龍牙百合花總黃酮提取工藝及抗氧化性

薛 梅， 李曉英， 周衛平

(1.重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶永川 402160； 2.重慶文理學院體育學院，重慶永川 402160)

龍牙百合花總黃酮提取工藝及抗氧化性

薛 梅1， 李曉英1， 周衛平2

(1.重慶文理學院林學與生命科學學院，重慶永川 402160； 2.重慶文理學院體育學院，重慶永川 402160)

以龍牙百合花為研究對象，優化超聲波法提取總黃酮工藝條件，并作抗氧化活性分析。在單因素試驗的基礎上采用正交試驗，研究乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度對總黃酮提取效果的影響并確定最佳工藝條件，對其體外抗氧化活性進行初步研究。結果表明，最佳工藝條件為提取溫度60 ℃，乙醇濃度60%，料液比1 g ∶5 mL，提取時間40 min，在此條件下，百合花總黃酮提取量為75.034 mg/g。由抗氧化試驗結果看出，龍牙百合花總黃酮提取液對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)的清除效果優于相同濃度的維生素C溶液，并且總體上差異顯著。

龍牙百合花；總黃酮；超聲波法；提取工藝；抗氧化

百合(Liliumspp.)為百合科(Liliacea)百合屬(Lilium)多年生草本植物。食用百合肉質鮮美，鱗莖中含有鉀、鈣、鋅、鐵、硒等13種礦質元素及多種維生素和18種氨基酸[1]，被譽為蔬菜中的珍品。龍牙百合(L.brownievar.viridulumBaker)是目前栽培面積較大的食用百合品種之一，主產于湖南省、江西省等地[2]。近年來重慶市部分區(縣)開始規模化種植龍牙百合，成為當地農民增收的重要途徑。農民在栽培食用百合時，通常將花蕾摘除以提高鱗莖產量。目前對食用百合的研究主要集中在食用部分鱗莖的加工利用上，對于其他非食用部位的開發和利用較少。百合花味甘，性平，無毒，具補中益氣、潤肺安神之功效，主治咳嗽、眩暈、夜寐不安、天瘡等癥，常吃可使人面部肌膚光潔細滑[3-4]。

黃酮類化合物(flavonoids)屬植物次級代謝產物，又名生物類黃酮(blonavonolds)、維生素P，常與維生素C伴存[5]。黃酮類化合物主要分為黃酮類、黃酮醇類，廣泛存在于果蔬、中草藥中，具有顯著的清除人體內自由基、抗衰老、抗癌變、調血脂、降血壓、消炎鎮痛、調節免疫等藥理保健功能[6]，是一類極具開發前景的天然有機抗氧化劑。針對龍牙百合相關次生代謝產物的開發和利用較落后的現狀，本研究以龍牙百合花為研究對象，以乙醇為提取劑，超聲輔助水浴提取百合花總黃酮，通過單因素試驗和正交試驗，選擇龍牙百合花總黃酮最佳提取工藝，并對其體外抗氧化活性進行初步研究，以期為龍牙百合的開發利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍牙百合花購于重慶市江津百合種植基地；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等化學藥品均為分析純；蕓香苷標準品，色譜純，純度≥98%(由中國藥品生物制品檢定研究院提供)。

1.2 主要儀器與設備

主要儀器與設備：HZT-A電子天平、RRH-200型高速多功能粉碎機、Q/BKYY31-2000電熱恒溫鼓風干燥箱、數控超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋、旋轉蒸發儀、UV-102PCS型紫外-可見分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 原材料的前處理 將龍牙百合花于60 ℃恒溫烘干，再粉碎并過60目篩，密封冷藏待用。

1.3.2 蕓香苷標準曲線的繪制 精確稱取5.0 mg蕓香苷標準品置于25 mL容量瓶內，加70%乙醇至刻度，搖勻，得到 0.2 mg/mL 蕓香苷溶液；精確量取0、1、2、3、4、5、6 mL蕓香苷溶液，分別置于25 mL容量瓶中，各加水至6 mL，分別加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min；加1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻放置6 min，加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，再加水至刻度，搖勻放置15 min，以相應的溶劑為空白對照，在510 nm波長處測定吸光度，以濃度(C)為橫坐標、吸光度(D510 nm)為縱坐標，得到的標準曲線方程為y=10.206x+0.007 5，r2=0.998 9。

