以單細(xì)胞拉曼光譜為基礎(chǔ)的細(xì)胞乙醇應(yīng)激

滕 琳， 籍月彤

(1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所單細(xì)胞研究中心，山東青島 266101；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

以單細(xì)胞拉曼光譜為基礎(chǔ)的細(xì)胞乙醇應(yīng)激

滕 琳1，2， 籍月彤1

(1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所單細(xì)胞研究中心，山東青島 266101；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

生物乙醇被認(rèn)為是一種清潔的可再生能源，然而同時(shí)也是一種潛在的環(huán)境污染物。雖然目前關(guān)于細(xì)胞乙醇應(yīng)激的研究已經(jīng)非常廣泛，但是細(xì)胞為生命活動的基本單元，對單細(xì)胞層面的細(xì)胞應(yīng)激研究是非常必要的，有助于深化人們對單細(xì)胞進(jìn)化的認(rèn)識，然而目前在單細(xì)胞尺度進(jìn)行細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)研究的方法還是非常有限的。擬采用單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)，對細(xì)胞在不同濃度乙醇處理下進(jìn)行指紋圖譜的檢測，獲得其單細(xì)胞應(yīng)激的表型性狀。結(jié)果表明，在不同濃度乙醇處理30min的條件下，細(xì)胞可以非常靈敏地對外界刺激進(jìn)行反應(yīng)，主要表現(xiàn)在脂類、蛋白類拉曼譜峰的強(qiáng)度增強(qiáng)，以及表征核酸類物質(zhì)的拉曼峰強(qiáng)度下降；同時(shí)，由于在不同濃度乙醇作用下細(xì)胞的不同反應(yīng)，可以對細(xì)胞外環(huán)境中乙醇含量進(jìn)行預(yù)測。由研究結(jié)果可見，細(xì)胞乙醇應(yīng)激可以采用單細(xì)胞拉曼光譜進(jìn)行檢測，同時(shí)該技術(shù)還可以應(yīng)用在對環(huán)境中存在的乙醇含量的預(yù)測方面。

乙醇刺激；單細(xì)胞拉曼光譜(SCRS)；濃度預(yù)測

目前，我國的機(jī)動車總數(shù)已經(jīng)達(dá)到幾億輛的級別，汽車尾氣的排放對細(xì)顆粒物(PM2.5)的“貢獻(xiàn)”被認(rèn)為是一個(gè)不可忽視的因素。生物乙醇可以利用廢棄的秸稈或木質(zhì)纖維素進(jìn)行生產(chǎn)，不與人爭糧，被認(rèn)為是一種清潔的可再生能源，可以與汽油混合使用，能夠更好地利用烷烴，并且提供更高的燃燒熱量[1]。然而，對于環(huán)境或環(huán)境微生物而言，生物乙醇也是一種潛在的污染物。人們在研究如何利用微生物高效生產(chǎn)乙醇的同時(shí)，對細(xì)胞的乙醇耐受性也進(jìn)行了廣泛的研究，涵蓋基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝物組學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，所涉及的生物對象包括大腸桿菌[2-3]、酵母[4]及其他產(chǎn)乙醇的梭菌[5]，或整合生物加工(consolidated bioprocessing，簡稱CBP)發(fā)酵中的其他功能菌株等，如嗜熱纖維梭菌[6]，此外還有很多研究未在此一一列出。因此，本研究選擇細(xì)胞對乙醇的應(yīng)激具有廣泛的研究基礎(chǔ)。

鑒于單細(xì)胞研究在理解生物進(jìn)化及生命的環(huán)境適應(yīng)性方面的重要作用，單細(xì)胞拉曼光譜(SCRS)技術(shù)因無需標(biāo)記、快速簡便的特性已經(jīng)日益得到廣泛應(yīng)用。最近發(fā)表的1篇關(guān)于單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)在細(xì)胞應(yīng)激丁醇方面的研究[7]表明，拉曼光譜的數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)試驗(yàn)方法具有很高的相關(guān)性。但是關(guān)于細(xì)胞在單細(xì)胞水平的乙醇應(yīng)激研究目前尚未見報(bào)道。本研究立足于單細(xì)胞拉曼光譜的可靠性和不拘泥于群體水平研究的特點(diǎn)，旨在通過研究細(xì)胞對于不同濃度乙醇刺激的不同反應(yīng)，認(rèn)識細(xì)胞應(yīng)對外界環(huán)境中乙醇的代謝層面的變化，對于深刻理解細(xì)胞的乙醇應(yīng)激，以及對外界環(huán)境中存在的乙醇的檢測具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

