(fā)病機制是近年來尿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究熱點：有研究者采用2D-PAGE(雙向凝膠電泳)對IgA腎病患者尿液通過質(zhì)譜分析法(Mass Spectrometry，MS)鑒定差異表達蛋白，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，IgA腎病患者endorepellin的LG3片段與正常對照相比顯著下降，且LG3水平和腎小球濾過率呈負相關(guān)，而這一相關(guān)性并不存在于糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)、局灶節(jié)段腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)、活動性狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)、膜性腎病(membranous nephropathy，MN)中。另有研究發(fā)現(xiàn)，endorepellin的LG3片段是perlecan的裂解產(chǎn)物，類似血管抑素，具有抗血管生成作用，與腎小球纖維化形成有關(guān)，提示該片段與Ig A腎病的嚴(yán)重程度有關(guān)，并可能和IgA腎病的發(fā)病機制有關(guān)[10]。

Kojima等[11]利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為促進Ig A腎病的病理生理學(xué)的理解而進行研究，并為此建立了“micro sieving”分離腎小球的方法。Kalantari等[12]對13個IgA腎病患者的尿液樣本展開研究，在發(fā)現(xiàn)一系列相關(guān)蛋白之外，還對IgA腎病發(fā)生的機制展開討論，認為細胞外基質(zhì)(ECM)-受體相互作用的途徑受損及補體激活途徑的受損可能參與IgA腎病的疾病進展。

Shiva Samavat等[13]用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/ MS)技術(shù)分析了13例IgA腎病患者及8例健康志愿者的中段尿樣本，一共鑒定出493種特殊蛋白質(zhì)，在通過多變量分析和額外的過濾處理后有46種蛋白質(zhì)被認為很有可能成為IgA腎病的生物學(xué)標(biāo)記物，其中有一些蛋白質(zhì)有著顯著性的表達差異，比如CD44抗原、載脂蛋白D、Vasorin蛋白等，這些蛋白質(zhì)被認為與IgA腎病的炎性反應(yīng)機制和補體系統(tǒng)通路相關(guān)。盡管尿蛋白質(zhì)組學(xué)對IgA腎病發(fā)病機制的研究獲得了一些進展，但迄今為止仍未取得突破性的成果，相關(guān)研究仍在繼續(xù)。

3.3 對IgA腎病診斷及鑒別診斷的研究在尿蛋白質(zhì)組學(xué)的腎臟疾病研究領(lǐng)域，如何通過尿中的生物標(biāo)記物對IgA腎病及其他各種腎臟疾病進行識別正在成為最有價值和富有成效的領(lǐng)域之一。Haubitz等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，一組基于質(zhì)譜圖譜的28肽蛋白質(zhì)可將IgA腎病和膜性腎病區(qū)別開來，而這種方法有著77%的敏感性和100%的特異性。在另外一項研究中發(fā)現(xiàn)[15]，通過CE-MS技術(shù)分析尿蛋白多肽圖譜，還可以分辨出IgAN、DN及FSGS，同樣敏感性和特異性均較高；值得注意的是，目前的研究對這些分析出來的蛋白質(zhì)分子中的一些多肽的組成還不是十分確定，這些蛋白質(zhì)的具體成分還在進一步研究中。毛細管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)法分析IgA腎病患者的尿蛋白質(zhì)能夠?qū)⑵湟恍┫嚓P(guān)腎病中鑒別出來，但上述研究結(jié)果尚缺乏足夠數(shù)量的病例加以驗證，如果上述結(jié)論得以證實，那么CE-MS技術(shù)也將為早期腎臟損傷的檢查提供一種新的手段。Yokota等[16]的一項研究中發(fā)現(xiàn)，在IgA腎病患者的尿液中大多數(shù)蛋白表達都會增加，只有α1微球蛋白(α1-microglobulin,MG)例外；他們用ELISA法也證實了這個結(jié)論；據(jù)此推論，α1-MG在IgA腎病中的可能致病機理：血清中異常的α1-MG與IgA結(jié)合后形成免疫復(fù)合物沉積在腎小球系膜區(qū)，引起了IgA腎病；α1-MG的這種特征性變化，也可使其成為IgA腎病的生物標(biāo)志物，相關(guān)的研究還在進一步進行中。

此后，2006年P(guān)ark等[17]也分析比較了IgA腎病患者和正常人的尿液蛋白質(zhì)組，建立了IgA腎病尿蛋白組學(xué)圖譜，并找到了200多種在IgA腎病中差異表達的蛋白質(zhì)點，其共同代表著59種不同蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)包括胰島素樣受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白前體和激肽原前體等，它們被認為與IgA腎病有關(guān)。

此外，Sui等[18]用MALDI-TOF MS分析了17例系膜增生性腎炎(non-IgAMsPGN，MsPGN)、12例微小病變(minimal change disease，MCD)、10例局灶節(jié)段腎小球硬化癥(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)和10例膜性腎病(membranous nephropathy，MN)患者的尿蛋白質(zhì)組樣本，并與10例健康對照相比較，發(fā)現(xiàn)根據(jù)質(zhì)譜峰型的不同，能區(qū)分不同類型的腎小球腎炎和正常對照。另外一項尿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也采用MALDI-TOF MS的方法分析了IgA腎病和正常對照者的尿液，發(fā)現(xiàn)尿調(diào)節(jié)素(uromodulin，UMOD)和α1抗胰蛋白酶(alpha1-antitrypsin，α1AT)的肽段在IgA腎病患者組和正常對照組之間存在顯著差異，IgA腎病患者存在尿UMOD肽段的豐度降低而A1AT肽段的豐度升高，提示它有助于診斷IgA腎病[19]。

