氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦感染WSSV的影響

方金龍，王 元，李新蒼，周俊芳，陳甜甜，房文紅

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦感染WSSV的影響

方金龍1，2，王 元1，李新蒼1，周俊芳1，陳甜甜1，2，房文紅1

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

為了評價養殖水環境中氨氮和亞硝基氮對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的危害性，開展了氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦感染WSSV后的死亡率、WSSV在患病對蝦體內增殖速率和對蝦主要免疫相關酶活性影響的研究。實驗設置氨氮（NH4＋）和亞硝基氮（NO2－）的共同脅迫濃度均為20 mg·L－1，分別注射10－4和10－5稀釋度的WSSV提取液。結果顯示，脅迫下感染10－4WSSV的凡納濱對蝦144 h死亡率達到100%，顯著高于無脅迫組（76.67%），相同實驗條件下高濃度病毒感染組死亡率高于低濃度組。對蝦鰓組織WSSV熒光定量PCR檢測結果顯示，氨氮和亞硝基氮共同脅迫下凡納濱對蝦體內WSSV的增殖加快，感染48 h后脅迫組病毒量是無脅迫組的1.6倍，72 h時病毒量達到無脅迫組的2.0～3.7倍。此外，免疫相關酶活性結果顯示，氨氮和亞硝基氮濃度突變會促使對蝦血清中酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）活性先短暫升高然后降低。由此可見，氨氮和亞硝基氮共同脅迫會加快WSSV在患病凡納濱對蝦體內的增殖，導致更高死亡率，這可能是因為脅迫造成了對蝦免疫相關酶活性的降低和抗病原感染能力下降所致。

凡納濱對蝦；白斑綜合征病毒；氨氮；亞硝基氮；脅迫

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）因為生長速度快、產量高、適應性強等特點而成為全球重要的水產養殖品種之一［1］。上世紀90年代初，凡納濱對蝦開始在我國養殖，現在已經是我國對蝦養殖面積最大的品種。然而，隨著我國集約化水產養殖迅速發展，養殖水體富營養化日益嚴重，其中氨氮、亞硝基氮等水質因子已成為影響對蝦健康和生長的主要因素之一，在養殖環境脅迫下水產病害頻發［2－3］。白斑綜合征是危害養殖對蝦重要疾病之一，凡納濱對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）攜帶率在30%以上，在養殖環境條件惡化時極易導致該病的爆發流行。有研究表明，環境因素如溫度、鹽度、pH、水溫、氨氮和亞硝基氮等對凡納濱對蝦健康影響顯著，環境的脅迫促使病害爆發［4－7］。甲殼動物體液中不具有免疫球蛋白，缺乏抗體介導的免疫反應來自我保護，其免疫反應主要依靠吞噬細胞和體液中抗氧化酶活因子來抵抗病原菌的入侵［8］。在對蝦體液因子中，酚氧化酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶等的活性常被用來反映對蝦的免疫力［8］。本實驗探究氨氮和亞硝基氮共同脅迫對感染WSSV凡納濱對蝦的發病死亡情況和病毒增殖情況，以及脅迫環境對凡納濱對蝦體液免疫相關因子活性影響，以揭示養殖環境與對蝦健康和病毒增殖的關系，為凡納濱對蝦病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

凡納濱對蝦為東海水產研究所福鼎研究中心土池養殖，氨氮和亞硝基氮共同脅迫感染WSSV實驗用蝦的體質量為（7.5±0.5）g，共同脅迫對免疫相關酶活影響實驗用蝦體質量為（10.0 ±1.0）g。對蝦從土塘捕撈后在實驗室暫養適應一周后開始實驗。實驗海水鹽度為24，水溫為（25±1）℃，pH 7.9～8.1，24 h曝氣。每天換一半的水，正常投喂商品顆粒飼料。

1.2 試劑與儀器

氯化銨、亞硝酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；左旋多巴購自SIGMA-ALDRICH；SYBR Premix Ex Taq TM等購自TaKaRa公司；基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；0.22μm濾膜購自蘇州賽恩斯儀器有限公司，超微量微孔板分光光度計（Epoch）購自BioTek公司；便攜式水質檢測儀（Octadem）購自無錫奧克丹生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀（StepOne Plus）購自ABI公司。