本試驗(yàn)以大腸桿菌作為研究對象，因大腸桿菌具有豐富的研究背景、結(jié)構(gòu)簡單、缺乏免疫性、遺傳操作簡單，對其進(jìn)行乙醇的生產(chǎn)和耐受研究在廣度和深度上都是其他任何微生物所不能替代的。同時(shí)，大腸桿菌被認(rèn)為是刺激響應(yīng)的敏感體，由于其生長速度快，容易受到外界環(huán)境的影響，因此可以作為檢測污水污染程度的理想細(xì)胞[8]。

本試驗(yàn)采用的乙醇等藥品為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品；碘化丙啶(PI)購自Sigma，色譜純，純度≥94.0%。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中須要注意的是活化過程的一致性。因?yàn)槔庾V測量的嚴(yán)格性，細(xì)胞要經(jīng)過比較嚴(yán)格的活化過程：先將-80 ℃保種的大腸桿菌在LB平板上于37 ℃活化 16 h，然后將其轉(zhuǎn)接入2mL玻璃試管中，于37 ℃培養(yǎng)12 h后，再轉(zhuǎn)接入120 mL液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，進(jìn)行乙醇的刺激試驗(yàn)，試驗(yàn)中設(shè)置6個(gè)乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù))梯度：0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%，分別處理細(xì)胞30 min。此外，細(xì)胞在高濃度乙醇中的活性檢測通過傳統(tǒng)的碘化丙啶染色的方法進(jìn)行。

1.2 單細(xì)胞拉曼光譜的采集

受刺激的細(xì)胞在經(jīng)過0.5 h乙醇刺激后，進(jìn)行細(xì)胞收集，條件為5 200 r/min，2 min。用ddH2O輕輕吹打，洗滌3次后稀釋數(shù)百倍(使細(xì)胞能夠分散于視野中，以便進(jìn)行單細(xì)胞拉曼光譜的采集)；而后吸取1.5 μL稀釋的細(xì)胞懸液置于CaF2平板上，自然風(fēng)干后，立即采用強(qiáng)度100 mW、波長532 nm激光的拉曼系統(tǒng)進(jìn)行信號采集，每個(gè)圖譜采集時(shí)間10 s(照射于細(xì)胞上的激光光照度約為25 mW)。這部分的工作須要注意的事項(xiàng)：首先，細(xì)胞要盡量清洗干凈，不能因用力過猛而使細(xì)胞破碎；其次，風(fēng)干過程要盡量迅速，避免細(xì)胞過長時(shí)間暴露于干燥的環(huán)境中，導(dǎo)致細(xì)胞破裂死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析方法

采集到的單細(xì)胞拉曼光譜的處理，主要包括拉曼光譜的數(shù)據(jù)前處理和多變量分析。采集數(shù)據(jù)的形式：每個(gè)乙醇刺激濃度下設(shè)置3個(gè)生物學(xué)平行，每個(gè)平行測量20個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞，采集到的單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)共為6×3×20(即360個(gè)單細(xì)胞拉曼光譜)。

1.3.1 數(shù)據(jù)前處理 將以上得到的單細(xì)胞拉曼光譜通過Labspec 5軟件進(jìn)行去除背景操作(在每個(gè)生物學(xué)平行中，背景都隨機(jī)采集了3個(gè)，這里取其平均值)、Get Zero操作、基于面積的歸一化處理操作，使獲得的數(shù)據(jù)都進(jìn)行歸一化。

