小麥抗葉銹病中間材料的 Lr24、Lr38分子標(biāo)記輔助選擇

王 志，安 哲，范學(xué)鋒，張徐明，張立榮，張英姿，楊文香，劉大群

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心， 河北保定 071001；2.河北省沙河市農(nóng)業(yè)局，河北沙河 054100)

小麥抗葉銹病中間材料的 Lr24、Lr38分子標(biāo)記輔助選擇

王 志1，安 哲1，范學(xué)鋒1，張徐明2，張立榮1，張英姿1，楊文香1，劉大群1

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心， 河北保定 071001；2.河北省沙河市農(nóng)業(yè)局，河北沙河 054100)

為加速小麥抗葉銹優(yōu)質(zhì)品種的培育，利用 Lr24、 Lr38的分子標(biāo)記對優(yōu)質(zhì)品種豫麥34、中優(yōu)9507和高抗葉銹品系1R17的雜交F3:4代的優(yōu)質(zhì)材料進(jìn)行了目的基因的鑒定。結(jié)果從150份雜交后代F3：4中篩選出了70份聚合 Lr24和 Lr38的高抗優(yōu)質(zhì)材料，其余80份材料表型為抗葉銹病，但不含 Lr24和 Lr38或僅含二者之一。本研究避免了小麥抗葉銹病育種的盲目性，提高了抗葉銹基因選擇的準(zhǔn)確度。

小麥葉銹病； Lr24和 Lr38；基因聚合；分子標(biāo)記輔助育種

由專性寄生真菌Pucciniatriticina引起的小麥葉銹病是影響我國小麥產(chǎn)量的重要病害之一[1]。抗病小麥品種的應(yīng)用是防治該病害最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的措施。由于定向選擇壓力增大，造成小麥葉銹菌生理小種變異加快，加速了抗病品種抗性的喪失。聚合多個(gè)抗病基因是增加品種抗病譜、延長品種使用期的有效途徑。傳統(tǒng)育種依賴于抗性鑒定和個(gè)體表型的選擇，受環(huán)境條件、發(fā)育狀況和鑒定方法等因素影響較大，容易使抗性基因在選擇過程中丟失。對同一病原的不同抗性基因進(jìn)行選擇時(shí)，僅通過抗性表型很難判斷所選材料攜帶的抗病基因。分子標(biāo)記輔助育種是利用與特定性狀緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記對DNA目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行直接篩選的育種方法，具有快速、準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點(diǎn)，可以及早、準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)含目的基因的材料，提高育種效率[2]。董 娜等[3]利用與抗白粉病基因 Pm21和 Pm13共分離或緊密連鎖的分子標(biāo)記，對分別含 Pm21和 Pm13的小麥品系雜交F2代進(jìn)行檢測，獲得 Pm21+ Pm13聚合單株。

目前，已發(fā)現(xiàn)100余個(gè)小麥抗葉銹病基因，已正式命名到 Lr73[4]，其中有60余個(gè)已定位在小麥特定的染色體上[5]。 Lr24抗葉銹病基因來源于長穗偃麥草[6]，攜帶此基因的小麥全生育期抗葉銹病。 Lr38來源于中間偃麥草[7]，攜帶此基因的小麥全生育期抗葉銹病，我國尚未發(fā)現(xiàn)對 Lr38有毒性的菌株。

Lr24和 Lr38的RFLP、RAPD和AFLP標(biāo)記已經(jīng)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定簡便的STS和SCAR標(biāo)記。Schachermayr[8]和Gupta等[9]開發(fā)了 Lr24的分子標(biāo)記，該標(biāo)記穩(wěn)定性強(qiáng)，與抗葉銹基因 Lr24共分離，其中，Gupta等[9]開發(fā)的分子標(biāo)記的使用范圍更廣。張 娜等[10]分別采用小麥3D染色體上已知的EST-SSR標(biāo)記和偃麥草E組染色體的一對SCAR標(biāo)記，開發(fā)并驗(yàn)證了 Lr24和 Lr38的共顯性引物。張翠茹[11]利用RAPD技術(shù)開發(fā)了 Lr38 的RAPD標(biāo)記。閆紅飛等[12]利用尤明山等[13]開發(fā)的偃麥草E組染色體的一對SCAR標(biāo)記，建立了與 Lr38緊密連鎖的分子標(biāo)記。胡亞亞等[14]利用21個(gè)與Lr基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記，確定了14個(gè)小麥品種(系)中所含的抗葉銹基因。姚宏鵬等[15]利用已知的抗葉銹病基因 Lr10、 Lr24、 Lr34和 Lr38的分子標(biāo)記，對生產(chǎn)上高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥品種和含有多個(gè)高抗葉銹病基因的抗病小麥F2:3代材料進(jìn)行目的基因的選擇，篩選出具有聚合抗性基因的中間材料共47份。

