煙草葉片發育過程中FⅠ蛋白含量變化及與光合作用的關系

李軍營， 繆立新， 李 飛， 馬二登， 晉 艷

(1.云南省煙草農業科學研究院，云南昆明 650021； 2.云南省煙草公司昆明市公司宜良分公司；3.中國科學院昆明植物研究所生物技術實驗中心，云南昆明 650201)

煙草葉片發育過程中FⅠ蛋白含量變化及與光合作用的關系

李軍營1， 繆立新2， 李 飛3， 馬二登1， 晉 艷1

(1.云南省煙草農業科學研究院，云南昆明 650021； 2.云南省煙草公司昆明市公司宜良分公司；3.中國科學院昆明植物研究所生物技術實驗中心，云南昆明 650201)

通過對2個煙草品種云煙87、云煙85 FⅠ蛋白含量及其與幾種光合參數[葉綠素含量、光合速率和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(簡稱Rubisco)活性]的相關性分析，研究煙草葉片發育過程中FⅠ蛋白含量變化特點及其與光合同化能力的關系。結果表明：在葉片發育過程中，FⅠ蛋白含量、葉綠素含量、光合速率和Rubisco活性均是先升高后降低，且各參數之間均顯著相關，云煙85的FⅠ蛋白含量高于云煙87，但是光合速率卻低于云煙87。由研究結果可知，FⅠ蛋白含量與Rubisco活性共同限制著光合速率，進而影響煙草葉片的生長發育。

煙草；葉片；葉綠素含量；光合速率；FⅠ蛋白含量；Rubisco活性；相關性分析；葉片生長發育

煙草(NicotianatabacumL.)是一種多年生草本植物，它具有悠久的種植歷史，生長在世界各地的多個地域。隨著植物葉蛋白研究的不斷深入，煙草不再局限于商業生產香煙和相關的煙草產品。煙草蛋白是一種極具利用潛力和發展前景的植物蛋白資源，深入研究開發這種資源對于提高煙草的綜合利用價值、穩定煙草種植和增加煙農收入具有較大意義[1]。

煙草蛋白質含量高、營養均衡，在目前所有研究的植物蛋白中居首位，在白肋煙中的蛋白含量高達20.48%[2]。煙草蛋白可分為可溶性蛋白質、不可溶性蛋白質，可溶性蛋白質中約有一半是葉綠體蛋白質，即FⅠ蛋白(fraction Ⅰ protein)，在其酶功能相關研究中又稱為核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(簡稱Rubisco)；另一半是其他可溶性蛋白質的復合物，即FⅡ蛋白(fraction Ⅱ protein)。FⅠ蛋白是決定C3植物光合碳代謝方向和效率的關鍵酶，許多研究結果表明，FⅠ蛋白含量和Rubisco活性、光合速率顯著相關[3-7]，人為提高Rubisco活性，光合速率隨之升高[8-9]。在葉片衰老過程中，Rubisco被快速降解，光合速率急劇下降，Rubisco含量及活性的下降被認為是葉片衰老過程中光碳失衡的主要原因[10-11]，同時，Rubisco的降解產物被運往種子、果實等其他再生長部位被重新利用。因此可見，Rubisco降解與光合作用以及氮源的經濟利用密切相關[12-14]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為云南省煙草農業科學研究院選育的煙草品種云煙87、云煙85。試驗地點位于云南省玉溪市紅塔區趙桅村，采用漂浮育苗方式培育煙苗，于2015年4月24日進行移栽(行株距：120 cm×50 cm)，田間管理按常規方法。以自下而上第11張葉片為試驗對象，在葉片完全展開達到生理成熟時，每隔7 d采集1次樣品，同時測定相關指標。

1.2 葉綠素含量測定

避開葉脈，稱取0.05 g葉片，蒸餾水洗凈，吸干水分，剪成2 mm左右的碎塊，加入10 mL乙醇 ∶丙酮 ∶H2O體積比為9 ∶9 ∶2的葉綠素抽提液，4 ℃下避光抽提16 h；15 000 r/min、4 ℃離心15 min；使用紫外-可見分光光度計測量波長645、663 nm下的吸光度；重復3次。參照Arnon的計算公式[15]加以修正計算葉綠素含量：

總葉綠素含量=(8.04D663 nm+20.29D645 nm)×V/m×1 000。

式中：V為提取液體積，mL；m為煙葉質量，g。

1.3 光合速率的測定

采用GFS-3000便攜式光合作用測定系統，于晴天 9：00—11：00分別測定7、14、21、28、35、42、49、56、63、70 d葉片的凈光合速率。測定葉片面積為8 cm2，測定光照度為 1 000 μmol/(m2·s)，溫度為(25±2)℃，CO2濃度為 400 μmol/mol，相對濕度為50%，重復3次以上。各個品種在各個時期選取5張長勢一致的葉片測定，取平均值。

