江蘇省及周邊地區番茄黃化曲葉病毒寄主范圍調查

季英華， 朱葉芹， 李 貴， 張 暉， 趙文浩， 吳淑華， 程兆榜， 趙統敏， 余文貴， 周益軍

(1.江蘇省農業科學院植物保護研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培養基地，江蘇南京 210014；2.江蘇省植物保護站，江蘇南京 210046； 3.江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇南京 210014)

江蘇省及周邊地區番茄黃化曲葉病毒寄主范圍調查

季英華1， 朱葉芹2， 李 貴1， 張 暉1， 趙文浩1， 吳淑華1， 程兆榜1， 趙統敏3， 余文貴3， 周益軍1

(1.江蘇省農業科學院植物保護研究所/江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培養基地，江蘇南京 210014；2.江蘇省植物保護站，江蘇南京 210046； 3.江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇南京 210014)

近年來由番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)導致的番茄黃化曲葉病給江蘇省及周邊地區番茄生產造成了慘重的損失，除番茄外，TYLCV還可以侵染多種作物及雜草，這些非番茄寄主在番茄黃化曲葉病的周年發生中起著重要的作用。為明確TYLCV的寄主范圍，2012—2014年對TYLCV在江蘇省及周邊地區的寄主范圍進行了調查。結果顯示，除番茄外TYLCV還可以侵染菜豆，并導致嚴重的矮化及皺縮癥狀，暗示TYLCV的發生可能成為菜豆種植的新威脅。雜草寄主的調查結果顯示，TYLCV可以侵染鐵莧菜、皺果莧，暗示這2種雜草是TYLCV的中間寄主，可能在TYLCV的周年循環中起作用。

番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)；寄主范圍；江蘇省及周邊地區

番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是一種粉虱傳植物DNA病毒，屬雙生病毒科(Geminividae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)[1]，是重要的植物病原病毒。由于TYLCV侵染番茄常引起番茄葉緣及脈間黃化、葉片上卷等癥狀，因此生產上常將這類病害稱為番茄黃化曲葉病。除在葉片上表現癥狀外，番茄黃化曲葉病還嚴重影響番茄產量，特別是在苗期感染，常導致絕產絕收，造成毀滅性危害。目前該病害至少在20多個國家和地區出現發生流行危害報道[2-4]，給當地番茄生產造成了慘重的損失。

除番茄外，TYLCV還可以侵染菜豆[5-6]、辣椒[7-8]、煙草等多種作物及雜草。雖然很多報道顯示TYLCV只侵染雙子葉植物，但由于TYLCV目前已成為一種在世界范圍內發生的植物病毒，因此寄主范圍相對比較復雜。1998—2001年 Salati 等在對多米尼加共和國的TYLCV寄主范圍進行調查時發現，調查采集的10個科26種寄主中，在8個科16種寄主上檢測到了TYLCV[9]。2007—2008年Papayiannis等在對塞浦路斯番茄產區的TYLCV寄主范圍進行調查時發現，調查涉及的25個科122種(4 000份樣品)寄主上，在15個科49種(461份樣品)寄主中檢測到了TYLCV[10]。這些寄主一方面是TYLCV的危害對象，另一方面它們又是TYLCV的中間寄主，在TYLCV周年循環中是重要的病毒侵染來源，因此針對一個地域了解當地的TYLCV寄主范圍不僅有助于明確 TYLCV 的潛在危害對象，也有助于弄清TYLCV的發生規律，進而制定有效的防控策略。

江蘇省內由TYLCV導致的番茄黃化曲葉病于2007年年底出現危害[11]，2008—2009年該病迅速擴張至整個江蘇省及周邊地區[12]，給當地的番茄生產造成慘重損失，為了弄清其發生規律，探索有針對性的防控措施，本試驗于2012—2014年對它的寄主范圍進行了調查。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本研究涉及作物及雜草樣品于2012—2014年采自江蘇省及周邊的安徽省部分區域番茄種植區(集中在番茄黃化曲葉病發病棚室內及周邊區域)，樣品采集后保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 樣品檢測

參照謝艷等的方法[13]提取DNA：取10 mg樣品于 1.5 mL 離心管中，加100 μL 0.5 mol/L NaOH，研磨成勻漿狀，低速離心，取上清，用0.1 mol/L Tris-HCl稀釋100倍作為PCR反應模板。

使用粉虱傳雙生病毒引物PA(5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′)和PB(5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′)進行PCR檢測[14]，PCR反應條件為94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸 10 min。PCR反應體系為10×反應緩沖液(含Mg2+)2.5 μL；10 mmol/L dNTP混合物 0.5 μL；10 μmol/L PA 1.5 μL；10 μmol/L PB 1.5 μL；模板DNA 2 μL；5 U/mLTaqplusDNA聚合酶0.5 μL；加ddH2O至終體積25 μL。PCR反應產物于1%瓊脂糖電泳中檢測，隨機抽取陽性樣品進行序列測定，序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 陽性寄主的認定

