金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌分離與鑒定

向玉勇， 徐中秋， 柴新義

(滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州 239000)

金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌分離與鑒定

向玉勇， 徐中秋， 柴新義

(滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州 239000)

金銀花尺蠖是近年來新發現的金銀花主要食葉害蟲之一，在河南、山東、安徽等地均有分布。為了解金銀花尺蠖幼蟲腸道環境中的細菌種類，對金銀花尺蠖幼蟲腸道中的細菌進行分離、純化和培養，獲得3個細菌菌株，對菌株的培養性狀、染色反應、菌體形態、生理生化反應進行系統研究。結果表明，它們分別屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。這3種菌株在金銀花尺蠖幼蟲腸道中存在的數量差別很大，其中葡萄球菌屬的數量最大，為6.59×1011個/mL。

金銀花尺蠖；腸道細菌；分離；鑒定

動物的腸道系統內寄居著數量巨大的微生物群，動物的生長發育除受溫度、濕度、光照等環境因素影響外，還受其腸道系統內的微生物群影響[1-2]。這些微生物群是在與宿主動物協同進化過程中形成的，含有多種酶系統，能參與寄主動物能量和物質代謝，以及遺傳信息運轉等一系列生理過程[3]，因此，對寄主動物的健康生長是有益的。昆蟲是動物界中數量最大的類群，在昆蟲腸道系統中寄居的正常微生物群，是昆蟲機體的生理組成部分，與昆蟲營養生理活動有著密切關系[4]。如有些昆蟲不能直接利用食物中的某些營養成分，必須依靠腸道內微生物的作用才能消化食物，從而促進營養物質的代謝和轉化。腸道微環境發生改變，可引起微生物群發生變化，從而影響昆蟲的生命活動。因此，對昆蟲腸道微生物菌群進行研究，可以通過人為調控打破其腸道微生態平衡，影響昆蟲的營養生理活動，使其不能正常發育，從而控制害蟲的發生危害，對害蟲防治具有十分重要的理論和實踐意義。目前，國內對昆蟲腸道微生物的研究只涉及少數昆蟲[4-7]，昆蟲是動物界中種類最大的類群，不同種類昆蟲甚至同種昆蟲不同蟲態腸道微生物的種類會存在差異。因此，還必須選擇更多的昆蟲種類加以系統研究，以明確不同種類昆蟲腸道微生物的類群。

金銀花尺蠖(Heterolochajinyinhuaphaga)屬鱗翅目尺蛾科昆蟲，別稱拱腰蟲，是近年新發現的金銀花主要食葉害蟲之一，在河南、山東、安徽等地已有報道[8-11]。該蟲常將金銀花葉片咬成缺刻或孔洞，甚至將葉片全部吃光，造成金銀花大面積減產，給金銀花生產帶來嚴重損失。目前，國內對金銀花尺蠖的研究主要是關于其生物學特性及防治方面[8-12]，而對其腸道微生物的研究尚未見報道。本試驗對金銀花尺蠖幼蟲的腸道細菌進行分離及鑒定，以了解其幼蟲腸道細菌的種類，為進一步探討腸道細菌對其生命活動的影響奠定基礎，從而為更好地利用微生態調控技術防治該蟲提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源與培養基

金銀花尺蠖幼蟲采集于安徽省明光市三界鎮，在室內人工氣候箱[光—暗周期為14 h—10 h、溫度為(25±1)℃、相對濕度為(70±7)%]中用新鮮的金銀花葉片飼養，選取大小一致的健康老熟幼蟲作為試驗材料。培養基：NA培養基、NB培養基、金氏B培養基、PDA培養基等[13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 腸道細菌的分離與純化 取10頭金銀花尺蠖5齡老熟幼蟲，浸泡在75%的乙醇中將其殺死，15 s后取出蟲體放在0.1%氯化汞液中消毒2 min，再用滅菌水清洗，然后在無菌條件下取出消化道稱其質量后用滅菌研缽研磨成勻漿，研磨液用滅菌水稀釋至10-1～10-10。取10-8、10-9、10-10等3個稀釋度用平板稀釋法和涂抹法進行分離，各稀釋度重復3次，分別置于生化培養箱中，在30 ℃下培養72 h。挑取表征各異菌落在NA培養基平板上劃線、純化，然后分別移植斜面培養，并按出現數量依次編號。

1.2.2 腸道細菌的鑒定 將分離純化得到的各細菌菌株進行形態染色，觀察其培養性狀，并進行生理生化測定，根據文獻[14-15]進行鑒定。

1.2.3 腸道細菌的數量測定 將腸道細菌懸浮液定量稀釋后，取一定量不同稀釋度的細菌懸浮液，在瓊脂平板上培養72 h，選取菌落生長稀疏、適當稀釋度計算菌落數，求出3個重復的平均值。按照以下公式計算出腸道中的細菌數[4]：腸道中的細菌數(個/mL)=平板上菌落數(個)×稀釋倍數/平板上加菌液的量(mL)。