本試驗(yàn)以多個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的小麥品種與含有高抗葉銹病基因( Lr24, Lr38)的1R17雜交后代F3：4為材料，對其植株進(jìn)行 Lr24和 Lr38的分子檢測，旨在篩選出兼具優(yōu)良農(nóng)藝性狀和抗病基因 Lr24和 Lr38的后代，確保抗葉銹病育種目標(biāo)的準(zhǔn)確實(shí)施，加速育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交親本為5個(gè)優(yōu)質(zhì)栽培品種YM34、09P200、21924、21898、ZY9507及攜帶 Lr24和 Lr38基因的高抗品系1R17，雜交組合為1R17/YM34、1R17/ZY9507、1R17/09P200、1R17/21898、1R17/21924、ZY9507/1R17、ZY9507/1R17//1R17。接種用菌株為10種等量混合的強(qiáng)優(yōu)勢小麥葉銹菌，致病類型分別為FHRT、THTS、THQS、PHTP、THTT、FHGQ、FHQT、PHQT、THKT和FHHT。接種用菌株、感病品種鄭州5389、感病對照Thatcher和近等基因系TcLr24、TcLr38、雜交后代F3：4材料均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹病研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 F3：4雜交后代抗病性鑒定

將F3：4雜交后代材料種于行長1.5 m，行距20 cm的小區(qū)，小區(qū)之間播種感病品種鄭州5389。將10種強(qiáng)優(yōu)勢菌株等量混合放入水中并加入適量(0.1%)吐溫20攪拌至葉銹菌團(tuán)完全散開，于2015年4月18日傍晚用噴壺噴霧接種于鄭州5389后，用地膜覆蓋并黑暗保濕12～16 h。2015年5月18日和5月28日(鄭州5389發(fā)病嚴(yán)重度達(dá)100%)進(jìn)行測試材料的抗病性鑒定。按照Roelfs等[16]的小麥葉銹菌鑒定標(biāo)準(zhǔn)鑒定反應(yīng)型。

1.2.2 樣品選擇

根據(jù)抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇侵染型為“0”、“；”的單株進(jìn)行掛牌標(biāo)記并采集葉片，待小麥完全成熟后篩選株高合適、有一定抗倒伏能力、結(jié)實(shí)率高、穗形大、更接近于高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)親本的單株。5月18日第一次選擇，5月28日第二次印證選擇，以第二次鑒定的結(jié)果為依據(jù)。

1.2.3 葉片總DNA的提取與質(zhì)量檢測

使用CTAB法[17]提取供試材料葉片的DNA，利用分光光度計(jì)和0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.2.4 抗葉銹病基因聚合材料的分子檢測

用于檢測的分子標(biāo)記見表1，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10×buffer(含Mg2+)2 μL、dNTP 0.4 μL(10 mmol·L-1)、每條引物25 ng、模板DNA 50 ng、1 UTaq聚合酶。S1302-609標(biāo)記的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。Y38SCAR982標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1.5 min，68 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 Lr24與 Lr38的標(biāo)記信息Table 1 Informations of marker linked with Lr24 and Lr38

2 結(jié)果與分析

2.1 田間材料的選擇結(jié)果

從7種不同組合的F3：4代材料中選擇對小麥葉銹病抗性為免疫或近免疫(0或；)、農(nóng)藝性狀良好的小麥品系150份，具體組合和抗性見表2。

2.2 小麥抗葉銹病材料的分子檢測結(jié)果

2.2.1 目的基因 Lr24的檢測結(jié)果

用與 Lr24緊密連鎖的STS標(biāo)記對供試材料檢測，有105個(gè)F3：4雜交后代擴(kuò)增出與 TcLr24相同的607 bp的DNA片段(圖1)，占被測F3：4雜交后代的70.0%。而感病對照Thatcher未出現(xiàn)該片段，認(rèn)為這105份材料含有抗性基因 Lr24。