1.3.2 多變量數(shù)據(jù)分析 主要有主成分和線性判別分析(PC-LDA)、支持向量機(jī)分析(SVM)和相似性分析(ANOSIM)3種。主成分和線性判別分析是一種受監(jiān)督的多變量分析方法，這種方法的應(yīng)用能實(shí)現(xiàn)2個(gè)目的：(1)可直觀顯示各組別間有無明顯差異，此處PC-LDA的功能與人們熟知的主成分分析(PCA)是一致的，都可以將其分值進(jìn)行抽取、畫圖；(2)這種方法是一種受監(jiān)督的方法，能夠計(jì)算出2個(gè)組間差異的決定因素是什么，即差異的拉曼峰值是哪些。本試驗(yàn)中PC-LDA是在R 2.15.0版本中實(shí)現(xiàn)的。SVM分析包括2步：(1)通過訓(xùn)練數(shù)據(jù)集得到1個(gè)模型；(2)通過訓(xùn)練數(shù)據(jù)集構(gòu)建的模型來對測試數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)測。在第1步模型建立的時(shí)候有2個(gè)重要的參數(shù)：C、υ，這2個(gè)重要的參數(shù)都是由模型自動選擇的，選擇的標(biāo)準(zhǔn)是模型通過交叉檢驗(yàn)后錯(cuò)誤率最低時(shí)的參數(shù)選擇。相似性分析基于距離矩陣分析，能夠通過比較組內(nèi)、組間差異來解釋對照組和處理組之間的拉曼光譜的相似性大小。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與流程

本研究的總體策略如圖1-A所示，研究的定位主要依托于單細(xì)胞拉曼技術(shù)，以細(xì)胞應(yīng)對乙醇刺激為核心，基于乙醇濃度的變化，追蹤細(xì)胞表現(xiàn)的變化，通過考察不同濃度乙醇作用下的細(xì)胞反應(yīng)，不僅能夠反映單細(xì)胞拉曼技術(shù)的靈敏度，還能對細(xì)胞外在乙醇濃度進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測。

基于以上研究策略及“1.1”“1.2”“1.3”節(jié)中敘述的具體試驗(yàn)流程，繪制試驗(yàn)流程(圖1-B)。

筆者設(shè)置了“1.1”節(jié)中的一系列乙醇濃度梯度對細(xì)胞進(jìn)行刺激反應(yīng)，這部分工作預(yù)期實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)是單細(xì)胞拉曼光譜的靈敏性。設(shè)置未對細(xì)胞生長造成抑制的乙醇濃度，如0.5%、1.0%，但結(jié)果表明，即使是低濃度的乙醇刺激，細(xì)胞也會發(fā)生微小的代謝水平的變化(圖1-C)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拉曼光譜表征的不同乙醇濃度下的細(xì)胞反應(yīng)

筆者選擇了1種在R語言中可實(shí)現(xiàn)的、有監(jiān)督的、結(jié)合主成分分析的線性判別分析方法，來展示、區(qū)分和解析乙醇處理組的細(xì)胞可否與對照組細(xì)胞相區(qū)別，以及哪些關(guān)鍵的拉曼峰值對這種區(qū)別有貢獻(xiàn)。首先，通過拉曼光譜的比較發(fā)現(xiàn)，在乙醇刺激下，細(xì)胞的拉曼光譜之間是有差異的(圖2)。根據(jù)PC-LDA的結(jié)果(圖3-A)，筆者發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞與乙醇處理的細(xì)胞都依次在PC-LDA因子1的方向上區(qū)別開來；可是對于0.5%、1.0%乙醇處理的細(xì)胞，即在生長曲線上沒有顯著差異的乙醇處理下，在PC-LDA因子1的方向上與對照組細(xì)胞非常接近，幾乎聚在一起，但在PC-LDA因子3的方向上這3組細(xì)胞可以很明顯地區(qū)分開來；對于5.0%乙醇處理的細(xì)胞，在PC-LDA因子1的方向上與3.0%乙醇處理的細(xì)胞區(qū)分難度比較大，但在PC-LDA因子2的方向上的區(qū)分非常明顯。無論在低濃度或是高濃度的乙醇作用下，單細(xì)胞拉曼光譜主要變化的峰值位置如圖3-B所示，主要是表征核酸類物質(zhì)的拉曼峰值(783、812、1 481、1 575 cm-1等)處的降低，在脂類(1 448 cm-1)、蛋白類(1 002 cm-1)物質(zhì)處的拉曼峰值升高。說明細(xì)胞可能在應(yīng)對乙醇刺激時(shí)，細(xì)胞膜有增厚的趨勢，導(dǎo)致細(xì)胞中脂類明顯升高。此外，細(xì)胞內(nèi)核酸含量的減少，可能的原因是RNA的減少或是由于細(xì)胞體積增大而使得核酸呈現(xiàn)出稀釋的作用，這是使表征核酸類物質(zhì)的拉曼峰值降低的原因。

