重慶中國三峽博物館小環境空氣微生物種屬與數量的動態研究

唐 歡，范文奇，王 春，張麗龍

(1. 重慶中國三峽博物館，重慶 400015； 2． 重慶市疾病預防控制中心，重慶 400042)

重慶中國三峽博物館小環境空氣微生物種屬與數量的動態研究

唐 歡1，范文奇1，王 春1，張麗龍2

(1. 重慶中國三峽博物館，重慶 400015； 2． 重慶市疾病預防控制中心，重慶 400042)

為了發現文物展陳環境中潛在的微生物病害，為館藏文物的預防性保護提供科學依據，結合傳統的純培養技術和基于細菌16SrRNA基因的PCR-DGGE(PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis)技術，綜合分析博物館小環境中可培養細菌的種屬、數量及其時空動態變化特征。結果表明，博物館小環境內可培養的空氣微生物存在季節差異，在數量和多樣性上均表現為夏季顯著高于冬季，其主要優勢菌群包括Acinetobactersp.、Staphylococcussp.、Pseudomonassp.和Advenellasp.。此外，夏季空氣的特征菌屬為Acinetobactersp.和Micrococcussp.，冬季典型菌種為Bacillussp.。

博物館環境;預防性保護;PCR-DGGE;空氣微生物

0 引 言

博物館環境是指收藏與展示各類可移動文物的相對密閉空間的總體[1]，主要包括以囊匣、展柜為代表的微環境，以展廳、庫房為代表的小環境，整個博物館建筑空間為代表的大環境以及博物館外部環境[2]。除了溫濕度、光照、污染氣體等常見環境因素之外，微生物、昆蟲等生物因素亦是博物館環境研究的重要內容之一。隨著文物預防性保護理念的日益深入，監測文物展陳環境中的空氣微生物組成、控制博物館小微環境中的微生物污染已成為近年來文物預防性保護研究的一個新方向，比利時、法國、波蘭以及國內部分博物館均開展了博物館內空氣微生物的研究[3-6]。

以往對博物館展廳內空氣微生物開展的研究主要聚焦于特定時間點的微生物數量和種類，但空氣微生物是動態變化的，會隨著時間、季節和參觀人流量等因素的變化而發生改變，因此，對其進行連續動態的監測才能更好地發現其數量和種屬的演替規律，為潛在的文物微生物病害提供科學的預判依據。

變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術自1993年被Muyzer引入微生物生態學研究以來，現已被廣泛地應用于環境微生物群落的多樣性和動態性分析。該技術不僅可以研究微生物結構的時間空間變化特征，還可以通過對凝膠上的特定條帶進行回收并測序，進而鑒定條帶對應的菌落種屬[7]。本研究通過傳統的菌落培養檢測博物館小環境中的空氣微生物數量，結合PCR-DGGE技術研究菌落的結構和組成，對博物館小環境中冬季和夏季的空氣微生物數量與種類進行了時空動態分析。

1 材料與方法

1.1 主要設備及試劑

空氣浮游菌采樣器型號為ZR2050型(青島眾瑞)；手持式溫度/相對濕度采集器型號為U12-011型(HOBO)；細菌培養用生化培養箱為SPX-250B型(上海躍進)；PCR儀為C1000型(Bio-Rad)；核酸定量儀為Nano Drop 2000型(Thermo)；凝膠成像系統為Gel Doc XR+(Bio-Rad)；變性梯度凝膠電泳儀為DCodeTMUniversal Mutation Detection System(Bio-Rad)。細菌總數檢測用營養瓊脂平板購自重慶龐通醫療器械有限公司，細菌總菌DNA提取試劑盒為QIAGEN(51604, QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)；EXTaq DNA聚合酶購自TaKaRa。

1.2 空氣微生物采樣、培養及計數

采樣展廳為位于博物館一樓的壯麗三峽展廳，該展廳是博物館參觀人流量最大的展廳。本研究在該展廳設置了4個采樣點，分別編號為ZL1、ZL2、ZL3、ZL4，采樣點在展廳中的位置如圖1所示。整個展廳做了大量隔斷，布局較為復雜。ZL1采樣點靠近展廳入口處，該處為開放式陳列，空間寬敞，存放動物標本等有機質藏品；ZL2采樣點位于展廳最內側，展示刺繡等有機質文物，同時是該展廳全年平均濕度最大的檢測位點；ZL3號采樣點位于展廳內側，展示有紡織品、皮革制品等文物； ZL4號采樣點位于展廳出口附近，展示竹木制品、刺繡等民族文物。可見，四個采樣點處展覽的文物均以有機質文物為主，對于文物的微生物病害較為敏感。

