以單細胞拉曼光譜為基礎的細胞乙醇應激

滕 琳， 籍月彤

(1.中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞研究中心，山東青島 266101；2.中國科學院大學，北京100049)

以單細胞拉曼光譜為基礎的細胞乙醇應激

滕 琳1，2， 籍月彤1

(1.中國科學院青島生物能源與過程研究所單細胞研究中心，山東青島 266101；2.中國科學院大學，北京100049)

生物乙醇被認為是一種清潔的可再生能源，然而同時也是一種潛在的環(huán)境污染物。雖然目前關于細胞乙醇應激的研究已經(jīng)非常廣泛，但是細胞為生命活動的基本單元，對單細胞層面的細胞應激研究是非常必要的，有助于深化人們對單細胞進化的認識，然而目前在單細胞尺度進行細胞應激反應研究的方法還是非常有限的。擬采用單細胞拉曼光譜技術，對細胞在不同濃度乙醇處理下進行指紋圖譜的檢測，獲得其單細胞應激的表型性狀。結果表明，在不同濃度乙醇處理30min的條件下，細胞可以非常靈敏地對外界刺激進行反應，主要表現(xiàn)在脂類、蛋白類拉曼譜峰的強度增強，以及表征核酸類物質(zhì)的拉曼峰強度下降；同時，由于在不同濃度乙醇作用下細胞的不同反應，可以對細胞外環(huán)境中乙醇含量進行預測。由研究結果可見，細胞乙醇應激可以采用單細胞拉曼光譜進行檢測，同時該技術還可以應用在對環(huán)境中存在的乙醇含量的預測方面。

乙醇刺激；單細胞拉曼光譜(SCRS)；濃度預測

目前，我國的機動車總數(shù)已經(jīng)達到幾億輛的級別，汽車尾氣的排放對細顆粒物(PM2.5)的“貢獻”被認為是一個不可忽視的因素。生物乙醇可以利用廢棄的秸稈或木質(zhì)纖維素進行生產(chǎn)，不與人爭糧，被認為是一種清潔的可再生能源，可以與汽油混合使用，能夠更好地利用烷烴，并且提供更高的燃燒熱量[1]。然而，對于環(huán)境或環(huán)境微生物而言，生物乙醇也是一種潛在的污染物。人們在研究如何利用微生物高效生產(chǎn)乙醇的同時，對細胞的乙醇耐受性也進行了廣泛的研究，涵蓋基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學以及代謝物組學的各個領域，所涉及的生物對象包括大腸桿菌[2-3]、酵母[4]及其他產(chǎn)乙醇的梭菌[5]，或整合生物加工(consolidated bioprocessing，簡稱CBP)發(fā)酵中的其他功能菌株等，如嗜熱纖維梭菌[6]，此外還有很多研究未在此一一列出。因此，本研究選擇細胞對乙醇的應激具有廣泛的研究基礎。

鑒于單細胞研究在理解生物進化及生命的環(huán)境適應性方面的重要作用，單細胞拉曼光譜(SCRS)技術因無需標記、快速簡便的特性已經(jīng)日益得到廣泛應用。最近發(fā)表的1篇關于單細胞拉曼光譜技術在細胞應激丁醇方面的研究[7]表明，拉曼光譜的數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)試驗方法具有很高的相關性。但是關于細胞在單細胞水平的乙醇應激研究目前尚未見報道。本研究立足于單細胞拉曼光譜的可靠性和不拘泥于群體水平研究的特點，旨在通過研究細胞對于不同濃度乙醇刺激的不同反應，認識細胞應對外界環(huán)境中乙醇的代謝層面的變化，對于深刻理解細胞的乙醇應激，以及對外界環(huán)境中存在的乙醇的檢測具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

本試驗以大腸桿菌作為研究對象，因大腸桿菌具有豐富的研究背景、結構簡單、缺乏免疫性、遺傳操作簡單，對其進行乙醇的生產(chǎn)和耐受研究在廣度和深度上都是其他任何微生物所不能替代的。同時，大腸桿菌被認為是刺激響應的敏感體，由于其生長速度快，容易受到外界環(huán)境的影響，因此可以作為檢測污水污染程度的理想細胞[8]。

