megsin干擾質粒對大鼠Thy1腎炎病變的拮抗作用

李 毅 余怡文 關 運 姜姝君 徐玉音 趙仲華 張志剛△

(1復旦大學上海醫學院2010級臨床醫學系 上海 200032; 2復旦大學基礎醫學院病理學系 上海 200032)

megsin干擾質粒對大鼠Thy1腎炎病變的拮抗作用

李 毅1余怡文1關 運1姜姝君1徐玉音2趙仲華2張志剛2△

(1復旦大學上海醫學院2010級臨床醫學系 上海 200032;2復旦大學基礎醫學院病理學系 上海 200032)

目的 應用大鼠Thy1腎炎模型體外輸入megsin siRNA干擾質粒,觀察下調megsin表達后對大鼠腎炎中腎小球系膜細胞和基質增生的抑制作用。方法 雄性SD大鼠共9只,隨機等分為對照組(A組),Thy1腎炎模型組(B組)和質粒組(C組)。C組為腎炎模型加腎動脈注射megsin siRNA 質粒,并輔以電穿孔技術促進質粒浸入腎臟。腎臟標本行real-time PCR、HE染色、PAS染色和megsin、PCNA的免疫組化染色。結果 與對照組比較,HE染色結果可見B組腎小球系膜細胞明顯增生伴基質增多,而C組腎小球細胞數量明顯少于B組,但多于A組;PAS染色可見B組腎小球系膜區基質大量增多,呈節段性分布,C組則與之相比基質增生減少;RT-PCR和免疫組化結果顯示B組腎小球中megsin mRNA和蛋白質水平明顯升高,與A組相比兩指標差異均有統計學意義(P<0.01), 而在C組megsin mRNA和蛋白質水平又明顯下降, 與A、B組相比兩指標差異有統計學意義(P<0.05)。PCNA陽性細胞核平均數A組為3個,B組14.79個,而C組僅為6.94個。統計顯示B組和A組、B組和C組之間差異均有統計學意義(P<0.001 )。結論 注射megsin干擾質粒以后,系膜細胞、基質的增生均受到抑制,腎炎病變減輕,提示megsin干擾質粒體外轉染具有拮抗大鼠Thy1腎炎的作用,這為探索以系膜細胞增生為特征的腎臟疾病的防治提供了新的思路和依據。

megsin干擾質粒; Thy1腎炎; 系膜細胞增生; 大鼠

腎小球腎炎是臨床的常見疾病,腎小球系膜細胞和基質的增生是多種腎炎的基本病理特點,病變隨病程進展可發生腎小球硬化,腎濾過功能下降,最終發展為腎功能衰竭。

megsin基因是近來發現的腎小球系膜細胞的優勢表達基因[1],在正常腎小球內表達微弱。研究發現megsin表達的上調可以促進腎小球系膜細胞和基質的異常增生[2],在系膜增生性腎臟疾病的發病機制中起重要作用,如IgA腎病及糖尿病腎病[3-5]。研究顯示megsin的作用可能與基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2、-9下降及纖溶酶活性降低有關[5]。因此,megsin表達上調可促進炎性因子刺激腎小球基質增生,抑制基質降解并沉積在系膜區,加速腎炎發展。

本文通過輸入外源megsin siRNA質粒,抑制大鼠腎小球內megsin基因表達,探討其對大鼠抗Thy1腎炎模型(系膜增生性腎炎)的病理影響。期望動物實驗證明下調megsin基因表達,可減輕腎小球系膜細胞和基質的增生,為系膜增生性腎小球腎炎的治療提供新靶點。

材 料 和 方 法

megsin siRNA干擾質粒 megsin siRNA(含GFP標簽)質粒購自美國Santa cruz生物技術公司[megsin siRNA (h):sc-75768],內插入針對megsin序列的兩條寡核苷酸鏈:上游:5’-GATCCGCAAGG-AAACTCATCTAATATAGTGCTCCTGGTTGT-ATTAGATGAGTTTCCTTGCTTTTTTA-3’,下游:5’-AGCTTAAAAAAGCAAGGAAACTCAT-CTAATACAACCAGGAGCACTATATTAGATG-AGTTTCCTTGCG-3’;按常規步驟經質粒擴增及抽提, 并用限制性內切酶BamHI進行酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定, 收集備用。