圖1 采樣點位置布局圖

本研究于夏季(2013年6、7、8月)和冬季(2013年11、12月及2014年1月)對該展廳進行了空氣微生物樣品的采集。具體采樣時間分別為2013年6月24日，7月23日，8月22日，11月29日，12月25日及2014年1月15日。

采樣方法參照我國《室內空氣質量標準》(GB/T18883—2002)的相關要求進行。空氣浮游菌采樣器置于距地面1.2m高處進行空氣樣本采集，采樣流量參數設置為10 L/min，采樣時長設置為5min。采集后的培養皿放入生化培養箱中，37 ℃條件下倒置培養48 h后計數。計數完成后，營養瓊脂上的全部菌落經無菌去離子水充分沖洗后凍存，進行空氣微生物細菌總DNA提取。

1.3 空氣微生物總菌DNA的提取

細菌總菌DNA的提取按照QIAGEN試劑盒提供的protocol進行。 提取后的DNA經Nano Drop 2000測定樣品的濃度及純度，經瓊脂糖凝膠電泳(1%)檢測樣品的完整性。

1.4 PCR擴增[8]

細菌16SrRNA基因 V3區的擴增引物由Takara公司合成， 序列分別為V3-357f-GC (5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 V3-518r (5′-ATTACC GCGGCTGCTGG-3′)， PCR產物長度大小預計為217bp。PCR反應體系為25μL，其中模板DNA量為20ng，10×EXTaq buffer 2.5μL，dNTP用量為2.5μL，ExTaq酶0.25μL，引物357f-GC、518r各0.5μL，添加無菌雙蒸水至終體積25μL。PCR循環條件為94℃預變性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，30個循環；最后72℃延伸10min。

按照Thompson和Xiong等的方法[9,10]進行Reconditioning PCR，以此去除PCR引物二聚體對DGGE進行的影響。Reconditioning PCR的模板為第一次PCR的產物(用量為5μL)，終體系為25μL，循環次數減少至5個循環，其他條件均與第一次PCR的條件相同。

1.5 DGGE電泳及特殊條帶鑒定

按照DCode System的說明書，參照Muyzer[11]和Walter[12]等報道的DGGE條件和方法，對16SrRNA基因V3區序列擴增產物進行DGGE電泳。DGGE使用8%的聚丙烯酰胺，變性梯度為35%～65%，電泳緩沖液為1×TAE(pH=8.4)。220V條件下預電泳10min后，130V的固定電壓電泳4.5h。電泳結束后的聚丙烯酰胺凝膠進行EB染色，由凝膠成像系統捕捉圖像后，用Quantity One軟件(BioRad，Hercules，California，USA)進行條帶數量、位置、亮度等信息的統計分析，并通過軟件獲取的數據矩陣進行UPGMA相似性聚類分析。

用無菌刀片將凝膠上的特定條帶切割下來，使用1×EXTaq buffer 漂洗2次，將其搗碎，加入40μL×EXTaq buffer，4℃條件下浸泡過夜。以浸泡液作為模板，重新進行PCR擴增，引物序列為357f(5′-TACGGGAGGCAGCAG-3′)和518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，PCR條件同1.4[13]。PCR產物經二次DGGE跑膠后， 確認與原切割條帶位置一致的，經T-A克隆后進行測序[14,15]，返回序列在Genbank進行BLAST比對，網址為www.ncbi.nlm.nih.com。

1.6 數據分析

1.6.1 多樣性分析 通過DGGE圖譜進行的微生物群落多樣性分析包括：豐富度(richness，S)，即 圖譜上每條泳道內的條帶數；微生物區系的Shannon-Wiener 指數(H′)，計算方法為H′=-∑Pi lnPi，其中， Pi為第i條帶的吸光度與該泳道所有條帶吸光度總和的比值[16,17]。

圖2 展廳冬夏兩季的溫濕度和菌落總數檢測結果

表1是對于該展廳內四個不同的采樣點進行的數據分析。結果顯示，雖然博物館大環境受中央空調的調控，但四個采樣點夏季的溫度仍然極顯著高于冬季(p<0.01)，濕度在不同的采樣位置中未見明顯變化(p>0.05)。在檢測數據中，最高溫度25.5℃，最低溫度14.1℃，最大濕度74%RH，均出現于ZL1采樣點；濕度最低為50%RH，出現于ZL4采樣點。1號及4號采樣點分別接近展廳的入口與出口，溫濕度變化可能更易受博物館大環境和參觀人流的影響，因此波動較大。此外，所有采樣點的濕度幾乎均在60%RH以上，這與重慶市本身年均濕度超過70%有關。