本試驗采用的乙醇等藥品為國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品；碘化丙啶(PI)購自Sigma，色譜純，純度≥94.0%。

在細胞培養(yǎng)過程中須要注意的是活化過程的一致性。因為拉曼光譜測量的嚴格性，細胞要經(jīng)過比較嚴格的活化過程：先將-80 ℃保種的大腸桿菌在LB平板上于37 ℃活化 16 h，然后將其轉(zhuǎn)接入2mL玻璃試管中，于37 ℃培養(yǎng)12 h后，再轉(zhuǎn)接入120 mL液體LB培養(yǎng)基中進行擴培，進行乙醇的刺激試驗，試驗中設置6個乙醇濃度(體積分數(shù))梯度：0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%，分別處理細胞30 min。此外，細胞在高濃度乙醇中的活性檢測通過傳統(tǒng)的碘化丙啶染色的方法進行。

1.2 單細胞拉曼光譜的采集

受刺激的細胞在經(jīng)過0.5 h乙醇刺激后，進行細胞收集，條件為5 200 r/min，2 min。用ddH2O輕輕吹打，洗滌3次后稀釋數(shù)百倍(使細胞能夠分散于視野中，以便進行單細胞拉曼光譜的采集)；而后吸取1.5 μL稀釋的細胞懸液置于CaF2平板上，自然風干后，立即采用強度100 mW、波長532 nm激光的拉曼系統(tǒng)進行信號采集，每個圖譜采集時間10 s(照射于細胞上的激光光照度約為25 mW)。這部分的工作須要注意的事項：首先，細胞要盡量清洗干凈，不能因用力過猛而使細胞破碎；其次，風干過程要盡量迅速，避免細胞過長時間暴露于干燥的環(huán)境中，導致細胞破裂死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析方法

采集到的單細胞拉曼光譜的處理，主要包括拉曼光譜的數(shù)據(jù)前處理和多變量分析。采集數(shù)據(jù)的形式：每個乙醇刺激濃度下設置3個生物學平行，每個平行測量20個獨立的細胞，采集到的單細胞拉曼光譜數(shù)據(jù)共為6×3×20(即360個單細胞拉曼光譜)。

1.3.1 數(shù)據(jù)前處理 將以上得到的單細胞拉曼光譜通過Labspec 5軟件進行去除背景操作(在每個生物學平行中，背景都隨機采集了3個，這里取其平均值)、Get Zero操作、基于面積的歸一化處理操作，使獲得的數(shù)據(jù)都進行歸一化。

1.3.2 多變量數(shù)據(jù)分析 主要有主成分和線性判別分析(PC-LDA)、支持向量機分析(SVM)和相似性分析(ANOSIM)3種。主成分和線性判別分析是一種受監(jiān)督的多變量分析方法，這種方法的應用能實現(xiàn)2個目的：(1)可直觀顯示各組別間有無明顯差異，此處PC-LDA的功能與人們熟知的主成分分析(PCA)是一致的，都可以將其分值進行抽取、畫圖；(2)這種方法是一種受監(jiān)督的方法，能夠計算出2個組間差異的決定因素是什么，即差異的拉曼峰值是哪些。本試驗中PC-LDA是在R 2.15.0版本中實現(xiàn)的。SVM分析包括2步：(1)通過訓練數(shù)據(jù)集得到1個模型；(2)通過訓練數(shù)據(jù)集構建的模型來對測試數(shù)據(jù)集進行預測。在第1步模型建立的時候有2個重要的參數(shù)：C、υ，這2個重要的參數(shù)都是由模型自動選擇的，選擇的標準是模型通過交叉檢驗后錯誤率最低時的參數(shù)選擇。相似性分析基于距離矩陣分析，能夠通過比較組內(nèi)、組間差異來解釋對照組和處理組之間的拉曼光譜的相似性大小。

