白花蛇舌草通過JAK2/STAT3通路途經誘導膀胱癌T24細胞凋亡

程偉，韓超，范郁會

(西安市高新醫院泌尿外科，陜西 西安 710006)

白花蛇舌草通過JAK2/STAT3通路途經誘導膀胱癌T24細胞凋亡

程偉，韓超，范郁會

(西安市高新醫院泌尿外科，陜西 西安 710006)

目的研究白花蛇舌草對膀胱癌T24細胞凋亡的影響及其潛在機制。方法MTT法檢測不同濃度白花蛇舌草對T24增殖的抑制作用，AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot檢測細胞中JAK2、STAT3、Bax、Caspase-3和Bcl-2的表達情況。結果白花蛇舌草明顯抑制膀胱癌T24細胞的增殖同時誘導其凋亡，且作用強度隨著濃度的增加而增加。Western blot檢測證實白花蛇舌草能夠顯著抑制細胞中JAK2、STAT3和Bcl-2表達，上調Bax和Caspase-3表達。結論白花蛇舌草能夠抑制膀胱癌細胞T24增殖，促進其凋亡，可能與抑制JAK2/STAT3通路有關。

白花蛇舌草；膀胱癌細胞；JAK2；STAT3

目前，越來越多的中草藥被用于臨床各種腫瘤的預防和治療。作為我國最常見的中藥—白花蛇舌草，具有強大的藥用價值，例如清熱解毒、活血化瘀、利水消腫及抗腫瘤[1]。不少研究已經證實白花蛇舌草能夠有效抑制肝癌細胞和乳腺癌細胞增長并且誘導凋亡，但對膀胱癌細胞的作用研究較少[2]。膀胱癌是泌尿生殖系統中最常見的一種惡性腫瘤，并且近年來發病率呈現增高趨勢[3]。因此，本研究探索白花蛇舌草對膀胱癌細胞T24增殖和凋亡的影響以及作用機制，為臨床膀胱癌的治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 藥物和細胞 白花蛇舌草購自福建中醫藥大學國醫堂醫院，批號為09072201，人膀胱癌T24細胞株購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。

1.2 試劑材料 RPMI1640培養基購自美國Hyclone公司，MTT試劑盒購自Biosharp公司，Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒購自中國艾美捷科技公司?？贵wJAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3均購自美國Cell Signaling公司。

1.3 細胞培養 將人膀胱癌T24細胞接種于RPMI1640培養液中，其中含有10%胎牛血清、100μ/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，常規培養在溫度為37°C、5%CO2培養箱中，待細胞生長貼壁時，取對數生長期細胞進行下一步實驗。

1.4 MTT法檢測白花蛇舌草對T24細胞增殖的影響 將對數生長期的T24細胞濃度調整為1胞濃度5個/mL，吸取200 μL接種于96孔培養板中，當細胞生長貼壁后棄上清液，分別加入質量濃度為1 mg/mL、2 mg/mL和5 mg/mL的白花蛇舌草誘導培養，同時設置空白對照組，不同濃度梯度設置3個復孔。各自培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT，繼續共培養4 h，棄掉上清液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩使其藍紫色顆粒完全溶解。置于Ascent酶標儀490 nm下檢測每孔OD值。

1.5 AnnexinV-FITC/PI染色法檢測白花蛇車草對T24細胞凋亡的影響 收集空白對照組細胞和不同濃度的藥物組(1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL)培養24 h后細胞，室溫條件下以2 000 r/min進行離心10 min，棄去上清液，用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，再次進行2 000 r/min離心10 min，洗滌細胞，加入300 μL Binging Buffer懸浮，加入5 μLAnnexinV-FITC混勻，室溫孵育15 min，上機前5 min，加入5 μL PI以及200 μL的AnnexinV-FITC，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.6 Western blot檢測各組細胞JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達 分別加入蛋白裂解液置于各組已經收集的細胞，提取其蛋白含量并進行定量分析。每個樣品孔加入25 μg蛋白，各組細胞蛋白進行SDS-PAGE分離，并轉移到PVDF膜上，37°C下進行1%BSA封閉1 h，依次加入1:1 000稀釋的JAK2、STAT3、Bcl-2、Bax和Caspase-3多克隆抗體，加辣根過氧化物酶標記二抗，37℃溫度下反應1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝膠成像系統依次顯影、定影，Quantity One Basic軟件分析蛋白條帶。

