小麥TILLING突變體檢測中基因組DNA提取方法的優化

徐 艷，徐繼法，陳 磊，趙吉強，FU Zeyu，JAMESON Paula E ，宋建成

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005; 2.School of Biological Sciences,University of Canterbury,Christchurch,New Zealand)

小麥TILLING突變體檢測中基因組DNA提取方法的優化

徐 艷1，徐繼法1，陳 磊1，趙吉強1，FU Zeyu2，JAMESON Paula E2，宋建成1

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005; 2.School of Biological Sciences,University of Canterbury,Christchurch,New Zealand)

為了優化小麥高通量TILLING突變體掃描所需基因組DNA提取的方法，對利用SDS法、改良SDS法、CTAB法、改良CTAB法、AxyPrep DNA提取試劑盒、Qiagen DNeasy Plant Mini Kit試劑盒以及再生Qiagen硅膠柱方法提取的小麥基因組DNA進行了系統比較。結果表明，盡管7種方法所提取DNA的純度及瓊脂糖凝膠電泳檢測結果均良好，但再生Qiagen硅膠柱方法、CTAB法和改良SDS法的DNA濃度顯著高于其他方法。根據小麥細胞分裂素氧化酶基因1( TaCKX1)的DNA序列設計引物，以新鮮DNA樣品用于PCR擴增大于1 000 bp的片段時，后4種方法擴增效果優于前3種方法；DNA在-20 ℃下保存100 d后重新進行PCR擴增時，則只有Qiagen試劑盒和再生Qiagen硅膠柱2種方法提取的DNA能擴增出大于1 000 bp的片段。采用本實驗室與新西蘭坎特伯雷大學合作建立的再生硅膠柱與自配提取液提取小麥基因組DNA，既保證了DNA的高質量，又降低了使用試劑盒的成本，為小麥TILLING庫的構建及其他相關試驗提供了一種經濟有效的DNA提取方法。

小麥；TILLING；基因組DNA；提取方法

小麥是世界各地廣泛種植的主要糧食作物之一。其全基因組大小高達17 000 Mb，約是人類基因組的5倍多，水稻基因組的36倍，而且80%的基因組序列為冗余重復序列[1]。同時，其異源六倍體的特性決定了性狀遺傳的復雜性，每個基因常含有三個拷貝。因此，利用轉基因技術進行小麥基因功能研究和農藝性狀的遺傳改良具有較大難度[2]。定向誘導基因組局部突變 (targeting induced local lesions IN genomes,TILLING)技術是20世紀90年代末期由美國Fred Hutchinson癌癥研究中心Steven Henikoff團隊和華盛頓大學Luca Comai團隊發展起來的一種反向遺傳學研究方法[3-7]。該技術結合了化學誘變、PCR技術和高通量定向篩選的方法，已被廣泛應用于遺傳學研究，是功能基因組研究中用于發現遺傳多樣性和大規模篩選基因突變的有效手段[4-5]。目前，該技術已成功地應用于小麥的基因組研究和育種實踐[8-11]。提取數千個突變體植株的高質量基因組DNA是TILLING技術中的基礎環節，由于突變群體DNA庫建成后需要長期保存，以便隨時滿足不同研究人員及不同研究項目對目的基因突變進行掃描檢測的需要。因此，所提取DNA的質量將直接影響后續PCR等步驟的結果乃至TILLING群體突變體篩選鑒定成敗[12-14]。

