鹽地堿蓬葉中可溶性膳食纖維的提取與抗氧化活性

薛菲+劉順剛+張祥勝

摘要：以鹽地堿蓬葉為試材，采用雙酶法從中提取可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）。通過單因素試驗及正交試驗研究不同提取條件對堿蓬葉中SDF提取率的影響；通過測定羥自由基清除率、還原力和DPPH自由基清除率鑒定其抗氧化性。結果表明，雙酶法提取SDF的最佳工藝條件為料液比1 g ∶25 mL、木瓜蛋白酶用量16%、酶解時間3 h、酶解溫度55 ℃、糖化酶用量1.0%；提取液具有顯著的羥自由基清除率、DPPH自由基清除能力和鐵還原力。

關鍵詞：鹽地堿蓬葉；可溶性膳食纖維；抗氧化；正交試驗；提取工藝

中圖分類號： TS201.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0175-03

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）為藜科、堿蓬屬草本植物，別稱鹽蓬、黃須菜、鹽蒿，是典型的鹽地指示植物。幼苗可作蔬菜，種子可榨油。富含不飽和脂肪酸、維生素和微量元素，具有降糖、降壓、擴張血管、防治心臟病和增強人體免疫力等藥用效能[1]。膳食纖維一般指包含纖維素、半纖維素、樹脂、果膠及木質素等成分，在人體中不易被消化吸收的多糖類食物成分，主要存在于植物的細胞壁中。根據膳食纖維的溶解性不同，它包括可溶性膳食纖維（SDF）和不溶性膳食纖維（IDF）[2-3]。膳食纖維對人的生理具有積極的促進作用，包括通便、降血脂、降血糖等[4]。近年來，對鹽地堿蓬葉化學成分方面的研究，主要為無機元素，而有機成分僅限于對其營養成分和總黃酮提取測定方面的研究，關于其中SDF提取工藝及其抗氧化活性方面極少，因此，本試驗主要研究鹽地堿蓬葉中SDF的提取條件，通過優化條件，獲得最高提取率，并通過不同方法評價其提取物的抗氧化性，旨在為鹽地堿蓬葉作為天然抗氧化劑來源的可行性開發提供前期準備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試堿蓬葉，采摘于江蘇省鹽城市灘涂自然保護區。供試藥劑有木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g），江蘇銳陽生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽地堿蓬葉中SDF提取工藝流程 堿蓬葉干燥至恒質量→粉碎→過篩（40目）→稱取樣品1 g→加磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH值為6.6）溶解、調pH值至7.0→加入植物蛋白酶酶解→滅酶（100 ℃，5 min）→調pH值至4.0～4.6、加入糖化酶、酶解（酶解溫度60 ℃）→滅酶（100 ℃，5 min）→（用2層紗布過濾）離心（9 000 r/min，4 min）取濾液濃縮至 5 mL→醇析（4倍體積95%熱乙醇）→離心（9 000 r/min，4 min）、取濾渣、洗滌濾渣（用丙酮、78%乙醇）→干燥至恒質量，即得SDF，計算SDF提取率[4-5]。

1.2.2 SDF提取率的計算 SDF提取率=[提取所得的SDF質量（g）/樣品質量（g）]×100%。

1.2.3 鹽地堿蓬葉SDF提取條件優化 選取對SDF提取率有影響的料液比、植物蛋白酶酶解時間、植物蛋白酶添加量、植物蛋白酶酶解溫度、糖化酶添加量等5個因素，在單因素試驗的基礎上，做5因素4水平的正交試驗，考察其對SDF提取率的影響（表1）。

1.2.4 鹽地堿蓬葉中SDF提取物抗氧化活性研究

1.2.4.1 羥自由基清除率的測定 羥自由基的清除能力是體外常用的評估抗氧化方法之一[6]。本試驗采用紫外分光光度法，取9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL，9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，加入不同濃度的SDF提取液1 mL，靜置30 min，用蒸餾水作空白對照，510 nm處測量其吸光度，代入以下公式計算[7-8]：

清除率=[1-（D1-D2）/D3]×100%。

式中：D1表示加了樣液的吸光度；D2表示不加顯色劑的樣液的本底吸光度，是為了減去樣液本身顏色對于試驗的影響；D3表示以蒸餾水代替樣液的空白管的吸光度。

1.2.4.2 還原力的測定 取1 mL不同濃度的SDF提取液分別置于試管中，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值為6.6）0.2 mL和1%鐵氰化鉀溶液0.5 mL，50 ℃水浴 20 min，快速冷卻后加入10%三氯乙酸溶液1 mL，以 2 000 r/min 的轉速離心10 min，取上清液1.5 mL，加入3 mL蒸餾水和0.1% FeCl3溶液1 mL，以蒸餾水作為空白對照，充分混勻，靜置10 min后，在700 nm下測定其吸光度值D[9]。