1.4 試驗設計與流程

本研究的總體策略如圖1-A所示，研究的定位主要依托于單細胞拉曼技術，以細胞應對乙醇刺激為核心，基于乙醇濃度的變化，追蹤細胞表現(xiàn)的變化，通過考察不同濃度乙醇作用下的細胞反應，不僅能夠反映單細胞拉曼技術的靈敏度，還能對細胞外在乙醇濃度進行準確預測。

基于以上研究策略及“1.1”“1.2”“1.3”節(jié)中敘述的具體試驗流程，繪制試驗流程(圖1-B)。

筆者設置了“1.1”節(jié)中的一系列乙醇濃度梯度對細胞進行刺激反應，這部分工作預期實現(xiàn)的目標是單細胞拉曼光譜的靈敏性。設置未對細胞生長造成抑制的乙醇濃度，如0.5%、1.0%，但結果表明，即使是低濃度的乙醇刺激，細胞也會發(fā)生微小的代謝水平的變化(圖1-C)。

2 結果與分析

2.1 拉曼光譜表征的不同乙醇濃度下的細胞反應

筆者選擇了1種在R語言中可實現(xiàn)的、有監(jiān)督的、結合主成分分析的線性判別分析方法，來展示、區(qū)分和解析乙醇處理組的細胞可否與對照組細胞相區(qū)別，以及哪些關鍵的拉曼峰值對這種區(qū)別有貢獻。首先，通過拉曼光譜的比較發(fā)現(xiàn)，在乙醇刺激下，細胞的拉曼光譜之間是有差異的(圖2)。根據(jù)PC-LDA的結果(圖3-A)，筆者發(fā)現(xiàn)，對照組細胞與乙醇處理的細胞都依次在PC-LDA因子1的方向上區(qū)別開來；可是對于0.5%、1.0%乙醇處理的細胞，即在生長曲線上沒有顯著差異的乙醇處理下，在PC-LDA因子1的方向上與對照組細胞非常接近，幾乎聚在一起，但在PC-LDA因子3的方向上這3組細胞可以很明顯地區(qū)分開來；對于5.0%乙醇處理的細胞，在PC-LDA因子1的方向上與3.0%乙醇處理的細胞區(qū)分難度比較大，但在PC-LDA因子2的方向上的區(qū)分非常明顯。無論在低濃度或是高濃度的乙醇作用下，單細胞拉曼光譜主要變化的峰值位置如圖3-B所示，主要是表征核酸類物質(zhì)的拉曼峰值(783、812、1 481、1 575 cm-1等)處的降低，在脂類(1 448 cm-1)、蛋白類(1 002 cm-1)物質(zhì)處的拉曼峰值升高。說明細胞可能在應對乙醇刺激時，細胞膜有增厚的趨勢，導致細胞中脂類明顯升高。此外，細胞內(nèi)核酸含量的減少，可能的原因是RNA的減少或是由于細胞體積增大而使得核酸呈現(xiàn)出稀釋的作用，這是使表征核酸類物質(zhì)的拉曼峰值降低的原因。

2.2 乙醇刺激下細胞的活性檢測

用乙醇對細胞進行處理，從生長曲線角度來看，細胞生長變慢、細胞死亡也可能是細胞拉曼光譜發(fā)生變化的原因。因此，筆者主要對細胞在較高濃度乙醇(5.0%)處理下隨時間變化的活性來表征。結果表明，1 h的乙醇刺激對細胞活性幾乎沒有影響。從1 h的對照組、刺激組的PI染色結果(圖4-A)不難看出，在細胞死亡率方面，乙醇處理組的細胞并沒有比對照組細胞的死亡率(百分之幾的水平)明顯提高，證明1 h內(nèi)乙醇濃度為5.0%對于細胞活性沒有明顯傷害。當細胞經(jīng)過5 h的乙醇處理時，細胞的死亡率略有升高，但總體來講細胞致死率不是很高(圖4-B)。本試驗采用不同濃度的乙醇對細胞進行處理，大部分乙醇濃度低于5.0%，且本試驗中所采用的刺激時間很短，為0.5 h，所以基本可以忽略細胞活性受到乙醇影響。因此可以得出，細胞拉曼光譜的變化確實是在乙醇作用下細胞代謝層面的生理變化。