空氣微生物總數最高檢出點為ZL3號采樣點，其次為ZL2采樣點。這兩個采樣點均位于展廳中部，展廳蜿蜒的設計使其空氣流動性較差，因此容易滋生微生物。此外，這兩個采樣點的菌落總數也表現出了季節性差異(p<0.01)，即在這兩個地點，夏季空氣中的微生物總量極顯著地高于冬季。

表1 4個采樣點冬夏兩季的溫濕度和菌落總數檢測結果

注：**，與夏季數據相比，p<0.01

2 冬夏兩季博物館小環境空氣微生物多樣性的比較

首先，從圖3 ①的微生物純培養結果可直觀看出，夏季(6～8月)2號采樣點的采樣平板上菌落密布，數量明顯多于冬季三個月(11～1月)的采樣平板。如果對如此之多的菌落分別單獨進行種屬鑒定，不僅工作量龐大，而且可能存在大量相同結果。因此，使用DGGE的方法對細菌種類進行分析就顯得尤為方便高效了。

圖3 利用PCR-DGGE對采集的空氣微生物樣品進行種屬鑒定的過程

利用PCR-DGGE技術對采集的空氣微生物樣品種屬進行鑒定的過程如圖3所示：將不同平板上的所有細菌菌落混合沖洗下來作為獨立的總DNA進行提取，接下來對這個總DNA樣本進行PCR擴增并進一步實施變性梯度電泳后，一個平板上所有細菌的信息就轉化到圖3②中每一個單獨的泳道內。根據DGGE的原理，泳道內的每一個條帶理論上分別對應了一種細菌，而不同泳道間同一水平位置的條帶代表相同種類的細菌[11,18,19]。條帶越粗越亮，則代表該樣品中，這個條帶對應的某種細菌數量越多。為了了解不同條帶究竟是哪一種細菌，需要對目的條帶進行切膠回收以收集其DNA，通過二次PCR后，進一步測序比對而明確細菌種屬[20-22]。

首先， 從本實驗獲得的DGGE圖譜(圖4)上可以明顯看到，在四個采樣點夏季與冬季的24個空氣微生物樣品中，大部分樣品泳道中具有共同的條帶C、D、E、H、J和K。經過對條帶回收并測序后發現，對應的微生物分別為Acinetobacterlwoffii(相似性99%)、Staphylococcushominis(相似性99%)、Advenellasp.(相似性100%)、Staphylococcussp.(相似性100%)、Pseudomonassp.(相似性100%)和Staphylococcuswarneri(相似性100%)。由此可見，在壯麗三峽展廳這個博物館小環境中，全年空氣微生物的主要群落為不動桿菌屬、葡萄球菌屬、銅綠假單胞菌和Advenella屬，其中又以葡萄球菌屬最為優勢。雖然C和D條帶分別對應的Acinetobacterlwoffii和Staphylococcushominis幾乎貫穿了24個泳道，既24個樣品中都有檢出，但從條帶的亮度可見，代表夏季月份的泳道1～3中，這兩個條帶的亮度基本都比代表冬季的4～6號泳道亮度高，從側面說明這兩種菌的數量在夏季比在冬季數量多。

圖4 四個采樣點冬夏季空氣微生物的PCR-DGGE譜圖

與上述條帶不同的是，A、B和I條帶較多的出現在夏季空氣微生物的樣品中，而在冬季樣品中很少出現。經過比對發現，它們分別為Acinetobacterbaumannii.(相似性99%)、Acinetobacterbaumannii. (相似性100%)和Micrococcussp. (相似性100%)；條帶F和G則在ZL1、2、3號采樣點的冬季樣品中出現，夏季樣品中條帶極其微弱或未檢出，它們經測序發現均為Bacillusthuringiensis.(相似性分別為99%和100%)。這些結果表明：在該展廳的空氣微生物組成中，除了擁有共同的優勢菌群之外，冬夏兩個季節各自具有不同的典型菌種：夏季的特征菌屬為不動桿菌屬和微球菌屬，而冬季芽孢桿菌屬更為活躍。特征條帶的測序結果見表2。

表2 DGGE條帶測序比對結果

此外，DGGE電泳圖中還可以直觀看出夏季樣品條帶的數量多于冬季樣品，說明夏季空氣微生物的種類要多于冬季。對24個泳道的條帶數量和亮度進行分析后發現，夏季樣品的微生物種類顯著高于冬季樣品(p<0.05)(圖5)，且夏季空氣微生物的多樣性指數極顯著地高于冬季(p<0.01)(圖6)。詳細對4個采樣點進行分析可以看出，豐富度和多樣性指數最高的采樣點為ZL2號位置，且與3號采樣點差異不顯著，該結果與微生物數量統計結果類似。同時，1、2、3號采樣點的微生物豐富度和多樣性指數在冬夏兩季均高于4號采樣點(p<0.01)(表3)。