1.3 WSSV粗提液的制備

參照周俊芳等［9］方法，取感染WSSV死亡的凡納濱對蝦，去甲殼，剪取腹部肌肉，按質量體積比1∶9加入預冷PBS（pH 7.4），于玻璃勻漿器中冰浴環境充分勻漿，將勻漿液先經8層紗布過濾，再經過0.22μm濾膜過濾，取濾液作為WSSV粗提液，混勻后分裝到離心管中－40℃冷凍保存備用。

1.4 氨氮和亞硝基氮共同脅迫下WSSV對凡納濱對蝦的致死實驗

經預實驗確定對蝦攻毒的WSSV粗提液稀釋度為10－4和10－5。

實驗共設6組，分別為無脅迫下注射PBS（無脅迫PBS組）、注射10－5稀釋度WSSV（無脅迫10－5組）、注射10－4稀釋度WSSV（無脅迫10－4組），20 mg·L－1氨氮（NH＋4）與20 mg·L－1亞硝基氮（NO－2）共同脅迫下注射PBS（脅迫PBS組））、注射10－5稀釋度WSSV（脅迫10－5組）、注射10－4稀釋度WSSV（脅迫10－4組），用1 mL注射器在每尾蝦第一腹節注射25μL稀釋后的WSSV粗提液，設置2個平行，每個平行30 ind蝦，養于裝有200 L海水玻璃鋼桶中。實驗過程中，每天檢測實驗水質中氨氮和亞硝基氮濃度，觀察對蝦死亡情況并記錄。

1.5 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對WSSV在凡納濱對蝦鰓內增殖影響

實驗分為4組，分別為無脅迫下10－4、10－5稀釋度WSSV攻毒組和脅迫下10－4、10－5稀釋度WSSV攻毒組，設置2個平行，每個平行30 ind蝦，氨氮（NH＋4）和亞硝基氮（NO－2）共同脅迫濃度均為20 mg·L－1。實驗中攻毒方法同1.4。在注射WSSV后48、72、96、120、144 h，每組每個平行各采3 ind蝦，于－40℃冰箱中冷凍保存，用于WSSV定量檢測。

取上述凍存對蝦的鰓組織作為樣品，采用TIANGEN公司海洋動物組織總DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，用引物VP28F／VP28R采用普通PCR法檢測實驗對蝦是否感染WSSV［9］，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。模板稀釋50倍后用VP28F／VP28R和β-actineF／β-actineR兩對引物進行熒光定量PCR，檢測引物參照表1，體系設定為20μL，反應程序參照SYBR Premix Ex Taq TM說明書。

表1 熒光定量PCR檢測WSSV Vp28基因和β-actin基因所用引物Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR of WSSV Vp28 andβ-actin

1.6 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦免疫酶活性影響

氨氮和亞硝基氮共同脅迫對免疫酶活性影響實驗分為濃度突變和逐漸升高2種方法進行。濃度突變脅迫實驗是將對蝦從正常養殖海水（NH＋4和NO－2濃度分別是0.13 mg·L－1和0.04 mg·L－1）中直接投到氨氮（NH＋4）和亞硝基氮（NO－2）濃度均為20 mg·L－1海水中；濃度逐漸升高脅迫實驗為每6 h氨氮和亞硝基氮濃度均升高1 mg·L－1，到20 mg·L－1后維持不變。每組120 ind對蝦，養殖在800 L玻璃鋼桶內，每天換水一半，事先將換水調到相應的濃度。水中氨氮和亞硝基氮用高濃度NH4Cl和NaNO2溶液調配。實驗過程中除采樣外，對蝦成活率為100%。實驗開始后，每組在0、6、12、24、48、96、144 h各隨機采集15 ind蝦，每3 ind為一組，從對蝦的腹部血竇處抽取血淋巴，于2 mL離心管中－40℃冷凍保存。