2.3 基于單細胞拉曼光譜的乙醇濃度預測

采集用不同濃度乙醇處理后各細胞的拉曼光譜，用多變量分析方法能夠?qū)ζ溥M行區(qū)分。筆者采用SVM分析，將不同濃度乙醇處理下的單細胞拉曼光譜混在一起，并隨機抽取15個細胞作為測試數(shù)據(jù)集，剩余的45個細胞作為訓練數(shù)據(jù)集。最終結果表明，經(jīng)過不同濃度乙醇處理的細胞都能夠?qū)崿F(xiàn)其各自組別90%以上的區(qū)分正確率(表1)。

此外，根據(jù)細胞的指紋光譜，比較乙醇處理組細胞與對照組細胞之間的差異，筆者采用相似性分析的方法(ANOSIM；基于Jensen-Shannon Divergence距離矩陣；permute=999)。這種相似性分析經(jīng)常被應用于宏基因組分析中，但單細胞拉曼光譜由于其光譜峰值數(shù)量巨大而且不同組別含有大量不同的單個細胞等，很適合采用多變量方差分析的方法對拉曼數(shù)據(jù)進行分析，而相似性分析在計算處理組與對照組之間差異

表1 不同濃度乙醇刺激下細胞反應的區(qū)分和預測結果

注：Pearson相關R2= 0.96。SVM用于預測，ANOSIM用于區(qū)分。

方面有特長。結果表明，采用低濃度乙醇處理的細胞與對照組細胞之間存在較為微小的差異(R值越接近0，證明差異越小；越接近1，證明差異越大)，但這種差異為極顯著差異(P<0.01)。說明采用低濃度的乙醇處理細胞，細胞拉曼光譜有明顯變化，但反應程度較小；而采用較高濃度的乙醇處理細胞，如體積分數(shù)為5.0%，細胞反應極顯著而且劇烈(P<0.01；R=0.54)。同時，由相似性分析得到的細胞反應程度(R值)與乙醇濃度之間呈現(xiàn)很強的線性相關(皮爾森系數(shù)為0.96)。這說明，根據(jù)細胞在不同濃度乙醇中的單細胞拉曼光譜變化情況，可以對細胞外環(huán)境中乙醇濃度進行預測。與傳統(tǒng)的乙醇試劑盒相比，這種方法不僅可以提供乙醇的濃度信息，還能提供細胞代謝層面的變化信息。

3 結論

目前在單細胞水平研究細胞的刺激反應的方法是非常有限的，本研究中介紹的單細胞拉曼技術結合顯微操作技術，是一種非標記的、不依賴于群體細胞的研究，并且其獨特的靈敏性使之具有更廣闊的應用前景。在本研究中，以乙醇作為刺激物，通過設置一系列濃度的刺激，監(jiān)測不同濃度乙醇處理下細胞的單細胞拉曼光譜變化，從而對細胞的反應進行表征。通過結合多變量分析，使得單細胞拉曼光譜表征的細胞刺激反應更具統(tǒng)計意義。但是，單細胞拉曼光譜表征細胞應激反應在精度上是有待提高的，不能精細地表征細胞內(nèi)特定成分的變化，須要與其他方法聯(lián)用。但本方法是一種新穎、獨特、靈敏的檢測細胞應激乙醇的代謝物反應，并且可以對胞外乙醇濃度進行有效地預測，同時對其他環(huán)境刺激物的監(jiān)測也具有指導作用。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.073

2015-12-04

國家自然科學基金(編號：91231205)。

滕 琳(1985—)，女，河北保定人，博士研究生，從事微生物遺傳分析研究。E-mail：tenglin@qibebt.ac.cn。

籍月彤，碩士，副研究員，從事單細胞拉曼技術應用開發(fā)。E-mail：jiyt@qibebt.ac.cn。

Q256

A

1002-1302(2017)02-0262-03

滕 琳，籍月彤. 以單細胞拉曼光譜為基礎的細胞乙醇應激[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45(2)：262-264，284.