2.2 乙醇刺激下細(xì)胞的活性檢測

用乙醇對細(xì)胞進(jìn)行處理，從生長曲線角度來看，細(xì)胞生長變慢、細(xì)胞死亡也可能是細(xì)胞拉曼光譜發(fā)生變化的原因。因此，筆者主要對細(xì)胞在較高濃度乙醇(5.0%)處理下隨時(shí)間變化的活性來表征。結(jié)果表明，1 h的乙醇刺激對細(xì)胞活性幾乎沒有影響。從1 h的對照組、刺激組的PI染色結(jié)果(圖4-A)不難看出，在細(xì)胞死亡率方面，乙醇處理組的細(xì)胞并沒有比對照組細(xì)胞的死亡率(百分之幾的水平)明顯提高，證明1 h內(nèi)乙醇濃度為5.0%對于細(xì)胞活性沒有明顯傷害。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過5 h的乙醇處理時(shí)，細(xì)胞的死亡率略有升高，但總體來講細(xì)胞致死率不是很高(圖4-B)。本試驗(yàn)采用不同濃度的乙醇對細(xì)胞進(jìn)行處理，大部分乙醇濃度低于5.0%，且本試驗(yàn)中所采用的刺激時(shí)間很短，為0.5 h，所以基本可以忽略細(xì)胞活性受到乙醇影響。因此可以得出，細(xì)胞拉曼光譜的變化確實(shí)是在乙醇作用下細(xì)胞代謝層面的生理變化。

2.3 基于單細(xì)胞拉曼光譜的乙醇濃度預(yù)測

采集用不同濃度乙醇處理后各細(xì)胞的拉曼光譜，用多變量分析方法能夠?qū)ζ溥M(jìn)行區(qū)分。筆者采用SVM分析，將不同濃度乙醇處理下的單細(xì)胞拉曼光譜混在一起，并隨機(jī)抽取15個(gè)細(xì)胞作為測試數(shù)據(jù)集，剩余的45個(gè)細(xì)胞作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集。最終結(jié)果表明，經(jīng)過不同濃度乙醇處理的細(xì)胞都能夠?qū)崿F(xiàn)其各自組別90%以上的區(qū)分正確率(表1)。

此外，根據(jù)細(xì)胞的指紋光譜，比較乙醇處理組細(xì)胞與對照組細(xì)胞之間的差異，筆者采用相似性分析的方法(ANOSIM；基于Jensen-Shannon Divergence距離矩陣；permute=999)。這種相似性分析經(jīng)常被應(yīng)用于宏基因組分析中，但單細(xì)胞拉曼光譜由于其光譜峰值數(shù)量巨大而且不同組別含有大量不同的單個(gè)細(xì)胞等，很適合采用多變量方差分析的方法對拉曼數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，而相似性分析在計(jì)算處理組與對照組之間差異

表1 不同濃度乙醇刺激下細(xì)胞反應(yīng)的區(qū)分和預(yù)測結(jié)果

注：Pearson相關(guān)R2= 0.96。SVM用于預(yù)測，ANOSIM用于區(qū)分。

方面有特長。結(jié)果表明，采用低濃度乙醇處理的細(xì)胞與對照組細(xì)胞之間存在較為微小的差異(R值越接近0，證明差異越小；越接近1，證明差異越大)，但這種差異為極顯著差異(P<0.01)。說明采用低濃度的乙醇處理細(xì)胞，細(xì)胞拉曼光譜有明顯變化，但反應(yīng)程度較小；而采用較高濃度的乙醇處理細(xì)胞，如體積分?jǐn)?shù)為5.0%，細(xì)胞反應(yīng)極顯著而且劇烈(P<0.01；R=0.54)。同時(shí)，由相似性分析得到的細(xì)胞反應(yīng)程度(R值)與乙醇濃度之間呈現(xiàn)很強(qiáng)的線性相關(guān)(皮爾森系數(shù)為0.96)。這說明，根據(jù)細(xì)胞在不同濃度乙醇中的單細(xì)胞拉曼光譜變化情況，可以對細(xì)胞外環(huán)境中乙醇濃度進(jìn)行預(yù)測。與傳統(tǒng)的乙醇試劑盒相比，這種方法不僅可以提供乙醇的濃度信息，還能提供細(xì)胞代謝層面的變化信息。