動物腎炎模型 取健康成年雄性SD大鼠共9只,隨機等分為A組(對照組),B組(模型組)和C組(質粒組)。其中B組尾靜脈注抗胸腺素抗體(cox-7)50μg,cox-7緩沖液1 mL(500μL cox-7+500 μL PBS),C組為注射質粒干擾組,動物同B組處理后,第2天在消毒無菌狀態下,水合氯醛麻醉,打開腹腔,鈍性分離左側腎臟、左腎動靜脈,對腹主動脈和左腎靜脈進行鉗夾,同時經左側腎動脈注射siRNA 200μg megsin siRNA 質粒(見上);待腎皮質充盈變白時,腎臟旁放電脈沖儀電極板(WJ-2005寧波新芝生物科技股份有限公司),用100 V電極刺激(每次時長100 ms,共5次)。操作完成后迅速打開鉗夾,保證腎血流及時恢復,防止單側腎缺血壞死,然后縫合腹壁傷口。3組大鼠繼續喂養到第5天末處死,取雙側腎臟皮質制作冰凍切片和石蠟切片,用于HE染色、免疫組化及免疫熒光等檢測。

所有動物實驗的研究和喂養符合相關標準和程序, 動物實驗得到復旦大學基礎醫學院動物實驗倫理委員會審核批準。

免疫組化 檢測megsin 、PCNA的變化,上述動物實驗各組大鼠腎組織石蠟切片,厚4 μm,常規脫蠟水化,經去除內源性過氧化物酶和檸檬酸鈉緩沖液微波加熱10 min抗原修復,用1∶20羊抗兔血清進行正常血清封閉。隨后分別加抗Thy1抗體1∶100、抗PCNA抗體1∶100,37 ℃放置1 h,4 ℃過夜。次日加二抗(兔抗),DAB顯色,蘇木精復染。

腎組織冰凍切片免疫熒光染色 選擇各組動物腎皮質冰凍切片,羊血清37 ℃封閉20 min。加抗兔抗綠色熒光EGFP抗體1∶500,在37 ℃孵育1 h。4 ℃冰箱過夜。第2天加熒光二抗,37 ℃保溫30 min。甘油封片。熒光顯微鏡下觀測。

PAS染色 為檢測各組腎組織的腎小球中細胞外基質的改變和分布, 應用PAS染色顯示腎小球中的基質。石蠟切片石蠟切片脫蠟水化,過碘酸酒清液10 min,自來水沖洗,Schiff氏液10 min, 流水沖洗,透明封片。

real-time PCR 檢測 運用real-time PCR檢測各組大鼠腎皮質組織中的megsin mRNA表達。收集上述動物實驗各組大鼠腎皮質米粒大組織,放入去核酶試管中 ,加入預冷的Trizol,提取各組組織的總RNA, 逆轉錄合成樣本cDNA 50 μL,以ACTIN為內參;PCR反應體系包括:real-time PCR MIX 32 μL ,上游、下游引物各2 μL, 探針1 μL, cDNA模版2 μL, ddH2O 13 μL。 PCR反應條件為:95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 20 s, 循環40次。

統計學處理 RT-PCR各組結果分別做組間t檢驗比較統計分析。在上述megsin免疫組化染色和PAS染色切片中, 每例切片在100倍視野隨機選取20個腎小球, 用motic多光譜圖像分析系統測定免疫組化陽性面積或PAS陽性面積灰度OD值,然后換算出各組每個腎小球的OD均值和標準差, 做組間t檢驗分析。在腎組織PCNA組化染色切片中,高倍鏡下每組(3例)中隨機抽取100個腎小球,計數每個小球中PCNA染色陽性的數,再換算為每組平均數±標準差。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

大鼠腎組織冰凍切片免疫熒光結果 為確定腎動脈注射megsin干擾質粒的輸入效果,冰凍切片檢測抗GFP免疫熒光染色結果顯示(圖1),對照組和模型組均為陰性,腎組織中僅隱約可見腎小球輪廓。而質粒組腎小球中GFP亮綠色熒光陽性明顯,說明質粒成功進入腎小球內。

A:Control group;B:Model group; C:Plasmid group.

