球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關性

張丹丹， 劉廷輝， 趙 丹， 李瑞軍， 董建臻， 陸秀君

(河北農業大學植物保護學院，河北保定 071001)

球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關性

張丹丹， 劉廷輝， 趙 丹， 李瑞軍， 董建臻， 陸秀君

(河北農業大學植物保護學院，河北保定 071001)

為了研究球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關性，以黃粉蟲為標準試蟲測定9株球孢白僵菌的毒力，并分別測定其胞外蛋白酶、幾丁質酶和脂肪酶的生產水平。相關分析表明，3種胞外酶活性與毒力的線性關系分別為y1=-13.815 4x+185.954 4，r12=0.495 7；y2=-10.976 0x+58.977 0，r22=0.432 5；y3=-1.122 3x+8.469 5，r32=0.830 3。由r2值可以看出，胞外脂肪酶活性與毒力的線性關系最明顯，脂肪酶活性可作為大量菌株毒力初篩的參考性指標。

球孢白僵菌；胞外酶；毒力；相關性

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是目前國內外研究應用最為廣泛的害蟲生防真菌，同時也是一類廣譜性的昆蟲病原真菌[1]，白僵菌以其高效、低毒、不污染環境、對人畜無害等特點長期以來受到了廣泛的關注和深入的研究[2]。白僵菌對多種害蟲具有致病性，能侵染包括15目149科521屬700多種昆蟲和至少6科7屬13種蜱螨類[3-4]，并且致病力強、持效期長、不易產生抗藥性、對人畜無害，利用其開發微生物殺蟲劑具有良好的發展前景[5-6]。

大量研究表明，白僵菌主要通過與寄主的表皮接觸，從昆蟲的體壁、氣門、節間膜、氣孔及傷口等處侵入而感染，但有時也在昆蟲取食、呼吸時經過消化道和呼吸道等內部途徑進行感染[7]。昆蟲的表皮成分可以為白僵菌的萌發提供營養物質，同時對芽管的形成具有刺激作用。白僵菌分生孢子吸收營養后開始萌發，從端部或側面長出芽管[8]。另有研究表明，球孢白僵菌在代謝過程中能合成、分泌一系列胞外酶，如蛋白酶、幾丁質酶和脂肪酶等，它們在白僵菌入侵寄主時，尤其在穿透昆蟲體壁過程中，起到溶解昆蟲表皮以利于菌體侵染的作用[1]。有學者研究表明，球孢白僵菌蛋白酶、幾丁質酶和脂肪酶產生水平與其菌株毒力之間存在一定的相關性[9-14]。目前測定球孢白僵菌毒力一般采用生物測定的方法，這種方法受到許多因素的影響，包括試蟲的蟲齡、生理狀態、生物測定時的環境條件等，常使毒力測定結果的重現性較差，如果可以通過借助普通的生物化學方法測定這些酶的活性，間接揭示菌株的毒力，在大量菌株中篩選高毒力菌株的同時就可以實現既準確又高效的目的[15]。因此，本試驗測定了9株球抱白僵菌的胞外蛋白酶、幾丁質酶和脂肪酶的活性及其對黃粉蟲(TenebriomolitorL.)的毒力，并進行相關性研究，以期探討上述3種體壁降解酶作為毒力指標的可靠性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 9株球孢白僵菌菌株，由筆者實驗室從北方野外土壤中誘集分離得到。

1.1.2 試蟲 黃粉蟲，筆者實驗室飼養所得的低齡幼蟲。

1.1.3 藥品 吐溫-80、PDA培養基、SDA培養基、酪氨酸、酪蛋白、Folin-酚試劑、幾丁質、二硝基水楊酸、橄欖油、NaOH、酚酞、聚乙烯醇、磷酸緩沖液(pH值為7.5)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株毒力測定

1.2.1.1 孢子懸浮液的制備 將實驗室保存的球孢白僵菌菌株，在PDA平板上(25±1) ℃恒溫培養10 d，在無菌條件下刮取孢子粉，放于裝有少量含0.05% 吐溫-80無菌水的組織研磨器中研磨，充分研磨后倒入滅菌后的小燒杯中，用血球計數板計數，并將孢子懸浮液濃度調至1億個/mL備用。