由于粉虱傳雙生病毒的分類標準是采用全基因組序列的同源性高低來認定(DNA-A全基因組序列同源性≥91%為同一個種，<91%為不同種)[15]，因此對于PA/PB檢測結果為陽性的樣品，只能認定為疑似寄主。

為了進一步判定這些陽性樣品是否為TYLCV的寄主，筆者從所有檢測結果為陽性的疑似寄主中抽取典型樣品進行全基因組序列的克隆：設計全長引物TY_1A-BF(5′-ATGTGGGATCCACTTCTAAATGAATTTCC-3′)和TY_1A_SR(5′-GCGTCGACAGTGCAAGACAAACTACTTGGGGACC-3′)進行全基因組序列PCR擴增(PCR體系及反應程序同上，其中退火溫度為58 ℃，延伸時間為3 min)，擴增產物回收后克隆至pGEM-T載體上測序，最終根據測序結果判定該寄主是否為TYLCV的自然寄主。

2 結果與分析

2.1 TYLCV作物寄主種類調查

在江蘇省內，番茄作為TYLCV的主要危害寄主已有報道[11]，因此筆者在本次調查過程中主要針對TYLCV的其他潛在危害作物寄主進行調查：2012—2014年，筆者累計對江蘇省及周邊地區包括辣椒、茄子、菜豆、豇豆、黃瓜、西瓜、絲瓜、冬瓜、南瓜、萵苣、棉花等作物在內的1 062份非番茄寄主樣品進行了檢測，結果在菜豆上確認了TYLCV的發生(圖1)，在西瓜、豇豆上檢測到了疑似樣品(表1)。其中菜豆受TYLCV侵染后會表現出明顯的葉片皺縮、變小，植株矮化(圖1)，結莢率嚴重下降，特別是在秋茬菜豆與番茄混種的棚室內，該病發生非常嚴重。

2.2 TYLCV雜草寄主種類調查

在很多植物病毒的周年侵染循環中， 雜草是重要的中間寄主，是病毒再侵染的重要來源(病毒庫)。為明確江蘇省TYLCV的雜草中間寄主種類，筆者對江蘇省及周邊地區的雜草寄主進行了調查，對22種常見的雜草調查結果顯示，鐵莧菜、皺果莧是TYLCV的雜草中間寄主(表2)。在田間隨機抽樣調查中，采自番茄黃化曲葉病棚室周邊的鐵莧菜TYLCV感染率平均達47%，部分棚室周邊采的樣品感染率高達72%，說明鐵莧菜是TYLCV的重要中間寄主。由于TYLCV侵染鐵莧菜多不表現癥狀(偶爾伴有黃化癥狀)，因此在田間單靠癥狀很難區分。皺果莧是保護地內常見的雜草，在調查中發現它也是TYLCV的中間寄主，但是皺果莧在自然條件下的感染率不高(相比鐵莧菜)，感染后也不表現明顯的癥狀(偶爾伴有葉片卷曲癥狀)。因此在生產上，特別是在多種雜草混生地區，番茄黃化曲葉病的防控要特別注意周邊雜草(毒源)，清除田間及周邊地區的雜草可以有效地壓低TYLCV的中間寄主數量，這無論是對番茄黃化曲葉病的防控還是對其他蟲媒病毒病的防控都有重要的意義。