圖1 megsin干擾質粒注射后大鼠腎組織GFP免疫熒光染色結果(×100)

Fig 1 GFP immunofluorescence staining in renal tissue after injection of megsin siRNA plasmid in rats (×100)

大鼠腎炎腎組織的megsin mRNA水平 經real-time PCR檢測,3組大鼠的組織mRNA 水平顯示,模型組的megsin mRNA 水平升高, 與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01),質粒組比模型組明顯下降, 差異有統計學意義(P<0.01), 同時,質粒組megsin mRNA 水平也比對照組低, 差異有統計學意義(P<0.05,圖2)。

大鼠腎炎腎組織的megsin蛋白質水平 3組大鼠腎組織抗megsin免疫組化染色結果顯示(圖3),對照組megsin基本陰性,模型組腎小球系膜區細胞的胞質染色最明顯,細胞數目也相對較多,部分腎小管上皮也有陽性染色。而質粒組腎小球和腎小管也均有輕微染色,但比模型組減輕。表明模型組中腎小球系膜細胞megsin表達增強,質粒組中因基因受到干擾,表達比模型組要減少。腎小球內陽性面積灰度比OD值統計顯示,模型組與對照組的megsin 表達差異有顯著性意義(P<0.01);質粒組的megsin 表達與模型組的表達差異有統計學意義(P<0.05); 同時與對照組的表達差異也有統計學意義(P<0.05,圖3)。

(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖2 各組腎組織皮質megsin mRNA 水平

Fig 2 The RNA levels of megsin in the renal tissue of each group

大鼠腎炎腎組織的病理改變 HE染色結果顯示,對照組腎小球及腎小管形態結構正常,模型組的腎小球系膜區細胞數量明顯增多,且基質增多,說明系膜細胞激活增生,基質合成沉積。質粒組腎小球系膜細胞及基質均明顯少于模型組,但相比于對

照組的正常腎小球細胞數量仍有所增多(圖4)。

A:Control group;B:Model group;C:Plasmid group.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖3 腎組織megsin免疫組化檢測(×100)

Fig 3 Immunohistochemical detection of megsin in renal tissue (×100)

A:Control group; B;Model group; C:Plasmid group.

圖4 各組大鼠腎組織病理形態 (×100)

Fig 4 Pathological morphology of rat glomeruli in each group (×100)

以上的結果表明,模型組經COX-7尾靜脈注射,Thy1腎炎模型造模成功。而質粒組大鼠腎動脈注射shRNA質粒后,對病變的腎小球中系膜細胞增生等病理現象產生了抑制,這說明megsin干擾質?？梢援a生一定的拮抗腎炎發展的效果。

大鼠腎組織PAS染色結果 通過PAS染色,再進一步觀察各組腎小球中基質沉積的分布,結果顯示(圖5),對照組腎小球PAS陽性基質最少,模型組腎小球系膜區基質大量增多,PAS陽性呈節段性分布。腎小球內PAS陽性面積灰度OD值統計顯示,模型組與對照組的megsin 表達差異有顯著統計學意義(P<0.01)。質粒組居于對照組與模型組之間,腎小球系膜區PAS陽性比正常腎小球增多,但比模型組腎小球明顯減少。質粒組的腎小球內PAS陽性面積灰度OD值與對照組和模型組的OD值差異有統計學意義(P均< 0.05)。結果也表明質粒干擾組中系膜基質合成受到抑制。

大鼠腎炎腎組織PCNA免疫組化染色結果 在對照組腎小球內細胞均為陰性,偶見少量腎小管上皮陽性。模型組的腎小球中PCNA陽性細胞數量明顯增多,部分腎小管上皮也陽性增多。質粒組中腎小球PCNA陽性細胞明顯少于模型組,但相比于對照組的腎小球細胞數量仍有所增多(圖6)。通過對陽性細胞核定量和統計分析,結果顯示(圖6):對照組PCNA陽性均數/每小球 為3.00±2.31,模型組為14.79±3.53,質粒組為6.94±3.36。組間差異t檢驗統計顯示模型組與對照組、質粒組與對照組、模型組與質粒組均數之間差異均有統計學意義(P<0.001 )。結果表明經注射質粒的腎小球細胞增生受到抑制。

A:Control group;B;Model group; C:Plasmid group.(1)P<0.05,(2)P<0.01.