1.4 FⅠ蛋白的提取及含量測定

取200 g大田種植的煙草葉片，用蒸餾水洗凈后擦去多余的水分。加入預冷的200 mL樣品提取液[50 mmol/L pH值8.0的Tris-HCI，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaHCO3，10 mmol/Lβ-琉基乙醇，1%聚乙烯吡咯烷酮(簡稱PVP)]和少量石英砂，研磨成勻漿，用4層紗布過濾。調節濾液的pH值到7.4，將濾液攪拌的同時快速加熱到50 ℃，并維持10 min，然后將懸浮液在冰浴中迅速冷卻至 4 ℃。在4 ℃、12 000 r/min離心20 min。上清液用(NH4)2SO4鹽析，離心收集35%～55%飽和度的沉淀物，再用柱平衡緩沖液(50 mmol/L pH值8.0的Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L MgCl2，5 mmol/Lβ-琉基乙醇)溶解，Sephadex G-25柱用柱平衡緩沖液平衡，溶液經 Sephadex G-25柱脫鹽，用柱平衡緩沖液洗脫，收集蛋白質，將收集蛋白質再上二乙氨乙基(簡稱DEAE)纖維素陰離子交換柱，用三氯乙酸檢測蛋白質，收集流出的蛋白部分。向收集的蛋白部分中加入等體積0.025 mol/L Tris-HCl，pH值7.4，含0.2 mmol/L EDTA的緩沖液。將DEAE-纖維素柱的蛋白流出液裝入透析袋中，用0.025 mol/L Tris-HCl、pH值7.4(內含 0.2 mmol/L EDTA)的緩沖液透析1～2 d可出現結晶。

1.5 Rubisco羧化活性的測定

Rubisco羧化活性按照Wang等的方法[16]測定。酶粗提時，將0.3 g葉片于液氮中搗碎，加入1 mL酶提取液(50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，含0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L MgCl2、10 mmol/L NaHCO3)后在冰浴上研磨，4 ℃離心(20 000g)15 min后取上清備用。測定酶活性時，1 mL反應體系含5 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸-NaOH(簡稱HEPES-NaOH)(pH值8.0)、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaHCO3、0.1 mmol/L EDTA、0.25 mmol/L二硫蘇糖醇、1 U 3-磷酸甘油酸激酶、1 U磷酸肌酸激酶、1 U甘油醛-3-磷酸脫氫酶、0.5 mmol/L ATP、0.015 mmol/L NADH、0.5 mmol/L 磷酸肌酸、0.06 mmol/L 1，5-二磷酸核酮糖和100 μL酶提取液。通過檢測NADP在2 min內的D340 nm減少值，同時結合酶粗提液的蛋白質測定結果計算出酶活性。

1.6 蛋白質含量的測定

參照Bradford的方法[17]測定酶粗提液中的蛋白質含量。

2 結果與分析

2.1 煙草葉片發育過程中的葉綠素含量動態分析

由圖1可見，在7～70 d的煙草生長發育期內，葉綠素含量均是先升高后降低，在28 d時達到最高值，與葉片的生長趨勢一致，葉片也是在28 d左右完全展開；葉綠素含量在 28～35 d 基本維持穩定，35 d后，葉綠素含量逐漸降低，49 d后，隨著葉片的衰老，葉綠素含量明顯降低。2個煙草品種的葉綠素含量在生長初期和末期基本一致，但是在發育過程中有較大差異，云煙87的葉綠素含量在葉片發育中期階段明顯高于云煙85。

2.2 煙草葉片發育過程中的光合速率動態分析

由圖2可見，在葉片發育的開始階段，隨著煙草葉片的不斷生長，光合速率明顯提高；當葉片生長到一定大小，光合速率達到最大值，并能夠維持一段時間；當葉片生長發育到一定程度后，開始從形態、生理2個方面逐漸衰老，光合速率逐漸下降。總體看出，2個煙草品種光合速率差異較小，且變化趨勢較一致。

2.3 煙草葉片發育過程中的Rubisco羧化活性動態變化

由圖3可以看出，2個煙草品種的Rubisco羧化活性都是先升高后降低，在檢測初期和末期都是云煙87的 Rubisco羧化活性較高，但是在葉片的旺盛發育階段，云煙85的Rubisco羧化活性高于云煙87。總體可以看出，2個煙草品種的 Rubisco 羧化活性都是在28 d達到最大值，之后隨著葉片的衰老逐漸降低。

2.4 煙草葉片發育過程中的FⅠ葉蛋白含量的動態變化

FⅠ蛋白約占葉綠體蛋白質的50%，這是因為Rubisco羧化活性較低，為了彌補低效的缺陷，植物必須產生大量的Rubisco，但是并不是植物體內的所有Rubisco都具有活性，必須處于激活狀態的Rubisco才具有活性。圖4表明，2個品種FⅠ蛋白含量均是先升高，后來隨著葉片的衰老，FⅠ蛋白含量逐漸降低，FⅠ蛋白降解，尤其是它在衰老過程中的降解一直受到許多研究者的關注，它的一些體外降解產物己經被許多研究者發現。圖4還表明，只有在葉片發育的初期，云煙87的FⅠ蛋白含量高于云煙85，21 d后云煙85的FⅠ蛋白含量均高于云煙87。

