血紅素加氧酶-1對哮喘小鼠Treg細胞和Th17細胞平衡的影響

楊欣，張慶，張艷萍，魏曉曄，姬亞梅

(1.榆林市兒童醫院兒科，陜西 榆林 719000；2.榆林市星元醫院兒科，陜西 榆林 719000)

血紅素加氧酶-1對哮喘小鼠Treg細胞和Th17細胞平衡的影響

楊欣1，張慶2，張艷萍2，魏曉曄2，姬亞梅2

(1.榆林市兒童醫院兒科，陜西 榆林 719000；2.榆林市星元醫院兒科，陜西 榆林 719000)

目的探討血紅素加氧酶-1(HO-1)對哮喘小鼠Treg細胞和Th17細胞平衡的影響，闡述HO-1的免疫調節作用。方法60只雌性BALB/c小鼠按數字表法隨機分為正常組、哮喘組、高鐵氯化血紅素(Hemin)組、錫-原卟啉(SnPP)組、Hemin+siRNA scramble組和Hemin+siRNA HO-1組，每組10只。通過注射和霧化吸入雞卵蛋白(OVA)制備哮喘模型，正常組以生理鹽水代替致敏液。Hemin組和SnPP組分別腹腔注射Hemin或SnPP 75 μmol/kg，Hemin+ siRNA scramble組和Hemin+siRNA HO-1組分別在腹腔注射Hemin前轉染pSicoR-GFP-siRNA scramble或pSicoR-GFP-siRNA HO-1。末次激發后24 h內，Western blot和比色法分別檢測各組小鼠肺部組織中HO-1蛋白表達和HO-1活性；HE染色觀察肺部組織病理變化；流式細胞術檢測外周血中Treg細胞、Th17細胞占CD4+T細胞的百分比，ELISA法檢測血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-10、IL-17的水平。結果與正常組相比，哮喘組小鼠肺部HO-1表達和活性有所增加，炎性反應明顯，Treg/CD4+T細胞的百分比和IL-10水平顯著降低，Th17/CD4+T細胞的百分比和IL-17水平顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)。與哮喘組相比，Hemin組明顯增加HO-1表達和活性，減少肺部組織炎性反應，增加Treg/CD4+T細胞的百分比和IL-10水平，降低Th17/CD4+T細胞的百分比和IL-17水平，而SnPP組沒有明顯變化。與Hemin組相比，Hemin+siRNA HOv1組肺部組織中HO-1表達和活性降低，炎性反應增加，Treg/CD4+T細胞的百分比和IL-10水平降低，Th17/CD4+T細胞的百分比和IL-17水平增加，差異具有統計學意義(P＜0.05)。結論增加HO-1的表達和活性能夠明顯改善哮喘小鼠炎性反應，增加Treg細胞的數目并促進IL-10的產生，同時抑制Th17細胞的表達及IL-17的產生。

血紅素加氧酶-1；哮喘；CD4+CD25+調節性T細胞；Th17細胞

近年來，世界各國的支氣管哮喘(簡稱哮喘)發病率均有顯著上升[1]，同時兒童的哮喘患病率也逐年攀升，嚴重影響兒童的健康成長[2]。研究表明T細胞的免疫失衡參與了哮喘氣道炎癥的發生同時占據了重要作用[3]。CD4+CD25+調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)以及Th17細胞是獨立的CD4+T細胞亞群，Treg細胞能夠維持機體免疫穩態并且抑制針對自身抗原的異常免疫反應，通過與其他細胞直接接觸和/或分泌一些抑制性的細胞因子如TGF-β、IL-10等發揮免疫負調控的作用[4]。Th17細胞分泌的IL-17在炎性反應以及免疫調節中發揮著重要的作用[5]。Treg細胞和Th17細胞之間平衡紊亂已成為研究哮喘免疫損傷的新熱點，調節哮喘患者的免疫功能或將成為治療哮喘更為有效的發展方向。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是哺乳動物和人體內血紅素代謝途徑中的限速酶，在體內免疫系統激活及免疫反應中發揮重要作用[6]。因此，本研究通過建立哮喘小鼠動物模型，探討Treg與Th17細胞在哮喘發病中的變化，并觀察HO-1對其平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級BALB/c雌性小鼠，6周齡，體質量(20±2)g，購于河南省實驗動物中心[許可證號：SCXK(豫)2010-0002]。采用隨機數字表示法分6組，每組10只，分籠飼養，給予不含致敏原的特殊飼料喂養。