取出冷凍保存的對蝦血淋巴，于4℃冰箱中解凍，5 000 r·min－1離心10 min，取上清，檢測免疫相關酶的活性［11］。

PO活性檢測方法參照ASHIDA［12］，以左旋多巴為底物，采用96孔板法。向96孔板中加入200μL磷酸緩沖液（pH 6.0，0.01 M），再加入10 μL血淋巴上清液，然后加入10μL左旋多巴（0.01 mol·L－1），立即混勻，于酶標儀中490 nm波長處測OD值變化，每2 min檢測一次，共檢測15次。以時間和OD值變化作曲線，求曲線變化率，以實驗條件下，每分鐘OD490增加0.001為一個酶活單位。

AKP、ACP活性檢測使用南京建成生物工程研究所酶活檢測試劑盒。

1.7 數據處理與分析

不同處理組之間和同組不同時間點之間的對蝦死亡率、病毒增殖量、PO、ACP、AKP活性等差異的顯著性分析采用SPSS 22處理；WSSV熒光定量數據處理采用2－ΔΔCt法。

2 結果與分析

2.1 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對感染WSSV凡納濱對蝦致死率影響

在脅迫和無脅迫下，注射PBS的對照組最高死亡率分別為16.7%和11.7%，沒有出現大量死亡，存活對蝦健康狀況良好。WSSV感染組，對蝦在攻毒36 h后即表現出反應遲鈍、體色發紅、身體透明度降低、身體失去平衡、在水面或貼著桶壁側游、發病死亡的對蝦甲殼易剝離、甲殼上有白色斑點等癥狀。注射相同稀釋度病毒粗提液的對蝦，脅迫組比無脅迫組癥狀更加明顯。在脅迫和無脅迫下，不同處理組的對蝦死亡情況見圖1。注射病毒液后隨時間延長死亡率升高，到144 h注射10－4、10－5脅迫組的死亡率分別達到100%和78.3%，而無脅迫組分別為76.7%和70%。從72 h開始，脅迫條件下注射相同稀釋度WSSV感染組的死亡率顯著高于無脅迫組（P＜0.05）。從48 h開始，相同條件下，注射10－4稀釋度病毒液的對蝦死亡率一直高于10－5濃度組，但差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對感染WSSV凡納濱對蝦死亡率的影響Fig.1 Effect of ammonia and nitrite on mortalities of L.vannamei infected by WSSV

2.2 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對WSSV在凡納濱對蝦鰓內增殖的影響

無脅迫10－5、無脅迫10－4、脅迫10－5和脅迫10－44個組的對蝦體內病毒增殖與時間的變化關系見圖2。脅迫組的病毒增殖量隨時間增加較快，在72 h即達到最高；無脅迫組病毒增殖量隨時間增加較慢，無脅迫10－4組在96 h達到最高，無脅迫10－5組在120 h達到最高。48 h時，脅迫組和無脅迫組病毒量沒有顯著性差異（P＞0.05）；在72 h時，脅迫組病毒量顯著高于48 h（P＜0.05），也是同時期無脅迫組病毒量的2.0～3.7倍（P＜0.05）。96 h各個試驗組對蝦病毒量差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 氨氮和亞硝基氮脅迫下對WSSV在凡納濱對蝦體內增殖的影響Fig.2 Effect of stress of ammonia and nitrite on WSSV quantity of L.vannamei detected by quantitative real-time PCR

2.3 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦免疫酶活性影響

2.3.1 對酚氧化酶（PO）活性的影響

在氨氮和亞硝基氮共同脅迫下，凡納濱對蝦血清PO活性表現出先升高后降低變化（圖3）。突變組血清PO活性在6 h即達到最高，顯著高于對照組和漸變組（P＜0.05），48 h后PO活性顯著低于對照組（P＜0.05），144 h僅為對照組的一半。與突變組相比，漸變組血清PO活性升高較為緩慢，12 h時達到最高然后下降，48 h后與對照組接近（P＞0.05）。

圖3 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦PO活性影響Fig.3 Effect of stress of ammonia and nitrite on PO activity of L.vannamei