1.3.3 樣品總黃酮的測定 稱取龍牙百合花瓣粉末2.5 g于250 mL具塞三角瓶中，根據不同提取條件，抽濾得到提取物，旋轉蒸發后溶解定容。根據蕓香苷標準曲線制作方法，測定總黃酮提取量。

1.3.4 單因素試驗 分別改變提取溫度(40～80 ℃)、乙醇濃度(50%～90%)、料液比[1 g ∶(10～50) mL]、提取時間(10～50 min)進行單因素多水平試驗，考察以上因素對龍牙百合花總黃酮提取量的影響。

1.3.5 正交試驗 根據單因素試驗結果，選定提取溫度(A)、乙醇濃度(B)、料液比(C)、提取時間(D)為考察因素，采用L9(34)正交表安排試驗，因素水平設置見表1。通過測定總黃酮提取量，優選最佳工藝條件。

表1 龍牙百合花總黃酮提取工藝L9(34)因素水平

1.3.6 方法重現性試驗 根據正交試驗結果，確定最佳提取方法和條件后，同時做5個平行試驗，計算相對標準偏差(RSD)。

1.3.7 抗氧化性研究 根據最優提取方法提取百合花總黃酮，按比例稀釋成不同濃度的溶液(0.010 0、0.012 5、0.016 7、0.025 0、0.050 0 mg/mL)進行1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)清除能力試驗。取2 mL稀釋后的各濃度百合花瓣提取液及2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用純溶劑作參比，于517 nm下測定吸光度，根據以下公式計算百合花黃酮提取液對DPPH自由基的清除率：

DPPH·清除率=[1-(D517 nm1-D517 nm2)/D517 nm0]×100%。

式中：D517 nm1為加提取液后DPPH溶液的吸光度；D517 nm2為提取液的吸光度；D517 nm0為未加提取液時DPPH溶液的吸光度。

以同樣的方法測定相同濃度維生素C溶液對DPPH·的清除能力，作為對照。

1.3.8 數據處理 數據采用Excel、SPSS 13.0軟件進行處理并作差異性分析。

2 結果與分析

2.1 提取溫度對龍牙百合花總黃酮提取量的影響

從圖1可以看出，在料液比為1 g ∶40 mL、乙醇濃度為70%、提取時間為30 min的條件下，總黃酮提取量隨著溫度的升高呈上升趨勢，但是到達一定溫度后，總黃酮提取量趨于穩定；在溫度為70、80 ℃時總黃酮提取量最高，與其他溫度處理差異顯著。從節約能源、效益綜合考慮，70 ℃為最佳提取溫度。

2.2 乙醇濃度對龍牙百合花總黃酮提取量的影響

由圖2可知，在料液比為1 g ∶40 mL、提取時間為 30 min、提取溫度為70 ℃的條件下，總黃酮提取量隨著乙醇濃度的升高大致呈現先升高后降低的趨勢；在乙醇濃度為70%時，總黃酮提取量最高，隨著乙醇濃度的繼續增加，總黃酮提取量逐漸降低，這可能與過高的乙醇濃度會導致更多的雜質析出，從而降低總黃酮的提取量有關[7]。由結果可知，提取總黃酮的最佳乙醇濃度為70%。

2.3 料液比對龍牙百合花總黃酮提取量的影響

由圖3可知，在提取溫度為70 ℃、乙醇濃度為70%、提取時間為30 min、不同料液比的條件下，隨著溶劑量的增大，龍牙百合花總黃酮提取量整體呈降低趨勢；在料液比為 1 g ∶10 mL 的條件下，總黃酮提取量最高。由結果可知，最佳料液比為1 g ∶10 mL。