圖5 大鼠腎小球PAS染色結果(×100)

Fig 5 Results of glomerular PAS staining in rats (×100)

A:Control group; B;Model group; C:Plasmid group.(1)P<0.001.

圖6 大鼠各組腎小球PCNA染色(×100)

Fig 6 PCNA staining of glomerular in rats (×100)

討 論

megsin基因是1997年Miyata等[1]在IgA腎病患者的腎小球系膜細胞中尋找優勢表達的基因時發現的5種新的基因之一,亦稱serpin B7,是一種卵清蛋白樣絲氨酸蛋白酶抑制劑。研究表明,megsin在正常人體內表達較為微弱,在系膜增生性腎臟疾病(如IgA腎病、急性毛細血管內增生腎炎、狼瘡性腎炎等)中的表達上調,而在膜性腎病、微小病變病等不以系膜增生為主要特點的腎臟疾病中表達水平則無改變[ 3,6-7]。在megsin轉基因小鼠及糖尿病腎病大鼠模型中,megsin過表達可以促進腎小球系膜細胞和基質的異常增生[2,8]。因此megsin表達的上調與系膜細胞和基質的增生存在正相關。進一步的研究顯示,megsin表達的上調與MMP-2、MMP-9以及纖溶酶活性的下降有一定的相關性[5,9]。纖溶酶是纖維蛋白降解系統中一種重要的絲氨酸蛋白酶,在系膜基質重塑過程中,它可以直接降解某些系膜細胞成分或通過誘導活化MMP來間接導致細胞外基質的降解。而megsin可以與纖溶酶共價結合以抑制其活性,從而抑制細胞外基質的降解。使腎炎中因炎性因子刺激而增生的基質沉積在系膜區,促進腎炎的發展。

Liu等[10]在糖尿病腎病研究中,利用megsin的siRNA在體內外試驗中證明基因干擾質粒可抑制STZ小鼠的蛋白尿,腎小球內p27表達下調,進而導致系膜細胞增生受抑制及IV型膠原沉積減少。顯示動物體外注射相關基因干擾質粒也有一定的治療效果。李光明等[11]在CCL4誘導的大鼠纖維化模型的門靜脈內注射結締組織生長因子siRNA質粒,結果使肝內CTGF表達明顯下降,肝組織炎癥、壞死減少,可明顯抑制肝纖維化進程。此外,Takabatake等[12]為了增強外源性質粒浸入腎組織,在腎動脈注射EGFP的siRNA質粒到EGFP轉基因大鼠體內時,并加電穿孔輔助,成功增強了質粒的浸入腎組織,抑制了腎小球內EGFP的表達。本實驗根據Takabatake等[12]的方法,在大鼠Thy1腎炎模型中,通過大鼠腎動脈注射外源性megsin基因干擾質粒,及輔以電穿孔增強模式,結果顯示干擾質粒成功進入大鼠腎小球內,并導致腎組織中megsin mRNA水平和蛋白表達水平均下降,同時Thy1腎炎模型中腎小球系膜細胞增生和基質沉積均有明顯減輕,病理改變有改善。本研究提示下調megsin的表達可以減輕腎小球系膜細胞與基質的增生,為探索以腎小球系膜細胞和基質增生為特征的腎臟疾病的防治提供了新的思路和依據。

[1] MIYATA T,NANGAKU M,SUZUKI D,etal.A mesangium-predominant gene,megsin,is a new serpin upregulated in IgA nephropathy [J].JClinInvest,1998,102(4):828-836.

[2] MIYATA T,INAGI R,NANGAKU M,etal.Overexpression of the serpin megsin induces progressive mesangial cell proliferation and expansion [J].JClinInvest,2002,109(5):585-593.

[3] INAGI R,MIYATA T,SUZUKI D,etal. Specific tissue distribution of megsin,a novel serpin,in the glomerulus and its up-regulation in IgA nephropathy [J].BiochemBiophysResCommun,2001, 286(5):1098-1106.

[4] INAGI R,YAMAMOTO Y,NANGAKU M,etal.A severe diabetic nephropathy model with early development of nodule-like lesions induced by megsin overexpression in RAGE/iNOS transgenic mice [J].Diabetes,2006,55(2):356-366.