表1 江蘇省及周邊地區TYLCV作物寄主調查

注：“*”為已克隆全序列的寄主樣品。下表同。

3 討論

江蘇省內目前已知的TYLCV寄主至少有4種，可以分為2類：一類為作物寄主，包括番茄和菜豆，由于番茄是主要受害作物，2008年就有報道[11]，人們對它已普遍認知；而對于菜豆，早前西班牙[5]、希臘[6]、日本[16]等地都報道其為TYLCV寄主。本研究中，筆者也發現江蘇及安徽地區的菜豆上感染了TYLCV，表明菜豆也是TYLCV的潛在危害對象。在調查中也發現有些菜豆品種上TYLCV發生很重，而有些品種上發生較輕，暗示了并非所有的菜豆品種都對TYLCV敏感。但目前國內菜豆品種對TYLCV的抗性水平尚不明確，因此在選種菜豆時應盡量避免在煙粉虱大發生的6—10月與番茄等作物混種或者使用相同的育苗場所。若使用相同的育苗場所一定要注意嚴防煙粉虱，同時盡量遠離有番茄黃化曲葉病發生的大棚。另一類為雜草寄主，包括鐵莧菜和皺果莧，這2種雜草在田間都沒有典型的癥狀(零星的樣品有癥狀)，因此田間靠癥狀鑒別是否感染TYLCV比較困難。由于江蘇地區夏季溫度偏高，保護地6—7月基本不會安排番茄種植(露地番茄很少)，因此在這段時間，雜草和其他作物可能是TYLCV的重要中間寄主，為TYLCV再次侵染下茬番茄提供重要的病毒侵染來源，因此在田間清除雜草時應特別注意這2種雜草。另有2個疑似寄主：豇豆和西瓜，將其劃分為疑似寄主主要有2個方面的考慮：(1)調查結果顯示這2種疑似寄主上TYLCV的檢出率都很低(表1)；(2)雖然2種寄主中都有樣品檢測結果為陽性(PA/PB)，但是由于這2個陽性樣品目前都沒有拿到全基因組序列，因此將其暫列為疑似寄主。2012年Dai等在上海發現TYLCV可以侵染豇豆并且導致比較明顯的褪綠黃化癥狀，因此在江蘇省內它也可能是TYLCV的一個寄主[17]，但是從本研究的結果看其感染率(檢出率)并不高。

表2 江蘇省及周邊地區TYLCV雜草寄主調查

TYLCV自2006年傳入中國以來，目前有報道的寄主包括番茄[18]、豇豆[17]、菜豆、陸地棉、苘麻、煙草、百日菊[19]、鐵莧菜、皺果莧等9種，這個結果相較于TYLCV在塞浦路斯的寄主種類(15個科49種，2007—2008年)[10]明顯少許多，可能的原因有2個方面：一方面TYLCV在我國發生的時間相對較短(始于2006年)，而TYLCV在塞浦路斯的發生時間相對較長(始于1974年)，長時間的適應可能使得TYLCV有更廣的寄主范圍；另一方面可能與調查時采用的檢測方法有關，有報道顯示TYLCV在有些雜草寄主中的病毒含量較低，因此采用不同的檢測方法得到的結果可能有些不同。在本研究中樣品的檢測主要通過PCR完成，而塞浦路斯樣品檢測主要依托實時定量PCR：實時定量PCR的檢測結果是49種寄主(普通PCR的檢測結果是43種)，暗示研究TYLCV的雜草寄主時，實時定量PCR檢測在靈敏性上更有優勢。

由于TYLCV是一種在世界范圍發生危害的病毒，因此對于其寄主范圍多地都有報道[9-10，20-22]，但是不同的地域由于氣候、環境、耕作方式等方面的差異，往往有不同的植被群落，再加上地域間介體類型及介體發生規律也不盡相同，因此病毒在不同地域的寄主范圍往往會有差異，有時甚至同樣的植物在不同的地域表現出寄主與非寄主的差異。Davis在美國佛羅里達州調查TYLCV寄主范圍時發現反枝莧是TYLCV的寄主[20]，而筆者在江蘇地區的調查結果顯示在反枝莧中沒有檢測到TYLCV。Zubiaur等在調查古巴TYLCV的寄主范圍時發現南瓜是TYLCV的寄主[23]，但是本研究在江蘇省采集的南瓜樣品中均未檢測到TYLCV。同樣有很多報道顯示辣椒也是TYLCV的寄主[7-8]，但在江蘇地區也未在辣椒上檢測到TYLCV。由此可見，不同地域的生態環境不同、栽培模式不同，病毒的寄主范圍也往往不盡相同。針對江蘇地區TYLCV寄主種類展開調查，明確其寄主范圍，將有利于進一步明確TYLCV在江蘇地區的發生規律，為探尋TYLCV周年循環中的薄弱環節，找到有效切斷病毒傳播途徑的方式，制定有針對性的防控策略提供基礎。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.024

2015-11-08

國家自然科學基金(編號：31572074)；國家公益性行業(農業)科研專項(編號：201303028)；江蘇省“333”高層次人才培養工程科研項目(編號：BRA2013262)；江蘇省農業科技自住創新重點項目[編號：CX(12)1004]；江蘇省科技基礎設施建設計劃項目(編號：4911406)。

季英華(1979—)，男，山東日照人，碩士，副研究員，主要從事粉虱傳病毒研究。E-mail：jiyinghua@jaas.ac.cn。

周益軍，博士，研究員，主要從事植物病毒的研究。Tel：(025)84390391；E-mail：yjzhou@jaas.ac.cn。

S436.412.1+1

A

1002-1302(2017)02-0090-03

季英華，朱葉芹，李 貴，等. 江蘇省及周邊地區番茄黃化曲葉病毒寄主范圍調查[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：90-93.