2 結果與分析

通過對金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌進行分離純化，獲得3個細菌菌株，對3個菌株進行鑒定試驗。

2.1 菌體形態和培養性狀

在NA培養基上將供試菌株培養24 h，經革蘭氏染色法和3% KOH簡易法鑒別，均呈陽性。油鏡下觀察發現，1個菌株呈球狀，2個菌株呈桿狀。用NA、NB培養基將分離純化的供試菌株經28 ℃培養48 h后觀察，3個菌株在2種培養基各呈不同的表現(表1)。

表1 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌形態特征及培養性狀

2.2 供試菌株生理性狀

從表2可知，經不同溫度、pH值、NaCl濃度下培養，所有供試菌株均在15～42 ℃、pH值5～9、NaCl濃度2%～7%條件下生長良好。在10 ℃低溫下只有3號菌株能夠正常生長；在55 ℃高溫下，只有1號菌株能夠正常生長；pH值=11條件下只有1、2號菌能正常生長；在10% NaCl濃度條件下只有1號菌株可以正常生長。

表2 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌生理性狀

注：“+”表示該條件下菌株擴繁；“-”表示該條件下菌株死亡。

2.3 供試菌株生化性狀

3種菌株均產生氧化酶和過氧化氫酶，能進行淀粉水解和硝酸鹽還原，均能分解利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、海藻糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、肌醇，甲基紅試驗均呈陰性，都不產生吲哚，其他生化項目各異(表3)。

表3 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌生化反應

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.4 菌株鑒定

通過對3個細菌菌株的培養性狀、菌體形態、染色反應、生理生化性狀等進行試驗，結果表明它們分別屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。由表4可見，金銀花尺蠖幼蟲腸道中各菌株存在的數量差別很大，其中葡萄球菌屬的數量最大，為6.59×1011個/mL。

表4 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌鑒定結果及存在數量

3 討論

與其他動物一樣，昆蟲與共生的腸道微生物之間建立了復雜的協同進化關系，其腸道系統為各種微生物提供適宜的生活環境，腸道微生物一方面幫助宿主昆蟲消化食物，為昆蟲提供各種營養物質，另一方面可以起著益生素的作用，調控腸道微生物區系本身之間的平衡，保證昆蟲健康。腸道微生物的類群和數量與昆蟲所取食的食物性質存在密切的關系，不同食性昆蟲腸道環境中的微生物菌株的種類和數量存在差別。如刺吸植物汁液的斑衣蠟蟬(Lycormadelicatula)成蟲消化道內存在有多黏芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)4種細菌，其中多黏芽孢桿菌數量最多[4]；取食動物性物品和食品的白腹皮蠹(Dermestesmaculatus)成蟲消化道內分布有堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、氣微菌屬(Aeromicrobium)、浸麻芽孢桿菌(Bacillusmacerans)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌和短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)6種細菌，以巨大芽孢桿菌數量最多[7]； 取食植物葉片或莖稈的沙漠蝗腸道中優勢菌群為腸桿菌屬和鏈球菌屬[16]。本試驗從金銀花尺蠖幼蟲腸道中分離鑒定出3種細菌，分別為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其中葡萄球菌屬的數量最大。金銀花尺蠖的食性單一，只取食危害金銀花等少數忍冬科植物，消化道對食物消化也比較單一，可能導致腸道中的細菌種類比較少。另外，金銀花是中藥材，含有抑菌作用的活性成分，其活性成分對金銀花尺蠖腸道細菌的影響還有待進一步研究。

為適應中藥材無公害生產的要求，今后還需進一步分析金銀花尺蠖幼蟲腸道主要細菌菌株的功能，并與食物的營養成分進行關聯分析，探討細菌菌群與金銀花尺蠖幼蟲的共生機制，從而通過人工方法改善和調節腸道微生物的微生態條件，調控金銀花尺蠖的生長發育，實現該蟲的生態控制。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.029

2015-11-21

安徽省高校省級自然科學研究項目(編號：KJ2012B123)；安徽省高等學校優秀青年人才基金(編號：2009SQRZ147)；國家級大學生創新創業訓練計劃(編號：201310377018)。

向玉勇(1974—)，男，湖南麻陽人，博士，副教授，主要從事資源昆蟲學及害蟲防治研究。E-mail：xyy10657@sohu.com。

S433.4

A

1002-1302(2017)02-0106-02

向玉勇，徐中秋，柴新義. 金銀花尺蠖幼蟲腸道細菌分離與鑒定[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：106-108.