目前，常用的植物基因組DNA提取方法，如CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法、SDS(十二烷基磺酸鈉)法、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)法等，不僅提取效率和DNA的質量存在較大差異[15-21]，而且我們在進行小麥TIILING群體突變體篩選過程中發現，這些方法所提取的許多DNA樣品經一段時間保存后，PCR擴增效果發生明顯衰減，甚至經常導致擴增完全失敗，嚴重影響了TILLING突變體的掃描效果和效率。而采用國內外公認效果較好的Qiagen等試劑盒，盡管保證了所提取DNA的高質量，但往往因DNA得率較低和提取成本太高等缺陷，難以滿足TIILING突變體篩選對大量DNA樣品的需要。本研究對采用CTAB法及其改良法、SDS法及其改良法、兩種DNA提取試劑盒以及新建立的提取方法所提取的小麥葉片基因組DNA進行系統比較，旨在獲得快速、簡便、低成本提取小麥基因組DNA的方法，為TILLING技術應用過程中大量DNA樣品的提取提供可靠保障。

1 材料與方法

1.1 植物材料

DNA提取材料為實驗室水培至展開葉長10 cm左右的野生型濟麥22幼苗，選取新鮮葉片剪成1 cm后混勻。

1.2 試驗試劑

Qiagen DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。AxyPrep基因組DNA小量試劑盒購自康寧生命科學有限公司。其他試驗用試劑均為分析純。1×TE buffer、Binding buffer、Washing buffer Ⅰ、Washing buffer Ⅱ和Elution buffer的配制參照Fu等[22]的方法。

1.3 基因組DNA的提取方法

本研究共采用了7種基因組DNA提取方法，每種方法重復3次。

1.3.1 SDS法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL SDS提取液，混勻，室溫靜置10 min；65 ℃水浴30 min，間或混勻；冰浴5 min，加入20 μL 2% β-巰基乙醇，混勻后靜置5 min，室溫12 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于新的1.5 mL離心管中，加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻后靜置5 min，室溫12 000 r·min-1下離心5 min；取400 μL上清于新的1.5 mL離心管(如果雜質含量仍然很高，可以重復該步1～2次)，加入等體積-20 ℃預冷的異丙醇，混勻，于-20 ℃冰箱，靜置30 min；4 ℃ 12 000 r·min-1下離心10 min，棄上清，用70%乙醇洗沉淀2次，涼風吹干或37 ℃烘干；加入50 μL的1×TE buffer溶解沉淀。

1.3.2 改良SDS法

對上述SDS法進行兩方面的改進：(1)提取緩沖液中加入2% PVP和20 μL 2% β-巰基乙醇。(2)水浴后加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻靜置，離心；取450 μL上清于新的1.5 mL離心管中，加入等體積-20 ℃預冷的異丙醇，混勻。后面步驟同1.3.1。

1.3.3 CTAB法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL 60 ℃預熱的CTAB緩沖液和10 μL β-巰基乙醇，混勻；于60 ℃水浴30 min，間或混勻；冰浴15 min，加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻后冰浴15 min，間或混勻，室溫10 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于另一1.5 mL離心管，加入等體積-20 ℃預冷的異丙醇，混勻；-20 ℃靜置30 min，4 ℃ 10 000 r·min-1下離心10 min；棄上清，用70%乙醇洗沉淀2次，涼風吹干或37 ℃烘干；用50 μL的1×TE buffer溶解沉淀。

1.3.4 改良CTAB法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL 65 ℃預熱的CTAB緩沖液和10 μL β-巰基乙醇，混勻；于65 ℃水浴1 h，間或混勻；加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，不?；靹?0 min，室溫10 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于另一2.0 mL離心管，加入1 500 μL(至少是上清液2倍)的-20 ℃預冷的異丙醇，混勻；于-20 ℃靜置1 h，4 ℃ 10 000 r·min-1下離心5 min；棄上清，加入500 μL的1×TE buffer于室溫溶解30 min；至白色沉淀完全溶解后，加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，輕輕混勻10～20 min，室溫10 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于新的2.0 mL離心管，加入1.5 mL -20 ℃預冷無水乙醇和60 μL醋酸鈉，混勻，于-20 ℃過夜(至少2 h)；4 ℃ 12 000 r·min-1下離心5 min，棄上清，用70%乙醇洗沉淀2次，涼風吹干或37 ℃烘干；加入50 μL的1×TE buffer溶解沉淀。