2.2.2 目的基因 Lr38的檢測結(jié)果

用與 Lr38緊密連鎖的SCAR標(biāo)記對供試材料檢測，有94個(gè)F3：4雜交后代出現(xiàn)了與TcLr38相同的982 bp的DNA片段(圖2)，占被測F3：4雜交后代的62.7%，而感病對照Thatcher未出現(xiàn)該片段，認(rèn)為這94份F3：4雜交后代材料含有抗性基因 Lr38。

M：DNA marker；W：水； N：Tc Lr24；S：Thatcher；G：中優(yōu)9507；1～20：1R17/中優(yōu)9507的F3：4材料。下圖同。

M:DNA marker; W:Water; N: Tc Lr24; S:Thatcher; G:ZY9507; 1-20:1R17/ZY9507 F3：4material.The same in Fig.2.

圖1 部分材料 Lr24基因的擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 PCR fragments of Lr24 gene in part tested materials

圖2 部分材料 Lr38基因的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 Lr24和 Lr38的聚合結(jié)果

在被檢測的150個(gè)雜交F3:4代材料中，有70(46.7%)個(gè)材料同時(shí)聚合了 Lr24和 Lr38，33個(gè)材料僅攜帶 Lr24基因，22個(gè)材料僅攜帶 Lr38基因，25份材料沒有擴(kuò)增出 Lr24和 Lr38中的任何一個(gè)基因(表2)。

表2 1R17抗葉銹基因?qū)刖酆喜牧系慕Y(jié)果Table 2 Genotyping results of resistance genes in pyramiding materials derived from 1R17

(續(xù)表2 Continued table 2)

編號Number組合Combination基因GeneLr24Lr38反應(yīng)型Type編號Number組合Combination基因GeneLr24Lr38反應(yīng)型Type481R17/ZY9507--0127ZY9507/1R171//1R17++0491R17/ZY9507++0128ZY9507/1R171//1R17-+0501R17/ZY9507++0129ZY9507/1R171//1R17-+0511R17/ZY9507+-0130ZY9507/1R171//1R17+-0521R17/ZY9507++0131ZY9507/1R171//1R17++0531R17/ZY9507++0132ZY9507/1R171//1R17+-0541R17/ZY9507++01331R17/YM34+-;551R17/ZY9507+-01341R17/YM34+-;561R17/ZY9507++01351R17/YM34-+;571R17/ZY9507++01361R17/YM34++;581R17/ZY9507++01371R17/YM34++;591R17/ZY9507++01381R17/YM34++;601R17/ZY9507+-01391R17/21924+-;611R17/ZY9507++01401R17/21924-+;621R17/ZY9507++01411R17/21924++;631R17/ZY9507++01421R17/21924++;641R17/ZY9507++01431R17/21924+-;651R17/ZY9507+-01441R17/21924++;661R17/ZY9507--01451R17/21898++;671R17/ZY9507++01461R17/21898-+;681R17/ZY9507++01471R17/21898++0691R17/ZY9507--01481R17/21898+-;70ZY9507/1R17++01491R17/21898++071ZY9507/1R17-+01501R17/21898+-;72ZY9507/1R17--0TcLr24+-0;73ZY9507/1R17--0TcLr38-+0;74ZY9507/1R17+-0ZY9507--375ZY9507/1R17--009P200--;1376ZY9507/1R17++0YM34--477ZY9507/1R17-+021924--;3178ZY9507/1R17--021898--;3179ZY9507/1R17--0Thatcher--4

3 討 論

傳統(tǒng)育種依靠表型選擇雜交后代，容易受到自然環(huán)境、發(fā)育時(shí)期、鑒定方法等因素的影響，且改良周期長，在育種過程中，由于種群進(jìn)化經(jīng)常導(dǎo)致改良后的品種缺乏競爭優(yōu)勢。利用與目的基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記進(jìn)行目的基因篩選，可以準(zhǔn)確篩選優(yōu)良目的基因，縮短育種年限。