1.2.1.2 毒力測定 將3齡黃粉蟲幼蟲浸入上述配好的孢子懸浮液中3 s后，放入鋪有濾紙的培養皿中，并用無菌水保濕，用0.05% 吐溫-80無菌水處理作對照。每天觀察并記錄死蟲數，死蟲進行保濕培養，觀察并記錄蟲體是否有菌絲長出。

1.2.2 胞外酶測定

1.2.2.1 菌株液體培養，粗酶液制備 根據“1.2.1.1”節中的方法制備孢子懸浮液，以1%的量接種到100 mL SDA培養基中(置于250 mL三角瓶中)，于(25±1) ℃恒溫搖床中 150 r/min 振蕩培養，按試驗進度定時取出培養物，過濾后留濾液測定胞外酶活性。

1.2.2.2 蛋白酶活性的測定 (1)取培養5 d后的液體培養物，用滅菌濾紙過濾，留濾液(酶液)備用。(2)用Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L，pH值為8.5)將底物酪蛋白配成 10 mg/mL 酪蛋白溶液，取1 mL 10 mg/mL酪蛋白溶液，加入1 mL待測酶液中，于37 ℃反應30 min，每個處理3次重復。(3)用2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸中止反應并過濾。(4)留濾液用Folin-酚試劑進行檢測，每管加入400 μL濾液，2 mL Folin等A、B混合液(1 ∶50的比例配制)室溫下靜止反應 10 min，加入200 μL酚試劑，靜止30 min，在650 nm波長處測吸光度，以1 min催化分解生成1 μg酪氨酸的酶量為1個活性單位(U/mL)，用酪氨酸標準溶液制作標準曲線，從而得出不同菌株的胞外蛋白酶的活性。

1.2.2.3 幾丁質酶活性的測定 (1)取培養4 d后的液體培養物，用滅菌濾紙過濾，留濾液(酶液)備用。(2)以1.0 mL 的1%膠體幾丁質為底物，加入0.5 mL酶液，50 ℃水浴反應1 h。(3)用DNS (3，5-二硝基水楊酸)法測定產生的還原糖。樣品液適當稀釋，使糖濃度為0.1～1.0 mg/mL，取 1.0 mL 稀釋后的糖液于15 mL刻度試管中，加入2.0 mL DNS試劑，沸水浴反應2 min，冷卻后用水補足到15 mL刻度，在540 nm波長處測定吸光度。從葡萄糖制備標準曲線，得出不同菌株幾丁質酶的活性。

1.2.2.4 脂肪酶活性的測定 (1)取培養4 d后的液體培養物，用滅菌濾紙過濾，留濾液(酶液)備用。(2)在100 mL三角瓶中加入4 mL聚乙烯醇橄欖油乳化劑和5 mL 0.025 mol/L 磷酸緩沖液(pH值為7.5)，置于40 ℃預熱5～10 min，加入 1 mL 酶液，計時準確反應16 min后立即加入15 mL 95%乙醇終止酶反應。(3)加酚酞指示劑2～3滴，用0.1 mol/L NaOH滴定至紅色為終點。

2 結果與分析

2.1 9株球孢白僵菌菌株對黃粉蟲的毒力測定結果

球孢白僵菌對黃粉蟲的毒力測定結果如表1所示，經過方差和顯著性水平分析可知，其中B07-09-7毒力最高，致死中時為2.29 d；B07-09-124毒力最低，致死中時為 4.39 d。

表1 9株球孢白僵菌菌株對黃粉蟲的致死中時(LT50)