2.3.2 對酸性磷酸酶（ACP）活性的影響

氨氮和亞硝基氮共同脅迫下，突變組對蝦血清ACP活性呈現逐漸升高趨勢，24 h顯著高于對照組和漸變組（P＜0.05），48 h達到最高，然后逐漸下降（圖4）。而漸變組血清ACP活性在96 h和144 h時顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3.3 對堿性磷酸酶（AKP）活性的影響

氨氮和亞硝基氮共同脅迫下，對蝦血清AKP活性變化見圖5。在氨氮和亞硝基氮共同脅迫下，凡納濱對蝦血清AKP活性表現出先升高后降低。突變組血清AKP活性在6 h即達到最高，顯著高于對照組和漸變組（P＜0.05），48 h后AKP活性顯著低于對照組（P＜0.05）。而漸變組血清AKP活性雖有升高趨勢，但與對照組沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖4 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦ACP活性的影響Fig.4 Effect of stress of ammonia and nitrite on ACP activity of L.vannamei

圖5 氨氮和亞硝基氮共同脅迫對凡納濱對蝦AKP活性的影響Fig.5 Effect of ammonia and nitrite on AKP activity of L.vannamei

3 討論

養殖水體環境的污染，嚴重影響了養殖動物的健康狀況，降低了其抗病能力。養殖過程中的殘餌和產生的排泄物經過細菌的分解產生的氨氮和亞硝酸鹽，是目前高密度養殖模式面臨的巨大挑戰。氨氮電離產生的非離子氨由于不帶有電荷，可以通過動物表皮滲入動物體內，對動物體內酶的催化作用和細胞膜的穩定性產生嚴重不良影響，并破壞排泄系統和滲透平衡［13］。養殖水體的氮循環在亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽這個程序比較慢，造成亞硝酸鹽在水體的積累，隨著養殖時間的推移，濃度越來越高，對水體動物毒性越來越大［14］。CHENG等［15］研究表明，當亞硝酸鹽濃度高于0.36 mg·L－1和暴露時間長于6 h，對蝦血淋巴pH、氧合血藍蛋白和血藍蛋白濃度開始降低，血淋巴氧合血藍蛋白轉為脫氧血藍蛋白，從而降低了對氧的親和力，導致機體輸氧能力下降，使機體因缺氧產生損傷。

WSSV是迄今為止對全球對蝦養殖業危害最為嚴重的一種病毒，具有宿主泛嗜性［16］。SUN等［17］研究發現，WSSV可以侵入對蝦鰓、甲殼下結蹄組織、肝胰腺等組織，鰓是對蝦體內WSSV復制比較快的一個組織，實時熒光定量法檢測到WSSV在感染中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）30 h后，病毒粒子增加600倍。劉強等［18］研究發現，0.2μg·L－1毒死蜱脅迫下，凡納濱對蝦感染WSSV 72 h后鰓組織中病毒量是對照組的4倍。本實驗中，20 mg·L－1氨氮和亞硝基氮共同脅迫下，感染WSSV后48～72 h是病毒快速增殖期，72 h時脅迫組病毒量是對照組的2.0～3.7倍，和劉強等［18］的實驗結果一致。

氨氮和亞硝基氮長期脅迫下會降低對蝦免疫相關酶活性，增加了病害爆發的可能性。酚氧化酶是酚氧化酶原激活系統被病原激活時釋放的產物，是節肢動物非特異性免疫系統的重要組成部分。PO能與酚氧化酶原系統被激活后釋放的其它物質共同介導黑化作用、細胞黏附、包囊形成、血細胞遷移和吞噬等反應，最終消滅侵入異物［19］。孫艦軍等［20］研究發現，2.5 mg·L－1氨氮脅迫中國明對蝦20 d后，其血清和肌肉的PO活性降低19.1%。王玥等［21］研究發現，羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）在1 mg·L－1氨氮或者亞硝態氮環境脅迫下PO活性減弱，分別在第1天和第10天達到最小值，顯著低于對照組。李永等［22］研究發現，氨氮濃度為29.9 mg·L－1時，PO活性先略有升高后降低。本實驗中凡納濱對蝦在氨氮和亞硝酸鹽共同脅迫下24 h后，血清酚氧化酶活性開始降低，和上述文獻報道的結果基本一致。隨著脅迫時間的延長，漸變脅迫組PO活性變化不明顯，表明脅迫濃度緩慢變化時，對蝦PO對氨氮和亞硝基氮的脅迫具有一定適應和調整能力。