1.7 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，多組間計量數據比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用最小顯著差法(least significant difference，LSD)，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 白花蛇舌草對T24細胞增殖的抑制作用 與空白對照組比較，不同濃度的白花蛇舌草預處理均能夠減少T24細胞在各個時間點的OD值，并且呈現濃度依賴性關系，組間差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 不同濃度白花蛇舌草對T24細胞OD值的影響(±s)

表1 不同濃度白花蛇舌草對T24細胞OD值的影響(±s)

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與1 mg/mL白花蛇舌草比較，bP＜0.05；與1 mg/mL白花蛇舌草比較，cP＜0.05。

組別24 h 48 h 72 h空白對照組1 mg/mL白花蛇舌草2 mg/mL白花蛇舌草5 mg/mL白花蛇舌草F值P值0.150+0.008 0.135+0.007a0.124+0.008ab0.109+0.008abc137.000 0.000 0.258+0.007 0.241+0.010a0.220+0.009ab0.208+0.007abc196.000 0.000 0.364+0.012 0.341+0.008a0.320+0.009ab0.304+0.011abc265.000 0.000

2.2 白花蛇舌草對T24細胞凋亡的促進作用 相比于空白對照組，不同濃度的白花蛇舌草預處理均能增加T24細胞的凋亡，并且呈現濃度依賴性關系，組間差異有統計學意義(F=189.247，P＜0.05)，見圖1。

2.3 白花蛇舌草對凋亡相關蛋白表達的影響 相比于空白對照組，不同濃度的白花蛇舌草預處理均能夠抑制Bcl-2表達，上調Bax和Caspase-3表達，并且呈現濃度依賴性關系，各組Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白相對表達比較分析得知F值分別為268.457、138.492和164.159，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

2.4 白花蛇舌草對JAK2/STAT3信號通路的影響 相比于空白對照組，不同濃度的白花蛇車草預處理均能夠抑制JAK2和STAT3表達，并且呈現濃度依賴性關系，各組JAK2和STAT3蛋白相對表達比較分析得知F值分別為284.164和361.178，組間比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖1 白花蛇舌草對T24細胞凋亡的影響

圖2 白花蛇舌草對T24細胞凋亡相關蛋白表達的影響

圖3 白花蛇舌草對T24細胞JAK2/STAT3相關蛋白表達的影響

3 討 論

膀胱癌是一種最常見的泌尿系統惡性腫瘤，復發性強的同時治療費用高，給人們的生活帶來巨大的經濟負擔，已經成為世界范圍內的公眾健康問題[4-6]。白花蛇舌草是一種常用的抗腫瘤中藥，臨床上已經證實白花蛇舌草對胃癌、肺癌、淋巴癌、肝癌以及婦科腫瘤具有較好的療效，但是其作用機制尚不明確[7-10]。本研究探討了白花蛇舌草對膀胱癌細胞體外增殖和凋亡的影響以及作用機制。

本研究中，不同濃度白花蛇舌草處理膀胱癌T24細胞，MTT結果顯示不同濃度白花蛇舌草均能夠抑制T24細胞增殖，并且呈現濃度依賴性關系。流式細胞術檢測對其細胞凋亡的影響，結果表明濃度越高對膀胱癌細胞T24的凋亡作用具有更強的誘導作用。因此，筆者可以推斷白花蛇舌草能夠抑制膀胱癌細胞增殖并且誘導凋亡。

研究表明，惡性腫瘤的發生常常與細胞周期調控失常有密切關系。本研究中分析了白花蛇車草對膀胱癌細胞中凋亡相關蛋白表達的影響。Western blot結果顯示不同濃度白花蛇舌草均能夠上調Bax和Caspase-3的表達，抑制Bcl-2蛋白表達。JAKs家族和STATs家族廣泛分布于各種組織和細胞中，JAK-STATs信號通路調控著細胞增殖、分化和凋亡等重要途徑，該通路的異常激活能夠導致細胞的過度增殖和惡性轉化。本研究在探索白花蛇舌草對膀胱癌細胞增殖凋亡作用機制的時候，采用Western blot分析細胞經過不同濃度白花蛇舌草處理后JAK2和STAT3的表達情況。很明顯，不同濃度白花蛇舌草能夠顯著抑制細胞內JAK2和STAT3的表達，并且呈現劑量依賴性關系。因此，我們推斷白花蛇舌草抑制膀胱癌細胞的增殖以及誘導其凋亡可能與抑制其JAK2/STAT3信號通路有關。

