免疫磁微球在腫瘤細胞中的提取應用

滕娟+路玉英

【摘要】 目的：免疫磁微球是現代新穎的收集體液瘤細胞方法，用以發現受檢患者體液中有無脫落腫瘤細胞。方法：分析比較免疫磁微球法與常規沉淀離心法收集腫瘤細胞。收集85例腫瘤患者和53例非腫瘤患者的體液，在同等體積的體液中，用免疫磁微球懸液與138例患者體液沉渣（尿液、腹水、腹腔積液、胸腔積液、乳頭溢液）相混合，將收集到的可疑細胞進行常規鏡檢；并將138例患者體液沉渣進行沉淀離心鏡檢，比較兩種鏡檢結果。結果：非腫瘤患者免疫磁微球檢測方法陽性率為1.9%（1/53），沉淀離心檢測方法陽性率為0（0/53）。肝癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為91.6%（11/12），沉淀離心檢測方法陽性率為33.3%（4/12）；結腸癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為88.9%（24/27），沉淀離心檢測方法陽性率為37.0%（10/27）；肺癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為80.0%（12/15），沉淀離心檢測方法陽性率為40.0%（6/15）；乳腺癌患者免疫磁微球檢測方法陽性率為90.3%（28/31），沉淀離心檢測方法陽性率為45.2%（14/31）。在非腫瘤患者和腫瘤患者中，免疫磁微球檢測方法的腫瘤陽性檢出率均高于常規沉淀離心檢測方法（P<0.05）。結論：免疫磁微球檢測方法輕易排除了混雜在體液沉渣中的正常細胞、破碎細胞和非細胞成分，排除干擾鏡檢的諸多因素，加大了篩選濃聚陽性細胞的力度，提高檢測的陽性率，對腫瘤診斷有很大的效用，為臨床腫瘤細胞學病理確診提供更有效、便捷的方法。

【關鍵詞】 免疫磁微球； 惡性腫瘤； 體液中瘤細胞

【Abstract】 Objective：IMMS is a new method of collecting body fluid tumor cells，and it is used to find out whether there is no shedding of tumor cells in the body fluid of the patients.Method：The tumor cells were collected and compared with the conventional sedimentation centrifugation method.Body fluids were collected from 85 patients with tumor and 53 patients with non tumor，in the same volume of body fluids，immune magnetic microsphere suspension and 138 patients with body fluids （urine sediment，ascites，peritoneal effusion，pleural effusion，nipple discharge） mixture，the collected suspicious cells in conventional microscopy，and separated the microscopic examination of the 138 patients with body fluids sediment precipitation centrifugal，compared the two kinds of mirror inspection results.Result：The positive rate of immune magnetic microsphere detection method in non tumor patients was 1.9%（1/53），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 0（0/53）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with hepatocellular carcinoma was 91.6%（11/12），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 33.3%（4/12）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with colon cancer was 88.9%（24/27），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 37.0%（10/27）.The positive rate of the detection method of the immune magnetic microsphere in patients with lung cancer was 80.0%（12/15），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 40.0%（6/15）.The positive rate of immune magnetic microsphere detection in patients with breast cancer was 90.3%（28/31），the positive rate of precipitation centrifugation test method was 45.2%（14/31）.In patients with non tumor and tumor patients，the positive detection rate of the immune magnetic microsphere detection method were higher than those in precipitation centrifugation test method（P<0.05）.Conclusion：Immune magnetic microsphere detection method easily ruled out normal cells mixed in body fluids in the sediment，broken cells and non cellular components，excluding factors interference microscopy，increase the screening concentration of positive cells in efforts to improve the positive detection rate，has a great effect on tumor diagnosis，pathological diagnosis，clinical tumor cytology more effective and convenient method.endprint

【Key words】 IMMS； Malignant tumor； Body fluids tumor cells

First-authors address：Beijing Geriatric Hospital，Beijing 100029，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.038

磁性微球（Magnetic Microspheres，MMS）是近年來國內外研究的熱點領域[1]。因其具有諸多的優良特性，如粒徑小、具有超順磁性、表面可修飾等，而被廣泛應用于生物醫學方向。其中，被應用于免疫學中的磁性微球，又被稱為免疫磁性微球（Immunomagnetic Microspheres，IMMS）[2-4]，它是通過表面修飾賦予微球表面特殊的功能基，如-OH、-COOH、-CHO、-NH2、-SH等，這些功能基團可以與特異性免疫配基相結合[4]，使抗體或抗原固定于IMMS表面，利用抗原-抗體的高度特異性識別作用，形成“抗原（抗體）-抗體（抗原）-磁性微球”結構，從而應用于細胞分離、疾病診斷、食品和環境檢測等領域。當前MMS的制備方法，主要有生物來源法、共混包埋法、單體共聚法、活化溶脹法、界面沉積法、化學轉化法及共沉淀法等[3]。

當體內出現惡性腫瘤后，經常有瘤細胞從腫瘤組織表面脫離、播散，侵入到血液、淋巴液中，或進入體（胸、腹、心包）腔、空腔臟器、外分泌管道中。這些脫落細胞在遠隔部位可能形成轉移灶，臨床上如果檢測到腫瘤脫落細胞，將提供至關重要的病理診斷依據[5-6]。因此，根據病情采集患者胸水、腹水、胃液、尿液、胰液、膽汁、唾液、痰液、乳頭溢液、關節腔液、腦脊液等，搜尋體液中的腫瘤細胞，已成為臨床診斷不可或缺的手段[7]。目前，為了收集患者體液中脫落瘤細胞，在采集待檢體液后，通常經過自行沉淀和/或離心等步驟，吸取體液沉渣再進行顯微鏡檢。少數大醫院也采用流式細胞儀等手段分析體液，發現腫瘤細胞或腫瘤標志物等，當然，最終還需用顯微鏡進行病理細胞形態學判斷。由于體液沉渣中?；祀s多量正常細胞、破碎細胞和非細胞成分，不僅加大鏡檢工作量，而且降低了檢出陽性率。為此，引用免疫磁微球材料，在顯微鏡檢前，首先對體液沉渣進行陽性篩選。

