TCT聯合HPV E6/E7 mRNA定量檢測宮頸上皮內瘤變的臨床應用價值

任美英+王翠峰+菅建國

【摘要】 目的：探討利用HPV E6/E7 mRNA檢測技術檢測婦科子宮頸上皮內瘤變的臨床應用價值。方法：對69例TCT檢查結果為宮頸上皮內瘤變的患者，應用HPV E6/E7 mRNA檢測技術對感染HPV病毒中的癌基因片段E6、E7轉錄子做出定量檢測。結果：>ASC-H組E6/E7 mRNA轉錄陽性率、轉錄數分別為60.6%、（18 285.42±1487.71），均高于≤ASC-H組的33.3%、（2668.43±681.39），差異均有統計學意義（P<0.05）；宮頸細胞學檢查為宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA轉錄數明顯高于其他類型，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：宮頸上皮內瘤變與E6/E7 mRNA轉錄具有相關性，即轉錄數與病變的進展程度及細胞的惡性轉化密切相關，在宮頸癌篩查中檢測HPV E6/E7 mRNA的轉錄具有潛在價值。

【關鍵詞】 TCT； HPV E6/E7 mRNA定量檢測； 宮頸上皮內瘤變

【Abstract】 Objective：To discuss the clinical application value of quantitative detection the HPV E6/E7 mRNA in cervical intraepithelial neoplasia.Method：In 69 cases of TCT examination results for cervical intraepithelial neoplasia，use of HPV E6/E7 mRNA detection technology for the infection of HPV virus in the cancer gene fragment E6，E7 transcription to make quantitative detection.Result：>ASC-H group HPV E6/ E7 mRNA transcription positive rate （60.6%） was higher than the≤ASC-H group （33.3%），>ASC-H group HPV E6/E7 mRNA transcription number （18 285.42±1487.71） was higher than the ≤ASC-H group （2668.43±681.39），the differences were statistically significant（P<0.05）.Cervical cytological examination for cervical cancer HPV E6/E7 mRNA transcription number was significantly higher than other types，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The cervical intraepithelial neoplasia is closely related to the E6/E7 mRNA transcription，that is，and that means the HPV E6/E7 mRNA transcription affect the the progression of lesions and malignant transformation of cells，quantitative detection the HPV E6/E7 mRNA has potential clinical application value in the screening of cervical intraepithelial neoplasia.

【Key words】 TCT； Quantitative detection of HPV E6/E7 mRNA； Cervical intraepithelial neoplasias

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College to Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou 014010，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.029

研究認為單一的宮頸細胞學檢查不論是傳統的巴氏涂片還是薄層液基細胞學檢查（TCT）對于宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的敏感性均較低[1]。目前研究已證實，人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌發生的主要危險因素，其中高危型的HPV病毒持續性感染可導致宮頸癌及癌前病變，HPV E6/E7是病毒癌基因轉錄產物，其表達可導致宿主細胞的惡性轉化[2]，但在大部分HPV感染的病例中病毒會自動清除，只有少部分會發展成為對上皮細胞的高度損傷[3]。目前文獻[4]研究表明，宮頸細胞的病變程度不單與病毒類型以及負荷量相關，更和病毒的活動程度關系緊密。而病毒癌基因組E6/E7的轉錄子mRNA作為病毒活動程度的指標，其定量檢測具有非常重要的臨床輔助診斷價值。有研究建議采用HR-HPV E6/E7 mRNA檢測對ASC-US進行分流[5]。本研究為來自包頭醫學院第一附屬醫院婦科就診并同時行TCT檢查及HPV E6/E7 mRNA定量檢測854例患者，并對TCT檢查結果為宮頸上皮內瘤變的69例患者的HPV E6/E7 mRNA定量檢測結果進行回顧性分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年6月-2016年6月就診于本院婦科門診、住院的854患者，年齡18～77歲，臨床表現多為輕或重度宮頸炎癥、宮頸糜爛、不明原因的陰道流血、性交出血，并排除妊娠，取材前3 d內無性生活史。所有研究對象已經倫理學委員會批準，患者均知情同意。endprint

1.2 主要儀器與試劑 QuantiVirusTM診斷試劑盒原材料、QuantiVirusTM冷光儀均由美國Diaca-rtaLLC公司總部提供。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及處理 采用專用宮頸細胞刷收集子宮頸和宮頸鱗柱交界處的脫落細胞，將頸管細胞采集刷伸入陰道并抵住宮頸，其前面的刷毛伸入到宮頸管內，按順/逆時針方向轉動宮頸刷5圈，并立即將其收集到的細胞保存在專用保存液的瓶子中。

1.3.2 分組 本研究按照宮頸細胞學TBS分類法，將宮頸上皮內瘤變分為兩組：第一組為>ASC-H組：包括鱗狀細胞癌（SCC）、腺癌（AC）、高度鱗狀細胞上皮內病變（HSIL）、低度鱗狀細胞上皮內病變（LSIL）；第二組為≤ASC-H組：包括意義不明不典型鱗狀細胞（ASC-US）、不能除外高度不典型鱗狀上皮細胞（ASC-H）。