[5] OHTOMO S,NANGAKU M,IZUHARA Y,etal.The role of megsin,a serine protease inhibitor,in diabetic mesangial matrix accumulation [J].KidneyInt,2008,74(6):768-774.

[6] SUZUKI D,MIYATA T,NANGAKU M,etal. Expression of megsin mRNA,a novel mesangium-predominant gene,in the renal tissues of various glomerular diseases [J].JAmSocNephrol,1999,10(12):2606-2613.

[7] 陳楠,王偉銘,俞海瑾,等.腎小球腎炎腎組織megsin 的表達及其意義[J].腎臟病與透析腎移植雜志, 2003,12 (5):412-414.

[8] XIA Y,ZHANG Y,SHI W,etal.Overexpression of megsin induces mesangial cell proliferation and excretion of type IV collageninvitro[J].CellImmunol,2011, 271(2):413-417.

[9] 劉潔,李英,劉茂東,等.megsin基因轉染對高糖環境中腎小球系膜細胞增殖和基質金屬蛋白酶2及其抑制因子表達的影響[J].中華腎臟病雜志,2009,25(10):788-792.

[10] LIU M,ZHANG Y,CHI Y,etal.Delivery of megsin siRNA plasmid reveals therapeutic potential against diabetic nephropathy by down-regulating p27(kiP1) level [J].JNephrol,2012, 25(3):.418-425.

[11] 李光明,史毅,李定國,等.抗結締組織生長因子小干擾RNA對肝星狀細胞合成分泌細胞外基質的影響 [J].中華肝臟病雜志, 2004,12 (9):526-529.

[12] TAKABATAKE Y,ISAKA Y,IMAI E.Invivotransfer of small interfering RNA or small hairpin RNA targeting glomeruli [J].MethodsMolBiol,2009,466:251-263.

The antagonistic effect of megsin siRNA plasmid on Thy1 glomurelonephritis in rats

LI Yi1, YU Yi-wen1, GUAN Yun1, JIANG Shu-jun1, XU Yu-yin2, ZHAO Zhong-hua2, ZHANG Zhi-gang2△

(1Grade2010ofClinicalMedicine,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Objective To investigate the effect of megsin siRNA plasmid on the proliferation of glomerular mesangial cells and matrix Thy1 glomerulonephritis in rats. Methods Nine male SD rats were equally and randomly divided into 3 groups:A group was control group;B group was Thy1 glomerulonephritis model group; C group was megsin siRNA plasmid group which was the Thy1 glomerulonephritis model with renal artery injection of megsin siRNA plasmid,supplemented by electroporation technology.Kidney specimens were examined by real-time PCR,HE staining,PAS staining,and immunohistochemistry staining for megsin and PCNA. Results Compared with the A group,the HE staining results showed that the glomerular mesangial cells significantly increased with the increase of matrix in B group,while the number of glomerular cells in the C group was significantly less than that in the B group,but little more than in the A group;PAS staining showed that the matrixof glomerular mesangial cells significantly increased and segmentally distribution in B group,while it was decreased in C group;the results of RT-PCR and immunohistochemistry analysis showed that the megsin mRNA and protein levels in glomeruli increased significantly in B group compared with A group (P<0.01),while both decreased significantly in C group compared with B group (P<0.01) and A group (P<0.05).The average number of PCNA positive nuclei was 3 in A group,14.79 in B group,while 6.94 in C group,respectively.Statistics showed that there were significantly different between the B group and A group (P<0.001),and B group and C group (P<0.001). Conclusions The proliferation of mesangial cells and matrix were inhibited after the injection of megsin siRNA plasmid and nephritis lesions reduced,which suggested thatinvitrotransfection of megsin siRNA plasmid in rat Thy1 nephritis model has antagonistic effect on glomerulonephritis.It provides a new idea to explore the treatment and prevention of renal diseases with mesangial cell proliferation.

megsin siRNA plasmid; Thy1 glomurelonephritis; proliferation of mesangial cell;rat

國家基礎科學人才培養基金能力提高項目(J1210041)

R364.5

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.01.012

2016-04-27;編輯:王蔚)

△Corresponding author E-mail:zzg@shmu.edu.cn

*This work was supported by the Project of Ability Improvement,National Basic Science Personnel Training Fund (J1210041).