1.3.5 AxyPrep DNA提取試劑盒法

DNA的提取嚴格按照試劑盒的操作說明進行。

1.3.6 Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒法

DNA的提取嚴格按照試劑盒的操作說明進行。

1.3.7 再生Qiagen硅膠柱提取法

取新鮮小麥葉片，在液氮中研磨成粉末，稱取0.05 g于1.5 mL離心管中；加入500 μL 85 ℃預熱的CTAB緩沖液，混勻后于85 ℃水浴10 min，間或混勻；加入500 μL氯仿-異戊醇(24∶1)，混勻，室溫12 000 r·min-1下離心5 min；取450 μL上清于新的1.5 mL離心管，加入750 μL Binding buffer，混勻；每次移取700 μL混合液于經1～10次再生的Qiagen硅膠柱(再生方法：將已使用過的硅膠柱于1 mol·L-1HCl浸泡12 h后，轉移至0.1 mol·L-1HCl浸泡2～3 d，最后用無菌水離心過濾清洗3遍)，12 000 r·min-1下離心1 min，棄濾液；加入700 μL Washing buffer Ⅰ，12 000 r·min-1下離心1 min，重復一次；加入800 μL Washing buffer Ⅱ，12 000 r·min-1下離心1 min，棄濾液，12 000 r·min-1離心2 min；將硅膠柱置于新的1.5 mL離心管，加入50 μL 65 ℃預熱的Elution buffer，靜置1 min，12 000 r·min-1離心1 min，可重復一次。

1.4 DNA的質量檢測

1.4.1 微量分光光度計檢測

采用微量分光光度計(NanoVue)測定以上所提取DNA的A260/A280、A260/A230和濃度值。

1.4.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測

取DNA溶液1 μL，用1.0%瓊脂糖凝膠在130 V的電壓下電泳20 min，由溴化乙錠染色，用Gel Doc XR+全自動凝膠成像系統(Bio-RAD公司)拍照檢測DNA質量。

1.4.3 PCR擴增檢測

細胞分裂素氧化酶對小麥的生長發育和產量有重要影響，本實驗室目前正以細胞分裂素氧化酶基因1 ( TaCKX1)為目的基因對TILLING群體進行突變體篩選，在篩選過程中發現常規方法提取的DNA用于擴增大于1 000 bp的片段時常無法擴增出目的條帶。因此，本試驗以擴增 TaCKX1基因來檢測DNA的質量。根據 TaCKX1基因的DNA序列，采用primer 5.0設計引物(表1)。PCR反應體系為10 μL，含10×PCR buffer 1 μL、25 mmol·L-1MgCl20.7 μL、100 ng·μL-1的DNA模板0.4 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各0.4 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.1 μL、TaqDNA聚合酶0.2 μL、ddH2O 6.8 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增完成后，取等量的PCR產物，用1.0%瓊脂糖凝膠在130 V電壓下電泳15～20 min，根據條帶大小和清晰度比較PCR產物的質量。

2 結果與分析

2.1 不同方法所提取DNA的微量分光光度計檢測結果

表2為7種方法提取的DNA的純度和濃度。由表2可見，采用不同方法提取小麥基因組DNA，A260/A280比值都在1.8～2.0之間，A260/A230比值都接近2.0，說明所提取的DNA純度都很好；而再生Qiagen硅膠柱法、CTAB法和改良SDS法的DNA濃度都顯著高于其他方法。其中再生Qiagen硅膠柱法提取的濃度最高，比濃度位居第二的CTAB法提高50.2%，比Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒法提高234.4%。

表1 用于擴增 TaCKX1基因的引物Table 1 Primers of TaCKX1 gene

表2 不同方法所提取DNA的純度和濃度Table 2 Purity and concentration of DNA extracted using different methods

用SPSS 17對各濃度進行差異顯著性分析，各濃度后不同小寫字母表示差異在0.01水平上顯著。

Significance analysis of concentrations was conducted using SPSS 17; The lowercases following the concentrations indicated the significant differences at 0.01 levels.