注：同列數據后不同大寫、小寫字母分別表示在1%、5%水平上差異顯著。下表同。

2.2 蛋白酶活性測定結果

球孢白僵菌蛋白酶活性測定結果如表2所示，經過方差和顯著性水平分析可知，9株球孢白僵菌的蛋白酶活性有明顯的差異。其中，B07-09-7的蛋白酶活性最高，高達174.51 U/mL，而B07-09-124的蛋白酶活性只有 125.22 U/mL。對表1、表2中的數據進行相關性分析，得出球孢白僵菌蛋白酶活性y1和致死中時x之間的線性關系為y1=-13.815 4x+185.954 4、r1=0.704 0、r12=0.495 7 (P=0.034 3)。由此可以看出，球孢白僵菌蛋白酶活性與致死中時的線性關系并不明顯，蛋白酶活性單獨作為衡量菌株毒力水平的指標預測性較差。

表2 9株球孢白僵菌菌株蛋白酶活性方差分析結果

2.3 幾丁質酶活性測定結果

球孢白僵菌幾丁質酶活性的測定結果如表3所示，經過方差和顯著性水平分析可知，9株球孢白僵菌的幾丁質酶活性有明顯的差異。其中，B07-09-7的幾丁質酶活性最高，高達38.61 U/mL，而B07-09-143的幾丁質酶活性只有 8.10 U/mL，結合表1得出球孢白僵菌幾丁質酶活性y2和致死中時x之間線性關系為y2=-10.976 0x+58.977 0、r2=0.657 7、r22=0.432 5(P=0.054 2)。由此可以看出，球孢白僵菌幾丁質酶活性與致死中時的線性關系并不明顯。

2.4 脂肪酶活性測定結果

球孢白僵菌脂肪酶活性的測定結果如表4所示，經過方差和顯著性水平分析可知，9株球孢白僵菌的脂肪酶活性有明顯的差異。其中，B07-06-362的脂肪酶活性最高，高達6.04 U/mL，而B07-09-143的脂肪酶酶活性只有 3.34 U/mL，結合表1得出球孢白僵菌脂肪酶活性y3和致死中時x之間線性關系y3=-1.122 3x+8.469 5、r3=0.911 2、r32=0.830 3(P=0.000 6)。由此可以看出，球孢白僵菌脂肪酶活性與毒力極顯著相關。

表3 9株球孢白僵菌菌株幾丁質酶活性方差分析結果

表4 9株球孢白僵菌菌株脂肪酶活性方差分析結果

3 結論與討論

9株球孢白僵菌的胞外蛋白酶、幾丁質酶、脂肪酶活性與對黃粉蟲毒力的相關性研究結果中，脂肪酶活性與毒力的相關性最顯著，就相關性而言，脂肪酶活性的高低在一定程度上可以表達白僵菌毒力的強弱。r2=0.830 3，即脂肪酶可以表達毒力的83.03%，由此可以考慮用脂肪酶活性表示球孢白僵菌毒力。

球孢白僵菌的脂肪酶活性對白僵菌侵染寄主的過程有一定的影響。球孢白僵菌入侵寄主分幾個階段，其中包括孢子的萌發、附著、入侵和定殖，而入侵是其中至關重要的一步。根據昆蟲表皮的結構，白僵菌入侵寄主的第1道屏障是昆蟲蟲體表面的蠟脂，而脂肪酶可以消除蠟脂層，打破白僵菌入侵寄主的第1道屏障，為其進一步入侵提供基礎。Pavlyushin發現，球孢白僵菌的脂肪酶活性與其對昆蟲的毒力有關[16]，Smith等的試驗也進一步證實了這一點[17]。脂肪酶的作用不僅消除了孢子入侵的屏障，而且可能給真菌提供營養。由此可認為，脂肪酶對降解昆蟲表皮、提供真菌營養具有一定的貢獻。

脂肪酶僅是昆蟲體壁結構物降解酶系之一。本研究結果表明脂肪酶在白僵菌侵染過程中的重要作用，這一結論與馮明光所得出的胞外蛋白酶作為毒力生物測定的補充指標[15]有一定的出入。因此，無論是用胞外蛋白酶活性還是用胞外脂肪酶活性作為白僵菌毒力指標，都須持謹慎態度，應當有條件地使用或者用于大量菌株的初篩工作中。

[1]林海萍，韓正敏，張 昕，等. 球孢白僵菌研究現狀及提高其殺蟲效果展望[J]. 浙江農林大學學報，2006，23(5)：575-580.