這些個別研究將給IgA腎病的診斷及鑒別診斷提供了新的思路，但大部分研究還存在樣本量偏少的問題，且部分患者可能在出現(xiàn)臨床癥狀之后(如腎病綜合征)、腎穿刺之前就已經(jīng)給予部分與腎臟病相關(guān)的藥物治療，如抗凝血類、激素類、促纖溶類藥物等，這些都會不同程度影響研究結(jié)果，以上的這些問題，都將在今后的研究中加以解決。

3.4 對IgA腎病的治療的研究尿蛋白質(zhì)組學(xué)如何評估IgA腎病的療效，是近年來的研究熱門。IgA腎病出現(xiàn)大量蛋白尿后，常用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)類藥物治療，但由于患者之間的個體差異，導(dǎo)致對治療反應(yīng)不盡相同，因而很難預(yù)測ACEI治療IgA腎病的療效。為此，Rocchetti等[20]分析了接受ACEI治療前后IgA腎病患者的尿液標(biāo)本后發(fā)現(xiàn)，激肽原(kininogen)、甲狀腺轉(zhuǎn)運蛋白(transthyretin)和人類間α胰蛋白酶H4重鏈(inter-alpha-trypsin-inhibitor heavy chain 4)3種蛋白在ACEI治療前后含量存在較明顯差異，提示上述3種蛋白可用于評估ACEI治療IgA腎病的療效。

雖然IgA腎病的治療方法眾多，但目前醫(yī)學(xué)上普遍認為糖皮質(zhì)激素對IgA腎病的治療起到重要作用，它不僅可以影響擴張血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生，還能改善腎小球血管網(wǎng)的血流[21]。目前己有大量研究證實，運用糖皮質(zhì)激素治療后，可有效降低IgA腎病患者的蛋白尿，延緩疾病的進展，但應(yīng)用激素會帶來諸多副作用，比如血糖升高、增加患者潰瘍的風(fēng)險等，且如果長時間運用激素易產(chǎn)生耐藥等問題。有實驗通過尿蛋白質(zhì)組學(xué)對比IgA腎病患者激素治療前后尿液成分變化，發(fā)現(xiàn)部分IgA腎病潛在標(biāo)志物分子有所減少，考慮于激素導(dǎo)致血管通透性降低。在肖姣等[22]的另一項研究中，將6例IgA腎病患者應(yīng)用激素治療前后和6例正常人的尿液蛋白質(zhì)多肽序列圖譜進行比較，在IgA腎病患者的尿液標(biāo)本中，共檢測出260種蛋白質(zhì)點，其共同表達19種蛋白質(zhì)；正常人對照組的尿液樣品中，共鑒定出94種蛋白質(zhì)點，其共同表達29種蛋白質(zhì)，排除某些干擾因素后共鑒定出11種特殊蛋白，這些特殊蛋白質(zhì)有可能會成為IgA腎病激素治療后的新型生物標(biāo)志物，但是這些蛋白質(zhì)的敏感性還需要更大量的樣本予以驗證。

4 問題與展望

目前尿蛋白質(zhì)組學(xué)對IgA腎病的研究仍處于繼續(xù)探索階段，仍然存在許多不足：比如IgA腎病的生物標(biāo)記物仍缺乏特異性、目前還無法獲得專家共識、尿液的制備也缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，而制備方法的不同也可最終影響鑒定結(jié)果，另外現(xiàn)在的蛋白質(zhì)技術(shù)分析方法難以提取某些含量低的蛋白。但隨著尿蛋白質(zhì)組學(xué)更深入的發(fā)展，相應(yīng)的蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)手段不斷的完善，這一研究領(lǐng)域?qū)⒂兄鴱V闊的發(fā)展前景。

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Research progress of urinary proteomics in IgA nephropathy.

ZHANG Yong1,2,LUO Jun3,OUYANG Yan3,CAO Ting-ting3.
1.Department of Nephrology,Renhe Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443000,Hubei, CHINA;2.Department of Nephrology,Jianli People's Hospital,Jingzhou 433300,Hubei,CHINA;3.Department of Paediatrics,Renhe Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443000,Hubei,CHINA

In the past,the clinical diagnosis of IgA nephropathy mainly depends on renal biopsy.Renal biopsy is not only costly and has relative and absolute contraindication,but aslo invasive and has a relatively high risk.In recent years,with the advent of proteomics,especially the development of urinary proteomics,people can make a comprehensive and dynamic study of the changes in the types and quantities of proteins during the course of disease,and the study of IgA nephropathy has made great progress.In this paper,we will review the research progress of urinary proteomics in IgAnephropathy.

Urinary proteomics;IgAnephropathy;Contraindication

R692

A

1003—6350（2017）11—1819—03

2016-10-12)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.11.033

湖北省教育廳自然科學(xué)研究計劃（編號：D20131305）；三峽大學(xué)人才科研啟動基金（編號：KJ2011B080）

羅軍。E-mail：luojunne@163.com