1.2 實驗試劑 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)、高鐵氯化血紅素(hemin)和錫-原卟啉(tin protoporphyrin IX，SnPP)購自美國Sigma公司；蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色試劑盒和血紅素加氧酶-1活性比色法定量檢測試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司；小鼠IL-17 ELISA試劑盒、小鼠IL-10 ELISA試劑盒購自美國Biolegend公司；抗小鼠HO-1抗體、FITC-anti-CD4抗體、APC-anti-CD25抗體、PE-anti-Foxp3抗體和PE-Cy7-anti-IL-17抗體均購自美國Invitrogen公司。

1.3 動物模型制備與分組 按照數字表法隨機將60只SPF級BALB/c雌性小鼠均分為正常組、哮喘組、Hemin組、SnPP組、Hemin+siRNA scramble組和Hemin+siRNA HO-1組，每組10只。除正常組小鼠之外的每組小鼠分別于實驗第1、8、15天腹腔注射0.2 mL雞卵蛋白和氫氧化鋁混合液(含雞卵蛋白100 μg，氫氧化鋁2 mg)；第22天開始，連續5 d，每天吸入2%雞卵蛋白進行霧化30 min，制備哮喘模型；另外，Hemin組和SnPP組分別于第1次霧化致敏前連續2 d，每天1次腹腔注射Hemin或SnPP 75 μmol/kg，Hemin+siRNA scramble組和Hemin+siRNAHO-1組分別于腹腔注射Hemin前1 d經尾靜脈注射200 μL已經構建并鑒定的慢病毒載體 pSicoR-GFP-siRNA scramble或 pSicoR-GFP-siRNA HO-1。正常組腹腔注射和霧化均以生理鹽水代替。

1.4 小鼠肺部組織HO-1表達檢測 采用Western blot檢測。分離各組小鼠200 μg左肺組織并提取總蛋白，采用BCA法定量蛋白濃度。每組各取樣本量30 μg，7.5%SDS-PAGE電泳分離蛋白并移至PVDF膜，置于新鮮配制的含5%BSA的TBST液中室溫封閉1 h，加入抗小鼠HO-1抗體(1:1 000)和兔抗大鼠β-actin抗體(1:1 000)，4°C反應過夜；用TBST液洗膜3次，每次5 min，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗孵育；ECL顯影，BandScan 5.0凝膠電泳圖像分析軟件行條帶灰度掃描，以β-actin為內參照對HO-1進行灰度值半定量分析。重復3次，取均值。

1.5 小鼠肺部組織HO-1活性檢測 按照組織HO-1活性比色法定量檢測試劑盒說明書步驟檢測各組小鼠肺部組織中HO-1活性。

1.6 小鼠肺部組織HE染色 末次霧化激發結束后24 h內各組小鼠以吸入乙醚進行麻醉，開胸，分離肺動脈，制備4 μm厚度切片。隨機選取每組小鼠肺組織3張石蠟切片，脫蠟后進行HE染色，每張切片隨機選取5個以上高倍鏡視野觀察支氣管壁的形態學改變。

1.7 Treg細胞和Th17細胞檢測 采用流式細胞儀檢測。取各組小鼠100 μL外周血置于流式管中，依次加入4 mL紅細胞裂解液和4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，離心去上清后計數。稀釋配制每管含1×106個細胞的細胞懸液，加入100 μL含FITC-anti-CD4抗體和APC-anti-CD25抗體的流式染色液，混合均勻，4℃避光孵育30 min。洗滌，破膜，固定后每管加入100 μL含有PE-anti-Foxp3抗體的1×破膜液或者含有PECy7-anti-IL-17抗體的1×破膜液，4℃避光孵育30 min，加3 mL PBS，4℃條件下1 500 r/min離心5 min，棄上清，用500 μL 2%的多聚甲醛固定后分別檢測各組小鼠外周血Treg細胞和Th17細胞比例。