2.2 不同方法所提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

對DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1，且多次電泳均得到相似結果。由圖1可知，7種方法所提取的DNA完整性均較好，無RNA和其他雜質污染。在上樣量都為1 μL的情況下，SDS法和Qiagen硅膠柱法所提取DNA條帶亮度較其他方法的低，說明DNA濃度較低；改良SDS法、CTAB法和AxyPrep試劑盒法所提取的DNA主帶下方有拖帶現象，說明DNA有部分降解；改良CTAB法、Qiagen試劑盒法和再生Qiagen硅膠柱法提取的DNA條明亮，無拖帶現象，DNA質量較好。

2.3 新鮮DNA的PCR擴增檢測結果

將三個上游引物和兩個下游引物進行兩兩組合，可擴增出6種大小不同的PCR產物，F10/R16為1 078 bp，F10/R17為1 150 bp，F11/R16為970 bp，F11/R17為1 042 bp，F13/R16為659 bp，F13/R17為731 bp。以7種方法提取的DNA為模板進行PCR擴增，進行3次重復試驗，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果均如圖2所示。其中SDS法、改良SDS法和CTAB法只能擴增出較小的片段，對于大于1 000 bp的片段擴增困難；改良CTAB法、AxyPrep試劑盒法、Qiagen試劑盒法和再生Qiagen硅膠柱法能夠擴增出較大片段。

M：DL2000；1：SDS法；2：改良SDS法；3：CTAB法；4：改良CTAB法；5：AxyPrep DNA試劑盒法；6：Qiagen DNA試劑盒法；7：再生Qiagen硅膠柱法。圖2和圖3中同。

M: DL2000; 1: SDS method; 2: Modified SDS method; 3: CTAB method; 4: Modified CTAB method; 5:AxyPrep DNA column method; 6:Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method; 7: Regenerated Qiagen column method.The same in Fig.2 and Fig.3.

圖1 7種方法所提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果

Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of DNA extracted by seven methods

圖2 以不同方法所提取DNA為模板的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.4 于-20 ℃存放100 d后DNA的PCR擴增檢測結果

TILLING技術中所提取的DNA需要長期存放，以便隨時對目的基因進行掃描篩選，但長期存放會影響DNA的質量，進而影響后續的PCR結果和突變體鑒定的效率。圖3為DNA于-20 ℃存放100 d后再進行檢測的結果，多次電泳得到相似結果。由圖可見，DNA存放一段時間后都有輕微降解，其中改良CTAB法降解最嚴重，其他方法提取的DNA主帶仍清晰明亮。為進一步鑒定本研究所提取DNA的質量，將能夠較好擴增出大片段的4種DNA于-20 ℃存放100 d后再進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4。由圖4可見，存放100 d后，對于兩對擴增小片段引物，4種方法所提取的DNA都有較好的擴增效果；而對于四對擴增大片段引物，則只有Qiagen法和再生Qiagen硅膠柱法能擴增出清晰明亮的條帶，改良CTAB法和AxyPrep法擴增結果不佳。

圖3 7種方法所提取DNA經-20 ℃存放100 d后的瓊脂糖凝膠電泳結果

M：DL2000；1：改良CTAB法；2：AxyPrep試劑盒法；3：Qiagen試劑盒法；4：再生Qiagen硅膠柱法。

M: DL2000; 1: Modified CTAB method; 2:AxyPrep DNA column method; 3:Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method; 4: Regenerated Qiagen column method.