免疫磁微球以聚苯乙烯為基質，表面包被選定的單克隆抗體，制成免疫磁微球懸液備用。腫瘤細胞免疫學研究資料表明：不同類型的惡性腫瘤細胞膜表面存在各自相對特異的抗原決定簇，有別于正常細胞，如CA125、CA153、CEA、AFP、PSA、Cyfra21-1、Ferritin等蛋白質類的膜抗原物質，就是識別瘤細胞的標志物。針對不同抗原可以制備出相應的靶向單克隆抗體，包被在微球表面，形成免疫磁微球。如將選定的免疫磁微球懸液與體液沉渣混合、保溫，微球表面單克隆抗體則自動導向識別惡性腫瘤細胞膜對應的抗原決定簇，并與之結合，最終形成免疫磁微球—腫瘤細胞復合體[8-9]。隨后借助磁力將復合體吸出，達到陽性篩選瘤細胞目的[10]。如此，輕易排除了混雜在體液沉渣中的正常細胞、破碎細胞和非細胞成分，排除干擾鏡檢的諸多因素。理論上講，附著在腫瘤細胞上的免疫磁微球數量越多，吸附瘤細胞的磁性引力越大。為此，一方面要探求兩者數量最佳比值，依據經驗，加入微球量：估計細胞數=1∶10為妥；另一方面與各自體積有關。由于腫瘤細胞具有高度異質性，表面抗原密度不均，體積大小不等，直徑多在15 μm左右，如果微球粒度保持在1～5 μm，可促使數個微球同時牽拉一個瘤細胞，提高篩選的陽性率。

1 材料與方法

1.1 材料 隨機抽取2014年協和醫院體檢中心體檢者（年齡≥18歲的男性或女性）53例，取尿液53份，體檢者年齡42～70歲。同期協和醫院傳染科、消化科、內科和外科住院且臨床已經確診的腫瘤患者85例，其中肝癌患者腹水12例，年齡38～65歲；結腸癌患者腹腔積液27例，年齡44～71歲；肺癌患者胸腔積液15例，年齡26～57歲；乳腺癌患者乳頭溢液31例，年齡38～59歲；患者均為經病理組織學鏡檢證實的確診病例。

1.2 方法 將收集到體液，經自行沉淀和/或離心等步驟，取得體液沉渣并置入提供的專用試管中。選定一種或數種與腫瘤相關的單克隆抗體，制備相應的免疫磁微球懸液。（1）初步鏡檢估算體液沉渣中細胞總量=腫瘤細胞+非瘤細胞。（2）加入適量免疫磁微球懸液到體液沉渣中，相互混勻，在室溫下保溫，輕微震蕩2 h左右。（3）反應終止后，在混合懸液中插入專用細胞提取棒，放置5 min，以充分吸附免疫磁微球—腫瘤細胞復合體。專用細胞提取棒由強磁體棒心和塑料套管兩部分組成。（4）將細胞提取棒從混合懸液里移至緩沖液中。一旦抽出強磁體棒心后，磁力消失，附著在塑料套管外的免疫磁微球—腫瘤細胞復合體會自動脫離塑料套管外表面，輕輕晃動落入緩沖液中。（5）離心后，收集到的可疑細胞進行常規病理細胞學檢測。見圖1、2。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在同等體積的體液中，免疫磁微球檢測方法的腫瘤陽性檢出率均高于常規沉淀離心檢測方法，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

3 討論

當前，我國每年癌癥發患者數約200萬，全國每年死于癌癥的人數己超過140萬[11-13]，腫瘤的早期診斷是患者獲得長期生存的最主要途徑[14-16]，但目前腫瘤診治主要以中晚期為主，如計算機斷層掃描、超聲診斷、乳房攝影等檢測的最小極限為l cm（109細胞）直徑的腫瘤[17-18]。并且缺點較多，靈敏度差，特異性差，操作復雜，給患者帶來不便。

從表1可以看出，在同等體積的體液中，與常規沉淀+離心方法比較，常規沉淀+離心方法由于體液沉渣中?；祀s多量正常細胞、破碎細胞和非細胞成分，既加大了鏡檢工作量，也要求鏡檢工作人員的經驗豐富，這些因素都可以導致腫瘤細胞陽性檢出率的下降。而免疫磁微球收集法在顯微鏡檢前，先對體液沉渣進行陽性篩選，就避免了這些不足，加大了篩選和濃聚陽性細胞的力度，明顯提高檢測的陽性率。endprint

免疫磁微球技術可用來分離人類各種細胞，如紅細胞、外周血嗜酸/堿性粒細胞、神經干細胞，造血細胞、T淋巴細胞、人類關節滑膜細胞、樹突狀細胞、內皮細胞及多種腫瘤細胞等[17，19-20]。免疫磁性分離方法不僅簡便快速，而且可以在接近細胞正常生活狀態的情況下進行，對細胞活性無顯著影響，在生理、病理、藥理、微生物等領域得到廣泛的應用[21-22]。

免疫磁性微球用于細胞的清除也有一些缺點，主要是在方法學、靶細胞種類、檢測方法的靈敏度等方面變異性較大，但仍不失為一種安全、簡便、有效的方法，為臨床腫瘤細胞學病理診斷提供更有效、便捷的方法。

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（收稿日期：2016-08-24） （本文編輯：張爽）endprint