圖5 冬夏兩季空氣微生物豐富度的比較

圖6 冬夏兩季空氣微生物多樣性指數的比較

ZL1夏季ZL1冬季ZL2夏季ZL2冬季ZL3夏季ZL3冬季ZL4夏季ZL4冬季豐富度21．00±2．6518．67±3．5121．33±4．1617．33±2．5321．67±3．7917．33±6．0315．67±3．06??13．00±2．65??多樣性指數2．66±0．112．43±0．172．80±0．142．51±0．072．74±0．182．53±0．462．53±0．21??2．22±0．08??

注：**，與夏季相比，p<0.01

從UPGMA聚類分析的結果可以看出(圖7)，每個采樣點的數據基本能夠較好地聚為一簇，表明各個采樣點在可培養空氣微生物的組成上分別具有較大的相似性。在3號采樣點，6、7、8三個夏季月份空氣微生物在組成上的相似程度為61%，說明整個夏季該采樣位置的空氣微生物種類較為穩定。4號采樣點在11、12及1月三個月中，空氣微生物的種類相似性達到70%，說明整個冬季該采樣點的空氣中，微生物種類未發生明顯波動。

圖7 DGGE圖譜UPGMA聚類分析結果

3 討 論

1) PCR-DGGE分析技術的優點。從技術上看，PCR-DGGE本身是建立在不依賴于培養的條件下，對微生物群落多樣性和群落變化動態開展檢測分析的技術，廣泛應用于醫學、環境、農業、林業及食品研究等領域[23-25]。在文博行業，2015年，Lech T等應用PCR-DGGE技術研究了波蘭國家檔案館及國內最大的博物館Krakow博物館庫房及展廳內空氣微生物菌群的組成[4]。除了對多樣性進行分析外，PCR-DGGE技術還可以直接鑒定微生物群落組成，研究者可對DGGE圖譜上感興趣的特定條帶切割回收并進行菌種鑒定。因此，在微生物的種屬分析方面DGGE具有直觀、快速的獨特優勢。利用其一個條帶對應一種微生物的特點，但國蓉等利用可培養的標準菌株制備成marker，對微生態藥品中的益生菌進行了PCR-DGGE的種屬分類[26]， Shanqimuge等結合純培養技術和PCR-DGGE技術對大曲的菌種進行直接快速的鑒定[27]。以本研究為例，若夏季樣品中培養菌落數大于200CFU，如果分別挑取單個克隆進行菌落PCR再進行測序比對，工作量非常巨大，效率明顯較低。本研究借鑒不依賴培養的微生物的研究方法，以一個混合樣作為一個整體，進行混合菌落的總DNA提取，再通過DGGE的條帶分割將混合信息直觀呈現于膠上，選取具有特征或研究意義的條帶進行切割、測序、比對，大大提高了工作效率，且更容易發現優勢菌群，如該小環境中冬夏兩季的樣品泳道中均出現了C、D、E、H、J和K條帶，則直觀說明這些條帶所對應的微生物菌落為貫穿整個小環境的冬夏兩季的優勢菌群。

2) 博物館環境內空氣微生物的主要種類。在組成上，對于博物館小環境中空氣微生物種類的研究中，武望婷等曾報道首都博物館內空氣微生物細菌組成以微球菌為主，還包括桿菌、芽孢桿菌、考克氏菌和假單胞菌[28]；Gaüzère等對于盧浮宮內的空氣微生物進行了連續6個月的監測，經過高通量測序顯示其空氣微生物的優勢菌屬分別為副球菌屬、不動桿菌屬、銅綠假單胞菌、棲水菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬等[5]。本研究通過對DGGE條帶的割膠測序發現，展廳內樣品可培養的空氣微生物主要優勢菌群為不動桿菌屬、銅綠假單胞菌、葡萄球菌屬及Advenellasp.，與Gaüzère等的研究基本相吻合。高通量測序雖然獲得了更豐富的多樣性數據，但對于微生物組成的季節性演替和組成特征卻不如DGGE圖譜直觀，如本研究的圖譜分析可見夏季空氣的特征菌屬為Acinetobactersp.和Micrococcussp.，冬季典型菌種為Bacillussp.。另外，關于類似博物館這一密閉空間中空氣真菌的研究，馬燕天等對于莫高窟洞窟空氣微生物的研究發現，在9月份窟外真菌數量檢出在24～32CFU/m3，在密閉的洞窟內，真菌數量比窟外更少[29]；本課題組也曾對臨時展廳中空氣微生物真菌進行計數，可培養的真菌數量較少，5～8月真菌平均數量低于15CFU/m3[30]。在本實驗中部分采樣位點甚至未檢出(數據未給出)，因此在本研究中并未對真菌進行數量統計和多樣性分析。