2.5 FⅠ蛋白含量與葉綠素含量、凈光合速率和Rubisco羧化活性的相關性分析

對2個煙草品種在葉片整個生長發育階段的4個參數(FⅠ蛋白含量、葉綠素含量、凈光合速率和Rubisco羧化活性)進行相關性分析，兩兩相關性分析結果顯示，相關性均達到0.9以上。如表1所示，葉片葉綠素含量與光合速率呈極顯著正相關(ravg=0.946)，隨著葉片葉綠素含量減少，葉片的光合能力也逐漸減弱，最終導致Rubisco羧化活性和FⅠ蛋白含量下降，葉片光合速率與Rubisco羧化活性表現出極顯著的相關性(ravg=0.974)，葉片光合速率與FⅠ蛋白含量呈極顯著正相關(ravg=0.963)，Rubisco羧化活性和葉片FⅠ蛋白含量表現為極顯著相關(ravg=0.987)，葉綠素含量與FⅠ蛋白含量呈極顯著正相關(ravg=0.958)，這是因為Rubisco存在于植物的葉綠體中，葉綠素含量與Rubisco羧化活性呈極顯著相關(ravg=0.971)。可見2個品種的6個指標相關性都達到了顯著水平，但是品種之間的各參數有差異。

表1 FⅠ蛋白、葉綠素含量、光合速率和Rubisco羧化活性

注：**表示極顯著相關。

3 討論

Rubisco廣泛存在于能夠進行光合作用的植物、藍藻等生物中，是光合碳同化的關鍵酶和限速酶，是植物細胞中最豐富的蛋白質，也是自然界最豐富的蛋白質。本研究表明：煙草葉片的葉綠素含量與光合速率、葉綠素含量與FⅠ蛋白含量、葉綠素含量與Rubisco羧化活性、光合速率與FⅠ蛋白含量、光合速率與Rubisco羧化活性、FⅠ蛋白含量與Rubisco活性均呈顯著線性關系，這與前人研究的結果一致[18-20]。2個煙草品種的4個參數都存在著一定的差異，云煙87的Rubisco羧化活性均高于云煙85，但是FⅠ蛋白含量低于云煙85。大量研究表明，Rubisco活性直接決定植物的光合速率，處于活性狀態的Rubisco是影響植物光合速率的關鍵因素，Rubisco的含量在一定程度上體現了處于活性狀態的Rubisco，但是并不完全一致，這是因為在植物體內Rubisco含量較高的情況下，多余的Rubisco可能以貯藏蛋白形式存在，在酶量充足的情況下對光合速率起主要抑制作用的還在于Rubisco的活化程度，這可能與近年來發現的在植物體內對Rubisco活性起調節作用的Rubisco活化酶有關[21-23]，Martine z-Barajas等曾在玉米中發現Rubisco活化酶通過調節Rubisco活性從而調節光合速率，玉米低產量正是由于Rubisco活化酶含量低所致[8]，至于在煙草中是否存在同樣的機制還需要進一步的研究。

植物葉蛋白被認為是未來解決人類蛋白需求的最好來源，FⅠ蛋白是地球上最豐富的蛋白質[24]，作為一種可以大量獲取的蛋白質，其結晶產物不含碳水化合物、脂類化合物和無機鹽分，完全由氨基酸組成，有極高的純度[25]。植物葉蛋白的必需氨基酸的組成符合聯合國糧食及農業組織(簡稱FAO)、世界衛生組織(簡稱WHO)的要求，是一種營養平衡的蛋白質，其蛋白質利用率優于酪蛋白[26]，特別是煙草葉蛋白，是當前唯一能夠通過結晶提取的植物葉蛋白，煙葉中的蛋白質對卷煙的品質幾乎沒有什么貢獻，相反，它是卷煙中多種對人們有害成分的前體，如喹啉是FⅠ蛋白的主要氧化產品。此外，一些氨基酸如谷氨酸、色氨酸和賴氨酸在高溫燃燒時，同樣會產生一些對人體不利的誘變因子[27]。根據煙葉均質化調制理論[28-29]，在煙葉調制之前提取出煙葉中的可溶蛋白，可降低煙葉中的蛋白質含量，有利于生產較安全的卷煙產品，同時也可大量獲得高營養品質的FⅠ蛋白。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.023

2016-04-06

中國煙草總公司云南省公司科技計劃(編號：2015YN06)。

李軍營(1978—)，男，河北河間人，博士，副研究員，主要從事煙草栽培研究。E-mail：ljy1250@163.com。

晉 艷，碩士，副研究員，主要從事煙草栽培研究。E-mail：jinyan1968@163.com。

Q945.11；S572.01

A

1002-1302(2017)02-0086-04

李軍營，繆立新，李 飛，等. 煙草葉片發育過程中FⅠ蛋白含量變化及與光合作用的關系[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：86-89.