1.2.4.3 DPPH自由基清除率的測定 取不同料液比的SDF提取液各1.0 mL加入試管中，加含0.057 mg/mL DPPH自由基的乙醇溶液1.0 mL，置于暗處反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水作為空白，計算清除率[10-11]。

清除率=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。

式中：Di表示1 mL提取液+1 mL DPPH溶液的吸光度；Dj表示1 mL提取液+1 mL無水乙醇的吸光度；D0表示1 mL DPPH+1 mL無水乙醇的吸光度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對SDF提取率的影響 設定植物蛋白酶添加量12%，稱取1 g樣品，在50 ℃下酶解4 h，糖化酶添加量 1.0%，分別按照料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g ∶mL）提取SDF，考察料液比對SDF提取率的影響（圖1）。

由圖1可知，隨著溶劑的量的增大，SDF提取率先上升后下降，且在1 g ∶15 mL處時提取率最高，為16.21%。因此，確定設計料液比在1 g ∶15 mL左右為宜。可能是因為溶劑過少時溶解度低，反應體系較為黏稠，酶與底物接觸不夠充分；但當溶劑過多時，底物濃度過低，酶被稀釋，使底物與酶之間的結合受阻，因此SDF提取率隨著溶劑的量的增大呈先升后降的趨勢。

2.1.2 植物蛋白酶添加量對SDF提取率的影響 設定料液比為1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%，分別按8%、12%、16%、20%、24%的植物蛋白酶添加量，50 ℃下酶解4 h，計算SDF提取率（圖2）。由圖2可知，隨著植物蛋白酶添加量的提高，SDF提取率先增加后降低，且在添加量為16%時，達到最大提取率 18.66%。可能是因為植物蛋白酶增加后，使底物與酶反應更徹底，所以SDF提取率越來越高；而繼續增加植物蛋白酶量時，過多的酶反而抑制了反應的進行，致使SDF提取率反而降低。所以植物蛋白酶添加量在16%時最佳。

2.1.3 植物蛋白酶酶解時間對SDF提取率的影響 設定料液比為1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%， 植物蛋白酶添加量16%，酶解溫度50 ℃，分別酶解2、3、4、5、6 h，計算SDF提取率（圖3）。由圖3可知，隨著植物蛋白酶酶解時間的增加，SDF提取率先增加后降低，且在3 h時SDF提取率最大，為21.15%。可能是因為隨著酶解時間的增加，堿蓬葉中的SDF被充分提取出來，而隨著時間越來越長，SDF暴露在空氣中被氧化，提取量反而減少。因此蛋白酶酶解時間3 h為最佳提取條件。

2.1.4 植物蛋白酶酶解溫度對SDF提取率的影響 設定料液比為1 g ∶15 mL，糖化酶添加量1.0%，植物蛋白酶添加量16%，酶解3 h，分別于40、45、50、55、60 ℃對蛋白酶進行酶解提取SDF，考察植物蛋白酶酶解溫度對SDF提取率的影響（圖4）。由圖4可知，隨著酶解溫度的提高，SDF提取率先增加后降低，且在50 ℃時最大，達19.29%。可能是因為隨著酶解溫度提高，植物蛋白酶的活性也越來越高，從而SDF的提取率增加，而當酶解溫度超過最適溫度后，蛋白酶漸漸失活，提取率也降低。所以50 ℃為適宜的蛋白酶酶解溫度。

2.1.5 糖化酶添加量對SDF提取率的影響 設定料液比為1 g ∶15 mL，植物蛋白酶添加量15%，50 ℃酶解3 h，分別加入糖化酶0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，考察其添加量對SDF提取率的影響（圖5）。由圖5可知，隨著糖化酶添加量的提高，SDF提取率先增加后降低，且當添加量為1.0%時，提取率達到19.68%。因此，確定糖化酶添加量在1.0%時為最佳提取條件。

2.2 正交試驗結果

由表2可知，因為RA>RB>RC>RD>RE，所以各因素對SDF提取率影響的大小依次為A>B>C>D>E，各種因素的k值表明各因素水平的影響程度分別是A4>A3>A2>A1，B3>B4>B2>B1，C2>C4>C3>C1，D3>D4>D1>D2，E3>E4>E2>E1，各因素水平的最佳組合為A4B3C2D3E3，即堿蓬葉中SDF提取的最佳條件為料液比1 g ∶25 mL，植物蛋白酶添加量為16%，酶解時間為3 h，酶解溫度為55 ℃，糖化酶添加量為 1.0%。