3) 影響空氣微生物穩定性的因素。在空氣微生物的穩定性上，Tringe等的研究結果給予的提示是，與戶外環境不同，影響密閉的室內環境中空氣微生物組成的主要原因可能是由于小環境空氣中的選擇性抗力，氧化損傷及干燥過程、鐵限制等均會影響微生物群落的構成，也可能與人流活動有關[31]。而本實驗DGGE圖譜UPGMA聚類分析結果顯示，ZL3采樣點冬季空氣微生物的種類相似程度最高達到73%，ZL1和ZL2號采樣點的夏季空氣微生物組成相似性最高甚至達到83%。類似的研究結果還見于馬燕天等對莫高窟窟內環境微生物的調查[29]。其結果顯示，游客人數只對窟外環境有影響，而對封閉的洞窟內的微生物無影響。可見，在參觀人員不斷發生改變的情況下，微生物組成并未發生較大變化。因此，影響博物館內空氣微生物多樣性的主要原因還是小環境本身，季節的變化和參觀者的擾動，對于封閉環境的穩態影響不大。

綜合展廳這一博物館小環境的空氣微生物數量及種類分析結果，濕度的穩定對于微生物組成可能具有一定影響，而溫度則可能影響其數量，因此對于小環境內的溫濕度控制仍然是控制室內微生物的重要措施[32]。此外，博物館中央空調系統的濕潤器、濾網等組件上往往是微生物積存和繁殖的場所，可通過管網向通風下游散播，因此也不能忽視博物館小環境中的空調送風系統對空氣微生物的影響，需定期進行空調系統的維護。

4 結 論

1) 在博物館小環境微生物數量上，在全年濕度較為穩定，而夏季溫度極其顯著高于冬季的條件下，該展廳內空氣微生物菌落總數在夏季顯著高于冬季。

2) 在微生物組成上，該展廳冬夏兩個季節的可培養空氣微生物組成穩定性高于39%，且夏季樣品中的微生物種類顯著高于冬季樣品。不動桿菌屬、葡萄球菌屬、銅綠假單胞菌和Advenella屬的微生物在冬夏兩季都是整個展廳空氣內的優勢菌群，在展廳的4個采樣點均可采集到。此外，夏季空氣的特征菌屬為不動桿菌屬和微球菌屬，冬季典型菌種為芽孢桿菌屬。

3) 保持展廳內環境的穩態有助于保持微生物組成的穩定，恒溫恒濕、加強展廳空調送風系統的微生物控制工作對控制博物館小環境的微生物污染具有重要作用。

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(責任編輯 潘小倫)

A dynamic study on the species and quantity of microorganisms in the micro-environment, Chongqing China Three Gorges Museum

TANG Huan1, FAN Wen-qi1, WANG Chun1， ZHANG Li-long2

(1.ChongqingChinaThreeGorgesMuseum,Chongqing400015,China; 2.Chongqingcenterfordiseasecontrolandprevention,Chongqing400042,China)

In this study, both traditional colony counting and PCR-DGGE (PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis) technology were used to analyze the quantity and species characteristics of microorganisms in the micro-environment, Chongqing China Three Gorges Museum. The results showed that the species and quantity of cultivable microorganism in the air of the museum micro-environment was significantly higher in summer than in winter. Species ofAcinetobacter,Staphylococcus、PseudomonasandAdvenellawere found to predominate. In addition,Acinetobactersp. andMicrococcussp. were dominant in summer whileBacillussp. predominated in winter. The results were helpful in terms of evaluating potential microbial pollution and to providing scientific evidence for preventive protection of exhibited or collected cultural relics in museums.

Museum environment; Preventive conservation; PCR-DGGE; Air microorganisms

2016-01-19；

2016-07-11

重慶中國三峽博物館項目資助(3GM2013-KTZ03)

唐 歡(1979—)，女，2001年畢業于西南師范大學生物教育專業，副研究館員，研究方向為文物微生物病害防治，E-mail： tanghuan3gm@163.com

張麗龍，E-mail： tmmulong@sina.com

1005-1538(2017)01-0035-09

K879.2

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