1.8 小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-17、IL-10水平檢測 采用ELISA檢測。末次霧化激發結束后24 h內將各組小鼠以吸入乙醚麻醉處死，氣管切開后，留置針置入，縫線固定，以0.75 mL PBS灌洗，反復2次，回收率80%～90%，3 000 r/min離心5 min，收集其上清液，即為小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)。采用ELISA試劑盒進行各組小鼠血清和BALF中IL-17和IL-10水平檢測。

1.9 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析，組間數據兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hemin誘導小鼠肺部組織中HO-1表達以及活性 與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠肺部組織中HO-1表達和活性升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；與哮喘組小鼠相比，Hemin組小鼠肺部組織中HO-1表達和活性顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，SnPP組小鼠肺部組織中HO-1表達雖然顯著增多，但活性顯著受到抑制；與Hemin組小鼠相比，Hemin+siRNA HO-1組小鼠肺部組織中HO-1表達和活性顯著受到抑制，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖1和圖2。

2.2 各組小鼠肺部組織病理學觀察 與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠肺部組織氣道周圍分布有大量炎癥細胞，氣道上皮細胞脫落，分泌粘液增多，氣道管壁顯著增厚；與哮喘組小鼠相比，Hemin組小鼠氣道壁厚度明顯減小，炎癥細胞大量減少，SnPP組與哮喘組無明顯差異；與Hemin組小鼠相比，Hemin+siRNA HO-1組小鼠氣道壁厚度增加，炎癥細胞明顯較多，見圖3。

圖1 各組小鼠肺部組織中HO-1蛋白表達量

圖2 各組小鼠肺組織中HO-1酶活性

圖3 各組小鼠肺部組織HE染色(×400)

2.3 各組小鼠外周血中Treg細胞和Th17細胞比例 與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠Treg/CD4+T細胞的百分比顯著降低，Th17/CD4+T細胞的百分比顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；與哮喘組小鼠相比，Hemin組小鼠Treg/CD4+T細胞的百分比明顯升高，Th17/CD4+T細胞的百分比顯著降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，SnPP組與哮喘組相比無明顯差異，不具有統計學意義；與Hemin組小鼠相比，Hemin+ siRNA HO-1組小鼠Treg/CD4+T細胞的百分比顯著降低，Th17/CD4+T細胞的百分比顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表1、圖4和圖5。

表1 各組小鼠外周血Treg及Th17細胞數目(±s)

表1 各組小鼠外周血Treg及Th17細胞數目(±s)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05；與Hemin組比較，cP＜0.05。

組別Treg/CD4+(%)Th17/CD4+T(%)正常組(n=10)哮喘組(n=10) Hemin組(n=10) SnPP組(n=10) Hemin+siRNAscramble組(n=10) Hemin+siRNAHO-1組(n=10) F值P值4.98±0.36 3.01±0.29a4.78±0.43b3.09±0.15 4.82±0.23 3.28±0.21c1 423.846 0.000 2.86±0.44 4.23±0.51a2.64±0.45b4.19±0.36 2.61±0.39 4.10±0.35c1 328.107 0.000

圖4 各組小鼠外周血Treg細胞水平

圖5 各組小鼠外周血Th17細胞水平

2.4 各組小鼠血清和BALF中IL-17、IL-10的水平 與正常組小鼠相比，哮喘組小鼠血清和BALF中IL-10水平顯著降低，IL-17水平顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)；與哮喘組小鼠相比，Hemin組小鼠血清和BALF中IL-10水平明顯升高，IL-17水平明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，SnPP組與哮喘組相比無明顯差異，不具有統計學意義；與Hemin組小鼠相比，Hemin+siRNA HO-1組小鼠血清和BALF中IL-10水平顯著降低，IL-17水平顯著升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 各組小鼠BALF和血清中IL-10、IL-17水平(±s，pg/mL)