圖4 -20 ℃存放100 d后的DNA經PCR擴增后所得產物的瓊脂糖凝膠電泳結果

Fig.4 Agarose gel electrophoresis result of PCR products with DNA template stored in -20 ℃ for 100 days

3 討 論

高質量的DNA是TILLING技術成功應用的基礎。由于小麥基因組龐大，遺傳基礎復雜，且植株中含有較多的多酚、蛋白質、脂類等干擾物質，常規方法提取出的DNA往往不能滿足PCR的要求。尤其是由于用于TILLING突變體鑒定的DNA往往需要進行長達數年甚至更長時間的保存，對DNA的質量要求非常高。盡管國內外研究者對DNA提取中的雜質去除進行了很多研究[23-26]，但在本研究條件下效果均不夠理想。本文比較了7種不同的DNA提取方法，其中SDS法、改良SDS法和CTAB法簡單快速，但所得DNA常無法擴增出大于1 000 bp的產物，此結果與本實驗室利用TILLING群體對多個目標基因突變體篩選試驗過程中所遇到的情況是一致的。改良CTAB法和AxyPrep試劑盒法所得DNA能夠較好的擴增出產物，但長期儲存后擴增效果差，并且改良CTAB法耗時過長，所用試劑多，不適合TILLING技術進行大規?；蚪MDNA樣品的提取。Qiagen試劑盒法和再生Qiagen硅膠柱法所提取的DNA質量高，儲存一段時間后能擴增出清晰明亮的條帶，可滿足TILLING技術對DNA質量的要求。然而，Qiagen試劑盒的費用較高，不適合科研經費不足的研究者或需要大批量提取DNA樣品的TILLING技術。而采用本實驗室與新西蘭坎特伯雷大學Jameson教授實驗室合作建立的再生硅膠柱法，通過HCl浸泡及無菌水洗滌等簡單程序對使用過的硅膠柱進行回收再生，可使Qiagen試劑盒硅膠柱重復利用10次以上[22]，可以大幅度降低成本。而且所提取的小麥基因組DNA具有得率高、質量好、PCR擴增成功率高等優點，能很好地滿足TILLING技術中大量提取DNA樣品的需求。

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Optimization of Genomic DNA Extraction Methods for Mutant Screen in a Wheat TILLING Population

U Yan1,XU Jifa1,CHEN Lei1,ZHAO Jiqiang1,FU Zeyu2,JAMESON Paula E2,SONG Jiancheng1

(1.School of Life Sciences,Yantai University,Yantai,Shandong 264005,China; 2.School of Biological Sciences,University of Canterbury,Christchurch,New Zealand)

In order to optimize the genomic DNA extraction methods for efficient mutant screening in wheat TILLING population,seven different DNA extraction methods,such as SDS method,modified SDS method,CTAB method,modified CTAB method,AxyPrep DNA column method,Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method and regenerated Qiagen column method,were compared for their effectiveness on genomic DNA extraction.The results showed that the DNA concentration varied among different extraction methods,and the DNA concentration of regenerated Qiagen column method,CTAB method,and modified SDS method were higher than that of the other method.The quality of DNA extracted by all the seven methods in terms of purity and integrity were satisfied when detected with agarose gel electrophoresis.However,when these DNA samples were used as PCR template to amplify products more than 1 000 bp in length,the amplification efficiency of the modified CTAB method,AxyPrep DNA column method,Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method and regenerated Qiagen column method was much better than that of the other three methods.After storing the DNA samples in -20 ℃ for 100 days,the target gene sequences longer than 1 000 bp could only be amplified from the DNA samples extracted using Qiagen DNeasy Plant Mini Kit method and regenerated Qiagen column method.The newly developed method combining the regenerated Qiagen column with home-made solutions allowed us to extract high quality genomic DNA from a wheat TILLING population,with much higher DNA concentration and lower cost than the Qiagen DNeasy Plant Mini Kit.This will provide an efficient and economical genomic DNA extraction method for TILLING procedure in wheat.

Wheat; TILLING; Genome DNA; Extraction methods

時間：2017-01-16

2016-10-05

2016-12-24

國家自然科學基金項目(31371616)

E-mail：xuyan540769161@163.com

宋建成(E-mail:Jcsong88@yahoo.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)02-0185-07

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170116.1833.010.html