抗葉銹基因 Lr24和 Lr38在中國均為強(qiáng)抗葉銹基因，按照常規(guī)育種方法很難確定所選材料是否攜帶這兩種基因。利用分子標(biāo)記輔助育種則可以有效克服這些困難。分子標(biāo)記輔助選擇的效率取決于被檢測的分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖程度，連鎖越緊密，則二者的重組率越低，選擇效率越高。本試驗(yàn)所選用的分子標(biāo)記(S1302-609、Y38SCAR982)與目的基因 Lr24、 Lr38緊密連鎖，特異性強(qiáng)，能有效檢測 Lr24和 Lr38基因[10-14]。

本研究田間對葉銹病高抗的150份材料中，有33份材料僅攜帶 Lr24基因，22份材料僅攜帶 Lr38基因。這主要由于 Lr24和 Lr38基因單獨(dú)存在對葉銹菌均具有極強(qiáng)的抗性，田間表型差異很小，再次說明僅靠抗性鑒定很難確定材料所攜帶抗性基因類型。25份材料未攜帶 Lr24或 Lr38基因，這25份材料分別來自1R17與ZY9507、YM34、09P200和21898的雜交， 這可能是雜交后代聚合了ZY9507、YM34、09P200、21898與1R17的其他抗葉銹基因。試驗(yàn)再次體現(xiàn)了分子標(biāo)記輔助鑒定的快速性、準(zhǔn)確性。

研究發(fā)現(xiàn)，1R17/ZY9507的聚合效率最高，被測兩個(gè)目的基因聚合率為63.7%；ZY9507/1R17的聚合效率最低，目的基因聚合率僅為10.5%；1R17為母本時(shí)，平均聚合率為39.8%，聚合效率較高；當(dāng)1R17作為父本時(shí)，聚合率為僅為10.5%，聚合率低。回交材料ZY9507/1R17//1R17的目的基因聚合率達(dá)到40%，說明母本基因?qū)蟠呢暙I(xiàn)較大，F(xiàn)2代與含有目的基因的親本回交可以有效提高聚合效率。

由于本試驗(yàn)僅開展了 Lr24、 Lr38的分子標(biāo)記檢測，篩選結(jié)果中高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)基因可能存在雜合現(xiàn)象，仍需對高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)性狀進(jìn)行進(jìn)一步跟蹤，以期更高效獲得高產(chǎn)、高抗葉銹病的優(yōu)質(zhì)小麥品種。

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Marker-Assisted Selection of Wheat Leaf Rust Resistant Genes Lr24 and Lr38 in the Pyramiding Materials of Wheat

WANG Zhi1,AN Zhe1,FAN Xuefeng1,ZHANG Xuming2,ZHANG Lirong1,ZHANG Yingzi1,YANG Wenxiang1,LIU Daqun1

(1.Department of Plant Pathology,Agricultural University of Hebei/Biological Con1trol Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province,Baoding,Hebei 071001,China; 2.Agricultural Bureau of Shahe City,Shahe,Hebei 054100,China)

In order to screen the leaf rust resistance and high quality pyramiding wheat progeny,the molecular markers of leaf rust resistance genes Lr24 and Lr38 were used to identify the wheat leaf rust resistance gene Lr24 and Lr38 in 150 F3:4offsprings derived from the high-yield and high-quality varieties. The results showed that 70 of 150 lines co-contained both Lr24 and Lr38.Eighty lines which showed resistance contained no Lr24 or Lr38. This study reduced the cost of wheat breeding improvement and improved the accuracy of gene selection for leaf rust resistance.

Wheat leaf rust; Lr24 and Lr28; Resistance genes pyramiding; Molecular maker-assisted breeding

時(shí)間：2017-01-03

2016-04-07

2016-06-14

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB127700)；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系小麥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(HBCT2013010204);河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(Z2014065)

E-mail：w2707905@163.com

楊文香(E-mail:wenxiangyang2003@163.com); 劉大群(E-mail:ldq@hebau.edu.cn)

S512.1；S332

A

1009-1041(2017)01-0016-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170103.1625.006.html