2.4 提取時間對龍牙百合花總黃酮提取量的影響

在提取溫度為70 ℃、乙醇濃度為70%、料液比為 1 g ∶10 mL 的條件下，隨著提取時間的增加，總黃酮提取量呈現不斷增加的趨勢；當提取時間超過40 min后，再增加提取時間，總黃酮提取量變化不顯著(圖4)。從提取效果及節約時間的角度考慮，龍牙百合花總黃酮提取的最佳時間應控制在40 min。

2.5 正交試驗結果

由表2、表3可以看出，C(料液比)對總黃酮提取量的影響最大，其極差在4個因素中最大。經分析，料液比對總黃酮提取量的影響極顯著(P<0.01)，其他因素對總黃酮提取量的影響不顯著。R值越大，說明該因素的水平變動對試驗結果的影響越大，4個因素對龍牙百合花總黃酮提取量的影響順序為C(料液比)>B(提取劑濃度)>A(提取溫度)>D(提取時間)，最優水平為A1B1C1D2，即提取溫度為60 ℃、乙醇濃度為60%、料液比為1 g ∶5 mL、提取時間為40 min時，提取效果最好。

表2 4因素3水平正交試驗結果分析

表3 正交試驗結果的單變量方差分析結果

2.6 方法重現性試驗結果

根據最優提取方法，同時做5個平行樣品進行驗證試驗，測得總黃酮平均提取量為75.034 mg/g，相對標準偏差(RSD)為2.07%，提取物總黃酮提取量高于所有正交試驗結果，表明提取工藝穩定合理，重現性較好。

2.7 不同濃度龍牙百合花總黃酮提取液與維生素C的體外抗氧化能力比較

從圖5可以看出，在樣品濃度為0.010 0～0.050 0 mg/mL 的范圍內，龍牙百合花總黃酮提取液和維生素C溶液對DPPH·的清除效果均隨藥液濃度的升高而增加，且總黃酮提取液對DPPH·的清除率始終優于相同濃度下的維生素C溶液。經方差分析，龍牙百合花總黃酮提取液與維生素C在相同濃度下，對DPPH·的清除效果總體上差異顯著(P<0.05)。

3 結論與討論

本試驗以龍牙百合花為原料，采用超聲波輔助乙醇溶劑法提取龍牙百合花中有效成分黃酮，在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，確定最佳提取工藝。結果表明，影響龍牙百合

花總黃酮提取量的因素排序為料液比>提取劑濃度>提取溫度>提取時間；最佳工藝：提取溫度60 ℃，乙醇濃度60%，料液比1 g ∶5 mL，提取時間40 min。在優化的工藝條件下，總黃酮的提取量為75.034 mg/g。

體外抗氧化試驗研究中，以清除DPPH·較為常見的天然抗氧化劑維生素C為對照。結果表明，隨著濃度的增加，龍牙百合花總黃酮提取液和維生素C溶液對DPPH·的清除能力都呈逐漸增加的趨勢，龍牙百合花總黃酮提取液對 DPPH·的清除能力總體上顯著優于相同濃度的維生素C溶液，說明龍牙百合花總黃酮在體外具有較好的清除DPPH·的能力，但在人體內清除自由基的能力還需要進一步的研究。

料液比試驗結果表明，隨著料液比增加，總黃酮提取量呈逐漸下降的現象，這與其他研究結論不符[8-9]。這是由于料液比起始值(1 g ∶10 mL)選擇較大導致的，雖然在正交試驗中，選擇了較小的料液比(1 g ∶5 mL)，但從綜合試驗結果來看，料液比可能仍有較大的改善空間，這是今后進一步研究中應該注意的。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.054

2015-11-24

重慶市教委科研項目(編號：KJ1401129)。

薛 梅(1973—)，女，重慶人，碩士，實驗師，主要從事植物生理、植物種質資源開發與利用等研究。E-mail：xuemei.1998@163.com。

李曉英，碩士，副教授，研究方向為生物活性物質的提取與檢測。E-mail：lxyi2@126.com。

Q946-3；R284.2

A

1002-1302(2017)02-0182-03

薛 梅，李曉英，周衛平. 龍牙百合花總黃酮提取工藝及抗氧化性[J]. 江蘇農業科學，2017，45(2)：182-184.