2.3 鹽地堿蓬葉中SDF的抗氧化作用

2.3.1 羥自由基清除率的測定 不同料液比的SDF提取液對羥自由基的清除作用見圖6。由圖6可知，料液比分別為 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g ∶mL）的提取液清除自由基時，它的羥自由基清除率隨著料液比的增加而降低，與樣品的濃度呈正相關，當樣品濃度達到一定程度時，羥自由基清除率將趨于穩定，這與張志旭等的研究結果[12]一致。

2.3.2 還原力的測定 對不同料液比的SDF提取液測其吸光度，吸光度D值越大，表示還原力越強，其相應的還原力測定值見圖7。由圖7可知，隨著料液比的增加，它的吸光值呈下降趨勢，說明鹽地堿蓬葉中可溶性膳食纖維隨著料液比的增加還原力降低。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測定 DPPH自由基是一種穩定的自由基，根據吸光度的變化可測得樣品中清除率的大小[13]。不同料液比的SDF提取液其對DPPH自由基的清除作用見圖8。由圖8可知，不同料液比的SDF溶液對DPPH自由基清除能力呈正相關關系，隨著料液比的增加，DPPH自由基清除率越小。

3 結論

該試驗以鹽地堿蓬葉中的SDF提取率為指標，采取單因素試驗，確定單因素的合適范圍，在此基礎上進行正交試驗優化提取工藝。結果表明，各因素水平的最佳組合為A4B3C2D3E3，即堿蓬葉中SDF提取的最佳條件為料液比 1 g ∶25 mL，植物蛋白酶添加量為16%，酶解時間為3 h，酶解溫度為55 ℃，糖化酶添加量為1.0%。通過羥自由基清除率、還原力和DPPH自由基清除率鑒定其提取液的抗氧化性，提取液具有顯著的羥自由基清除率、DPPH自由基清除能力和鐵還原力，為其作為功能性食品開發提供了參考。

參考文獻：

[1]邵秋玲，李玉娟. 鹽地堿蓬開發前景廣闊[J]. 植物雜志，1998（3）：12.

[2]扈曉杰，韓 冬，李 鐸. 膳食纖維的定義、分析方法和攝入現狀[J]. 中國食品學報，2011，11（3）：133-137.

[3]Llobera A，Canellas J. Dietary fiber content and antioxidant activity of Manto Negro red grape （Vitis vinifera）：pomace and stem[J]. Food Chemistry，2007，101（2）：659-666.

[4]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品中膳食纖維的測定：GB/T 5009.88—2014[S]. 北京：中國標準出版社，2015.

[5]鄭 毅，伍 斌，鄧建梅. 酶-重量法測定不同品種芒果皮中膳食纖維的含量[J]. 熱帶農業工程，2013，37（1）：4-7.

[6]王海寬，趙新淮，姜 巖. 甘草有效成分分離及其對自由基的清除能力[J]. 食品與機械，2000，21（4）：23-24.

[7]鄭德勇，安鑫南. 竹葉提取物清除DPPH自由基的測定方法[J]. 福建農林大學學報（自然科學版），2005，34（1）：59-62.

[8]郭艷華，胡思前. 荸薺皮提取物的抗氧化活性研究[J]. 食品與發酵工業，2007，33（10）：128-130.

[9]楊曉寬，李漢臣，張建才，等. 蘆筍膳食纖維品質分析及抗氧化性研究[J]. 中國食品學報，2013，13（10）：205-212.

[10]張建民，肖小年，易 醒，等. 車前草可溶性膳食纖維的提取及其對自由基清除能力的研究[J]. 天然產物研究與開發，2007，19（4）：667-670.

[11]方 敏，占才貴，宮智勇. 玉米須總黃酮的提取與抗氧化活性研究[J]. 食品科學，2009，30（18）：206-208.

[12]吳巧攀，喬洪翔，何厚洪，等. 銀杏葉渣中多糖的提取及其抗氧化活性研究[J]. 中國現代應用藥學，2014（1）：9-13.

[13]張志旭，陳岳文，劉東波. 苦瓜膳食纖維的抗氧化活性研究[J]. 現代食品科技，2012（8）：933-935.葉 坤，左 金，黃昊宇，等. 一種新的綜合法破壁靈芝孢子技術[J]. 江蘇農業科學，2017，45（1）：178-180.