[2]劉廷輝，武麗芬，李瑞軍，等. 7株白僵菌菌株的抗逆性研究[J]. 河北農業大學學報，2013，36(3)：82-86，97.

[3]李增智，李春如，黃 勃. 中國蟲生真菌研究與應用[J]. 昆蟲知識，1988，1：241-255.

[4]Tafoya F，Zunigadelgadillo M，Alatorre R，et al. Pathogenicity ofBeauveriabassiana(Deuteromycota：Hyphomycetes) against the cactus weevil，Metamasiusspinolae(Coleoptera：Curculionidae) under laboratory conditions[J]. Florida Entomologist，2004，87(4)：533-536.

[5]李阜棣，胡正嘉. 微生物學[M]. 北京：中國農業出版社，2000：283-284.

[6]蒲蟄龍. 害蟲生物防治[M]. 北京：科學出版社，1977：104-108.

[7]王園園. 球孢白僵菌分生孢子田間生存潛能及與常用藥劑的相容性研究[D]. 保定：河北農業大學，2013.

[8]季香云，楊長舉. 白僵菌的致病性與應用[J]. 中國生物防治學報，2003，19(2)：82-85.

[9]Stleger R J，Bidochka M J，Roberts D W. Isoforms of the cuticle-degrading Pr1 proteinase and production of a metalloproteinase byMetarhiziumanisopliae[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，1994，313(1)：1-7.

[10] Leger R J，Frank D C，Roberts D W，et al. Molecular cloning and regulatory analysis of the cuticle-degrading-protease structural gene from the entomopathogenic fungusMetarhiziumanisopliae[J]. European Journal of Biochemistry，1992，204(3)：991-1001.

[11]Fang W，Leng B，Xiao Y，et al. Cloning ofBeauveriabassianachitinase geneBbchit1 and its application to improve fungal strain virulence[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71(1)：363-370.

[12]St. Leger R J. The role of cuticle-degrading proteases in fungal pathogenesis of insects[J]. Canadian Journal of Botany，1995，73(S1)：1119-1125.

[13]樊美珍，胡景江. 白僵菌酯酶同工酶、脂肪酸與其毒力的關系[J]. 安徽農業大學學報，1996，23(3)：260-266.

[14]姚 劍，黃大慶. 球孢白僵菌蛋白質酶、幾丁質酶和β-N-乙酰葡萄糖苷酶產生水平及其與毒力關系的研究[J]. 宿州學院學報，2004，19(4)：102-106.

[15]馮明光. 胞外蛋白酶和脂酶活性作為球孢白僵菌毒力指標的可靠性分析[J]. 微生物學報，1998，38(6)：461-467.

[16]Pavlyushin V A. Virulence mechanisms of the entomopathogenic fungusBeauveriabassiana(Bals.) Vuill[C]//Proceedings of the First Joint US USSR Conference on the Production，Selection and Standardization of Entomopathogenic Fungi of US/USSR Joint Working Group on the Production of Substances by Microbiological Means，1978.

[17]Smith R J，Pekrul S，Grula E A. Requirement for sequential enzymatic activities for penetration of the integument of the corn earworm (Heliothiszea)[J]. Journal of Invertebrate Pathology，1981，38(3)：335-344.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.025

2015-11-24

國家花生產業技術體系專項(編號：CARS-14)。

張丹丹(1990—)，女，河北邯鄲人，碩士研究生，研究方向為害蟲生物防治及分子生物學。E-mail：1404547846@qq.com。

李瑞軍，博士，副教授，研究方向為害蟲生物防治及農業生態安全。E-mail：liruijun99@sina.com。

S432.4+4

A

1002-1302(2017)02-0093-03

張丹丹，劉廷輝，趙 丹，等. 球孢白僵菌胞外酶的活性與其毒力的相關性[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：93-95.