表2 各組小鼠BALF和血清中IL-10、IL-17水平(±s，pg/mL)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05與Hemin組比較，cP＜0.05。

組別IL-10IL-17 BALF 血清BALF 血清正常組(n=10)哮喘組(n=10) Hemin組(n=10) SnPP組(n=10) Hemin+siRNAscramble組(n=10) Hemin+siRNAHO-1組(n=10) F值P值50.7±9.6 25.9±5.2a38.5±4.1b25.7±4.7 38.2±2.9 26.1±4.5c5 10.870 0.000 62.5±12.7 32.7±10.4a45.9±8.5b31.9±9.5 45.5±7.2 33.1±9.8c386.269 0.000 4.4±0.9 19.5±0.5a11.7±0.7b18.6±0.4 11.3±0.5 18.6±0.2c592.167 0.000 9.7±1.3 22.8±5.4a15.6±2.4b21.7±4.5 15.3±1.8 21.8±4.9b479.184 0.000

3 討論

HO-1是一種具有廣泛調節作用的蛋白，參與各種免疫相關性人類疾病和動物模型中免疫保護作用[7]。通常情況下，HO-1在大多數組織細胞中呈現低水平表達，但在應激情況下HO-1的表達顯著升高[8]。在本研究中發現，哮喘組小鼠肺部組織中HO-1較正常組略微升高，推測該現象可能是機體防止過度炎癥對機體傷害而產生的免疫保護作用。Hemin是HO-1的底物，能顯著誘導HO-1蛋白表達并增強其活性；SnPP則是HO-1的競爭性抑制劑，雖能誘導HO-1蛋白表達但是同時抑制其活性。因此Western blot和比色法結果顯示Hemin明顯上調HO-1的表達和活性，而SnPP僅僅誘導HO-1的表達并不增加HO-1活性。同時HE染色結果顯示，上調HO-1表達并增強其活性的Hemin處理哮喘小鼠明顯改善了小鼠肺部組織炎癥反應，僅誘導HO-1高表達的SnPP對哮喘小鼠肺部組織炎癥反應無抗炎效應，然而Hemin+siRNA HO-1組抑制HO-1表達的同時逆轉Hemin對哮喘小鼠肺部組織的抗炎效應。這表明Hemin能夠特異性誘導HO-1表達并增強其活性，從而發揮對哮喘小鼠氣道炎癥反應的抗炎作用，也可以推測HO-1在抵抗哮喘小鼠氣道炎癥反應中占據重要作用。

Treg細胞和Th17細胞是共同來源于初始CD4+T細胞的新亞類，參與哮喘和過敏性疾病的發生和發展[5,9]。Treg細胞是維持外周免疫耐受的關鍵細胞，分泌抑制性細胞因子IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)并能介導自身抗原誘導的免疫耐受，抑制炎性反應[10-11]。Th17細胞能夠促進炎性細胞因子IL-17、IL-22、IL-6以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的釋放[12]，還可在氣道炎性反應過程中招募中性粒細胞，進一步促進多種炎癥細胞釋放炎性因子，加重氣道的阻塞和氣道的高反應性，擴大炎性反應[13-14]。此外，Treg細胞與Th17細胞之間在分化上互相影響、在功能上相互拮抗，共同維持機體免疫狀態的相對穩定，使機體處于復雜的免疫平衡狀態。因此，Treg細胞和Th17細胞之間的平衡在免疫反應相關疾病的發生發展中起著重要作用。本研究中發現哮喘組小鼠外周血中Th17細胞占CD4+T細胞的百分率顯著高于正常組，Treg/CD4+T細胞百分比顯著降低，BALF、血清中IL-17表達水平明顯升高，提示Th17細胞及其分泌的細胞因子IL-17可能參與了哮喘的免疫調節作用，其機體Treg/Th17的失衡可能是哮喘發生、發展或急性加重的原因之一。與哮喘組相比，Hemin組明顯上調Treg細胞及IL-10表達，下調Th17細胞數量及降低IL-17的表達，糾正機體Treg/Th17的免疫失衡狀態，減輕氣道炎性反應，從而減輕哮喘的癥狀。與Hemin組相比，Hemin+siRNA HO-1組中HO-1表達受到抑制后，逆轉Hemin對Treg細胞和Th17細胞平衡的影響，削弱了Hemin對哮喘小鼠炎性反應的抑制作用，進一步證實HO-1參與哮喘模型中Treg細胞和Th17細胞平衡的調節，減輕氣道炎性反應。