在甲殼動物體內，ACP和AKP作為溶酶體重要組成部分，催化磷酸單酯的水解反應和磷酸基的轉移反應，加速物質的攝取和轉運，也是水解酶體系的一部分，參與血細胞的吞噬和包囊反應，破壞和消除侵入體內的異物，達到機體防御的功能［21，23］。管小娟［8］認為，ACP和AKP可以作為判斷甲殼動物免疫能力的參考數據。本實驗中，當水體氨氮和亞硝基氮濃度突然升高時，對蝦血清ACP活性呈現逐漸升高趨勢，而AKP活性在6 h達到最高，隨后開始下降，96 h達到最低值，變化趨勢與血清PO相一致。

綜合分析血清PO等酶活、蝦體內WSSV增殖和死亡率與脅迫時間的關系，在48 h時脅迫組PO和AKP活性處于下降階段，此時的脅迫組對蝦死亡率和體內WSSV增殖與對照組差異并不顯著；然而，隨著時間延長，PO和AKP活性繼續下降，脅迫組對蝦體內WSSV增殖迅速，72 h達到了最高值，此時對蝦死亡開始大幅增多。由此可見，在氨氮和亞硝基氮共同脅迫下，對蝦體內PO和AKP活性下降，對WSSV感染的抵抗能力也開始下降，從而導致WSSV在體內迅速增殖，最終對蝦死亡率不斷升高。

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Effects of WSSV on cultured Litopenaeus vannamei under both ammonia and nitrite stress

FANG Jin-long1，2，WANG Yuan1，LIXin-cang1，ZHOU Jun-fang1，CHEN Tian-tian1，2，FANG Wen-hong1
（1.Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization of Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In order to evaluate the harmfulness of ammonia and nitrite on white pacific shrimp，Litopenaeus vannamei，this study was conducted to determine the combined effects of ammonia and nitrite on the mortality of white pacific shrimp infected with WSSV，WSSV proliferation in diseased shrimp and the activity of immunity-related enzymes in serum.The experiment consisted of treatments infected with PBS，WSSV extract of 10－5and 10－4dilution under the joint stress of 20 mg·L－1ammonia（NH4＋）and 20 mg·L－1nitrite（NO2－），and there were relative groups without stress as control.The result showed that the mortality of the group with stress-10－4WSSV reached 100%at 144h，significantly higher than the control group of stress-free-WSSV10－4with 76.67%mortality.Treatments with higher concentration of WSSV infection had higher mortality than that with lower concentration of WSSV infection under the same condition.Meanwhile，the amount of WSSV determined by Real-time Relative PCR showed that the stress of ammonia and nitrite accelerated WSSV proliferation in shrimp gills.The WSSV quantity of stress group was 1.6 times that of stress-free group at 48h while it reached 2.0－3.7 times at 72h.In addition，immunity-related enzymes activity experiment showed that the activity of phenoloxidase（PO），acid phosphatase（ACP）and alkaline phosphatase（AKP）in shrimp serum elevated firstly and then declined with time prolonged under joint stress of ammonia and nitrite.This study indicates that synergy of ammonia and nitrite accelerates WSSV proliferation in WSSV-infected L.vannamei and causes higher mortality，because stress environment lowers the activity of immunity-related enzymes and the ability of anti-infection of shrimp.

Litopenaeus vannamei；white spot syndrome virus；ammonia；nitrite；stress

S 941

：A

1004－2490（2017）01－0085－07

2016－03－21

上海市蝦類產業技術體系建設項目［滬農科產字（2014）第5號］；上海市科技興農重點攻關項目（滬農科攻字（2013）第6－4號）

方金龍（1989－），男，碩士研究生，研究方向水生動物疾病防治。E-mail：fangjlzt＠163.com

房文紅，研究員。E-mail：fwenhong＠163.com