3 結(jié)論

目前在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞的刺激反應(yīng)的方法是非常有限的，本研究中介紹的單細(xì)胞拉曼技術(shù)結(jié)合顯微操作技術(shù)，是一種非標(biāo)記的、不依賴于群體細(xì)胞的研究，并且其獨(dú)特的靈敏性使之具有更廣闊的應(yīng)用前景。在本研究中，以乙醇作為刺激物，通過設(shè)置一系列濃度的刺激，監(jiān)測不同濃度乙醇處理下細(xì)胞的單細(xì)胞拉曼光譜變化，從而對細(xì)胞的反應(yīng)進(jìn)行表征。通過結(jié)合多變量分析，使得單細(xì)胞拉曼光譜表征的細(xì)胞刺激反應(yīng)更具統(tǒng)計(jì)意義。但是，單細(xì)胞拉曼光譜表征細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)在精度上是有待提高的，不能精細(xì)地表征細(xì)胞內(nèi)特定成分的變化，須要與其他方法聯(lián)用。但本方法是一種新穎、獨(dú)特、靈敏的檢測細(xì)胞應(yīng)激乙醇的代謝物反應(yīng)，并且可以對胞外乙醇濃度進(jìn)行有效地預(yù)測，同時(shí)對其他環(huán)境刺激物的監(jiān)測也具有指導(dǎo)作用。

[1]BalatM，BalatH.Recenttrendsinglobalproductionandutilizationofbio-ethanolfuel[J].AppliedEnergy，2009，86(11)：2273-2282.

[2]SoufiB，KrugK，HarstA，etal.CharacterizationoftheE. coliproteomeanditsmodificationsduringgrowthandethanolstress[J].FrontiersinMicrobiology，2015，6(2)：218-222.

[3]ChongHQ，HuangL，YeowJW，etal.ImprovingethanoltoleranceofEscherichia colibyrewiringitsglobalregulatorcAMPreceptorprotein(CRP)[J].PLoSOne，2013，8(2)：e57628.

[4]KasaviC，EraslanS，ArgaKY，etal.AsystembasednetworkapproachtoethanoltoleranceinSaccharomyces cerevisiae[J].BMCSystemsBiology，2014，8(1)：22536-22553.

[5]LinL，JiYT，TuQC，etal.MicroevolutionfromshocktoadaptationrevealedstrategiesimprovingethanoltoleranceandproductioninThermoanaerobacter[J].BiotechnologyforBiofuels，2013(6)：103.

[6]YangHS，GiannoneRJ，DiceL，etal. Clostridium thermocellumATCC27405transcriptomic，metabolomicandproteomicprofilesafterethanolstress[J].BMCGenomics，2012，13(1)：1-17.

[7]ZuTNK，AthamnehAIM，WallaceRS，etal.Near-real-timeanalysisofthephenotypicresponsesofEscherichia colito1-butanolexposureusingRamanspectroscopy[J].JournalofBacteriology，2014，196(23)：3983-3991.

[8]LongF，ZhuA，ShiHC.Recentadvancesinopticalbiosensorsforenvironmentalmonitoringandearlywarning[J].Sensors，2013，13(10)：13928-13948.

10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.073

2015-12-04

國家自然科學(xué)基金(編號：91231205)。

滕 琳(1985—)，女，河北保定人，博士研究生，從事微生物遺傳分析研究。E-mail：tenglin@qibebt.ac.cn。

籍月彤，碩士，副研究員，從事單細(xì)胞拉曼技術(shù)應(yīng)用開發(fā)。E-mail：jiyt@qibebt.ac.cn。

Q256

A

1002-1302(2017)02-0262-03

滕 琳，籍月彤. 以單細(xì)胞拉曼光譜為基礎(chǔ)的細(xì)胞乙醇應(yīng)激[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(2)：262-264，284.