綜上所述，Hemin特異性誘導HO-1表達和活性增強，調節哮喘小鼠外周血中Treg細胞和Th17細胞平衡，抑制炎性因子釋放，從而能有效改善哮喘氣道炎性反應。從而證實了HO-1在哮喘炎性反應以及Treg細胞和Th17細胞平衡中具有重要意義。由此推測在今后的臨床工作中，若對具有患哮喘高風險因素的兒童進行有效的早期免疫干預，可能會起到避免哮喘的發病或減輕哮喘癥狀的目的。

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Effect of Heme Oxygenase-1 on the balance of Treg cells and Th17 cells in asthmatic mice.

YANG Xin1,ZHANG Qing2,ZHANG Yan-ping2,WEI Xiao-ye2,JI Ya-mei2.1.Department of Paediatrics,YuLin Children's Hospital,Yulin 719000,Shaanxi,CHINA;2.Department of Paediatrics,Xingyuan Hosptial of Yulin,Yulin 719000,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Heme Oxygenase-1(HO-1)on the balance of Treg cells and Th17 cells in asthmatic mice,and to explain the immunomodulatory effect of HO-1.MethodsSixty female BALB/c mice were randomly divided into six groups according to random number table:normal control group,asthma group,Hemin group,tin-protoporphyrin(SnPP)group,Hemin+siRNA scramble group and Hemin+siRNA HO-1 group,with 10 mice in each group.Asthmatic mouse model was established by intraperitoneal injection and aerosol inhalation of ovalbumin(OVA),while mice in the normal control group were given normal saline instead.Hemin group and SnPP group were intraperitoneally injected with Hemin or 75 μmol/kg SnPP,respectively.Hemin+siRNA scramble group and Hemin+siRNA HO-1 group were transfected with pSicoR-GFP-siRNA scramble or pSicoR-GFP-siRNA HO-1 before intraperitoneal injection with Hemin.All mice were sacrificed at 24 hours after the last excitation.Western blot and HO-1 activity quantitative Kit were respectively used to measure the expression and activity of HO-1 in lung tissues.The hematoxylin-eosin staining was used to observe the airway structural changes.Flow cytometry was used to measure the percentages of Treg cells and T helper(Th17)cells in CD4+T cells in peripheral blood,while enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to measure the levels of interleukin(IL)-10 and IL-17 in serum and bronchoalveolar lavage fluid.ResultsCompared with the normal control group,asthma group showed an increase in the expression and activity of HO-1,and inflammatory reaction was obvious.The percentage of Treg/CD4+T cells and the level of IL-10 were significantly decreased,and percentage of Th17/CD4+T cells and the level of IL-17 were significantly increased, with statistically significant differences(P＜0.05).Compared with the asthma group,Hemin group had significantly increased expression and activity of HO-1,inhibited inflammatory reaction in lung tissue,increased percentage of Treg cells and I-10 level,decreased percentage of Th17 cells and IL-17 level.However,there was no significant change in the SnPP group.Compared with the Hemin group,Hemin+siRNA HO-1 group showed an obvious decrease in the ex-pression and activity of HO-1,percentage of Treg cells and IL-10 level,and an increase in inflammatory reaction,percentage of Th17 cells,and IL-17 level.The differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionIncreasing the expression and activity of HO-1 could significantly improve the inflammatory reaction,increase the number of Treg cells and promote the production of IL-10,and meanwhile inhibit the generation of Th17 cells and production of IL-17 in asthmatic mice.

Heme oxygenase-l;Asthma;CD4+CD25+regulatory T cell;T helper cell(Th17)cell

R-332

A

1003—6350（2017）01—0009—06

2016-07-27)

姬亞梅。E-mail：lijieyulin@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.003