綜上所述，白花蛇舌草能夠有效抑制膀胱癌細胞的增殖，誘導其凋亡，這可能與抑制JAK2/STAT3信號通路有關，這為臨床治療膀胱癌提供了理論基礎。

[1]謝志民,呂潤霞.白花蛇舌草與混淆品松葉耳草的生藥鑒別[J].中藥材,1997,20(6):287-290.

[2]范永升,溫成平,謝志軍,等.3味解毒中藥單用或不同組合對MRL/ Ipr小鼠分泌活性因子表達的影響[J].中國中西醫結合雜志,2010, 30(12):1306-1309.

[3]Voelker R.New bladder cancer drug[J].JAMA,2016,11(6):310-312.

[4]Albayrak S,Zengin K,Tanik S,et al.Can the neutrophil-to-lymphocyteratio be used to predict recurrence and progression of non-muscle-invasive bladder cancer?[J].Kaohsiung J Med Sci,2016,32(6): 327-333.

[5]Sanseverino R,Napodano G,Campitelli A,et al.Prognostic impact of ReTURB in high grade T1 primary bladder cancer[J].Arch Ital UrolAndrol,2016,88(2):81-85.

[6]Godoy G,Gakis G,Smith CL,et al.Effects of androgen and estrogen receptor signaling pathways on bladder cancer initiation and progression[J].Bladder Cancer,2016,2(2):127-137.

[7]劉瑾.白花蛇舌草和半枝蓮配伍微粉對移植省略組織Bcl-2-Bax表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(21):227-230.

[8]施峰,賈曉斌,賈東升,等.白花蛇舌草預防肺癌物質基礎研究[J].中華中醫藥雜志,2010,25(3):403-408.

[9]肖云,伍志平,金從國,等.白花蛇舌草提取物抗小鼠結直腸癌血管生成的實驗研究[J].昆明醫科大學學報,2013,34(10):53-57.

[10]朱建坤,王秋蘭.白花蛇舌草抗腫瘤機制研究[J].西部中醫藥, 2013,26(6):119-121.

Herba Hedyotis Diffusae induces human bladder cancer T24 cells apoptosis through inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathways.

CHENG Wei,HAN Chao,FAN Yu-hui.Department of Urological Surgery,Xi'an Gaoxin Hospital, Xi'an 710006,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Herba Hedyotis Diffusae on human bladder cancer cells T24 cells apoptosis and its possible molecular mechanism.MethodsAfter treated with different concentrations of Herba Hedyotis Diffusae,MTT assay was used to detect the inhibitory effect of Herba Hedyotis Diffusae on proliferation of T24 cells.AnnexinV-FITC/PI double labeled flow cytometry was used to detect the apoptosis rate.The expression of janus kinase 2(JAK2),signal transducer and activator of transcription 3(STAT3),Bax,Caspase-3,Bcl-2 in cells were detected by Western blot.ResultsHerba Hedyotis Diffusae significantly inhibited the T24 cells proliferation and induced apoptosis in a dose-dependent manner.Western blot results showed that Herba Hedyotis Diffusae significantly inhibited the expression of JAK2,STAT3 and Bcl-2,and up-regulated Bax and Caspase-3 expression.ConclusionHerba Hedyotis Diffusae could inhibite proliferation of bladder cancer T24 cells and induce apoptosis,and the mechanism maybe through inhibiting the JAK2/STAT3 signaling pathways.

Herba Hedyotis Diffusae;Bladder cancer cells;Janus kinase 2(JAK2);Signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)

R737.14

A

1003—6350(2017）01—0014—03

2016-07-08)

韓超。E-mail：331226224@qq.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.004