1.3.3 HPV E6/E7 mRNA定量檢測 HPV E6/E7 mRNA定量檢測使用專利的bDNA技術，利用專利的探針設計捕獲待測目標，再經過雜交信號放大即可定量檢測病毒，最終通過添加底物產生化學發光，以此對待測核酸即HPV病毒中的癌基因片段E6、E7轉錄子做出定量檢測，通過轉錄數值來判斷HPV病毒與上皮細胞整合的情況，從而判斷宮頸癌及癌前病變發生的可能性。轉錄數大于1000為HPV E6/E7 mRNA定量檢測陽性，轉錄數1000～4000為低度危險值；4000～10000為中度危險值；>10000為高度危險值。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCT診斷宮頸上皮內瘤變細胞學及

HPV E6/E7 mRNA檢測結果 854例患者中，TCT檢查結果為宮頸上皮內瘤變的患者有69例，其中36例≤ASC-H組中HPV E6/E7 mRNA轉錄陽性者12例，轉錄陽性率為33.3%；而33例>ASC-H組中HPV E6/E7 mRNA轉錄陽性者20例，轉錄陽性率為60.6%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 不同宮頸上皮內瘤變細胞學平均的HPV E6/E7 mRNA轉錄數值 >ASC-H組E6/E7 mRNA轉錄數為（18 285.42±1487.71），高于≤ASC-H組的（2668.43±681.39），差異有統計學意義（P<0.05）；ASC的HPV E6/E7 mRNA轉錄數為（2668.43±681.39），LSIT為（8416.81±875.62），HSIL為（7129.73±724.38），Ca為（39 309.72±3471.55），宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA轉錄數與其他比較明顯偏高，差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發生的主要危險因素。幾乎100%的高級別CIN以及宮頸癌都合并HPV感染[6]。目前研究表明，宮頸癌是唯一一種經過醫學干預能使發病率和死亡率下降的惡性腫瘤，而預防和控制的關鍵是通過篩查早期發現和治療癌前病變。將液基薄層細胞檢測系統（TCT）檢查作為主要手段應用于宮頸癌篩查以來，已使宮頸癌的發生率和死亡率明顯下降[7]。ASC的診斷標準為細胞出現比單純反應性改變更加顯著的異常特征，但未達到診斷鱗狀上皮內病變的程度，其可能提示慢性子宮頸炎、CIN，甚至是宮頸癌[8-9]。故應十分重視和加強對ASC患者及時、有效地評價和管理，防止宮頸浸潤癌的發生。2012年美國陰道鏡和病理學會提出對于ASC的最佳方案為反饋性HPV檢測，陽性者行陰道鏡檢查[10]。

本研究則以TCT聯合目前最先進的HPV E6/E7 mRNA定量檢測對ASC-US及以上病例進行統計分析，既可以使高度病變得到比較及時的診治，避免漏診，又可以減少臨床負擔。目前用于檢測HPV E6/E7 mRNA水平的方法有核酸序列擴增法和支鏈DNA信號放大技術，部分市售的試劑檢測HR-HPVl6、18、31、33、45中E6/E7 mRNA的轉錄[11]，而本研究所用試劑可檢測14種HR-HPV mRNA，故敏感性更高。

病毒癌基因蛋白E6/E7是細胞惡性轉化的主要原因，一旦HPV整合入人的基因組，E6/E7 mRNA的表達將不受限制，其增加到一個引起惡性轉化的水平，檢測這種致癌基因的轉錄具有不必重復進行檢測即能鑒定高危反復感染者的潛力[12]，在宮頸疾病早期的檢測中具有潛在的價值。

本研究利用QuantiVirusTM檢測法檢測

69例宮頸上皮內瘤變患者的病毒活動程度指標HPV E6/E7 mRNA的轉錄子，發現>ASC-H組E6/E7 mRNA轉錄陽性率、轉錄數分別為60.6%、（18 285.42±1487.71），均高于≤ASC-H組的33.3%、（2668.43±681.39），差異均有統計學意義（P<0.05）；宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA轉錄數高于其他，差異有統計學意義（P<0.05）。

結果表明，宮頸高度病變與E6/E7 mRNA轉錄具有相關性，即HPV E6/E7 mRNA的轉錄與病變的進展程度及細胞的惡性轉化密切相關，這與劉桐宇等[13]的研究，隨著細胞學級別增高，E6/E7 mRNA表達相應增加，不同細胞學分組間mRNA拷貝值差異有統計學意義；與黃寶英等[14]的高危HPV E6/E7 mRNA可以應用于宮頸癌篩查，在篩查中聯合HPV E6/E7 mRNA及細胞學檢測有利于提高診斷準確性的結論相一致；也與潘嬙微等[15-16]HPV E6/E7 mRNA檢測可作為ASC-US患者分流的一種新方法，具有更高的特異性和效能的觀點一致。此外，從本研究結果中可以看出，在≤ASC-H組中也有HPV E6/E7 mRNA轉錄陽性的患者，這應當引起臨床的重視，他們可能是一些潛在的宮頸癌高危患者，而這有待于進一步隨訪研究。endprint

總之，這種以專利的bDNA技術為基礎的HPV E6/E7 mRNA的定量檢測通過對HPV E6/E7轉錄值的升降來判斷宮頸癌及癌前病變發生的可能性，具有很好的重復性和自動化前景，王華等[17]也有類似結論，并認為E6/E7 mRNA更適用于宮頸癌發病風險的評估。HPV E6/E7 mRNA的定量檢測為宮頸癌篩查提供了另一條有意義的途徑，其結果有利于宮頸癌的早期診斷、控制發展及預后監測。

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（收稿日期：2016-08-18） （本文編輯：張爽）endprint