基于生物催化法的食品熏蒸劑環氧乙烷制備

徐 寧 辛嘉英 王 艷 竇博鑫 夏春谷

(1.哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室， 哈爾濱 150076； 2.東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030；3.中國科學院蘭州化學物理研究院羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室， 蘭州 730030)

基于生物催化法的食品熏蒸劑環氧乙烷制備

徐 寧1,2辛嘉英1王 艷1竇博鑫1夏春谷3

(1.哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室， 哈爾濱 150076； 2.東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030；3.中國科學院蘭州化學物理研究院羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室， 蘭州 730030)

為了探索一種反應條件溫和、方法簡單的食品熏蒸劑環氧乙烷制備方法，采用甲基彎菌IMV 3011(MethylosinustrichosporiumIMV 3011)細胞作為生物催化劑，催化乙烯的環氧化反應生成環氧乙烷，確定了反應條件。結果表明：反應器中氣相的組成為氧氣50%、乙烯20%、氮氣30%(體積分數)，30℃、150 r/min 振蕩反應8 h，采用固定化形式催化劑，環氧乙烷生成量為34 μmol/mg，利用甲烷培養對其循環再生，再生8次催化劑中甲烷單加氧酶(MMO)活力仍保留89%，環氧乙烷物質的量為3.4 nmol。

食品熏蒸劑； 環氧乙烷； 甲烷氧化菌； 生物催化劑； 環氧化反應

引言

環氧乙烷可用作熏蒸劑使用[1]，環氧乙烷熏蒸無氣體殘留且不對金屬產生腐蝕，可殺滅內孢子類細菌和大多數真菌[2]，現在被廣泛用于不能進行高溫處理的食品滅菌[3]。

目前，環氧乙烷的制備采用過渡金屬或納米金為催化劑將乙烯直接氧化，為了將乙烯和環氧乙烷的易燃性降到最低，制備過程中需要控制原料乙烯的濃度以及充入甲烷、氬氣、氮氣等惰性氣體，這導致產物不易分離[4]。此外，由于反應溫度高達200℃以上，乙烯易被徹底氧化生成二氧化碳，會對環境造成危害，而且原料乙烯向二氧化碳的轉化也會造成經濟損失[5]。生物催化劑參與的反應條件溫和、專一性強、方法簡單[6]，為解決化學催化法制備環氧乙烷產生的問題提供了一種新思路。

甲烷單加氧酶(MMO)是甲烷氧化菌代謝途徑中最重要的一種酶，可以催化烯烴環氧化，且具有較高的產物專一性和光學立體選擇性[7-8]。由于純MMO酶穩定性差、催化反應時還需要輔酶參與，因此，甲烷氧化菌細胞能更好、更有效地催化烯烴的環氧化反應。以前的研究工作一般以催化丙烯環氧化反應為主[9-17]，同時借助固定化、半連續化、連續化等手段，確定其在實際生產上應用的可能性。然而，未見利用生物催化劑催化乙烯環氧化制備環氧乙烷的研究報道。不過，生物催化劑催化乙烯環氧化與催化丙烯環氧化具有相同的化學機制。為此，在課題組前期研究的基礎上，本文以甲基彎菌IMV 3011(MethylosinustrichosporiumIMV 3011)細胞為生物催化劑，催化乙烯環氧化制備環氧乙烷，探索生物法制備環氧乙烷的新途徑。

1 制備原理

圖1 生物法制備環氧乙烷的原理Fig.1 Schematic of biocatalytic method for producing epoxyethane

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

甲基彎菌IMV 3011(MethylosinustrichosporiumIMV 3011)由俄羅斯科學院催化研究所提供；發酵培養基采用NMS培養基，按文獻[18]配制。

甲烷、乙烯、丙烯氣體(純度99.99%，哈爾濱卿華氣體有限公司)；環氧乙烷標樣(色譜純，AccuStandard公司)；40目活性炭，哈爾濱天賜活性炭有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械公司；恒溫振蕩器，哈爾濱東聯電子技術開發公司；GC7890型氣相色譜儀，上海天美有限公司。

2.2 生物催化劑的制備

2.2.1 游離形式

將100 mL的NMS液體培養基置于250 mL三角瓶中，滅菌冷卻后接入甲基彎菌IMV 3011，接種量為10%(體積分數)，密封后抽真空，置換甲烷與空氣的混合氣體(體積比例1∶1)，間隔24 h換一次氣。30℃、180 r/min 搖床培養96 h后，8 000 r離心15 min收集細胞。用4℃、20 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液(含5 mmol/L MgCl2)洗滌2次，再懸浮于同樣的緩沖液中，4℃貯存備用。

2.2.2 固定化形式

采用1 mol/L HCl溶液浸泡活性炭顆粒，于50℃攪拌1 h，取出后再用去離子水反復洗滌，直至洗液的pH值為7.0，加熱干燥備用。

將活性炭置于活性炭甲基彎菌IMV 3011細胞懸液中，二者的體積比例為1∶10，室溫(20 ℃)下間歇攪拌20 h，濾出活性炭，用4℃、20 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液(含5 mmol/L MgCl2)洗滌2次，自然晾干得到固定化形式的生物催化劑。

2.3 環氧乙烷的制備

乙烯的環氧化反應在密封的反應器中進行(圖2)，用250 mL磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L、pH值7.0，含5 mmol/L MgCl2)將一定量的生物催化劑(固定化形式5 g，吸附的干重細胞共12.5 mg；游離形式12.5 mL，其干重細胞為12.5 mg)懸浮于3 L反應器中，反應器密封后抽真空，置換一定比例的乙烯與氧氣的混合氣體，30℃、150 r/min 振蕩反應，反應一段時間取樣，測定樣品中環氧乙烷的含量。

圖2 乙烯環氧化的反應器示意圖Fig.2 Schematic diagram of lab-scale ethylene-epoxidizing reactor

2.4 生物催化劑循環再生

環氧化反應結束，將生物催化劑取出(固定化形式采用濾出；游離形式采用離心)，加入100 mL的NMS液體培養基置于250 mL三角瓶中，抽真空后置換甲烷與空氣的混合氣體(體積比例1∶1),30℃、180 r/min 振蕩8 h，進行再生。再生后的催化劑重新制備環氧乙烷，反應結束后再生，如此循環。

2.5 測定指標與方法

2.5.1 環氧乙烷含量

采用氣相色譜法。測定條件為：SE-54型毛細管柱(Φ0.23 mm×30 m)，FID檢測器，載氣(氮氣)流速為75 mL/min，檢測器、進樣室、色譜柱的溫度分別為180、180、60℃，進樣量為1 μL。

2.5.2 催化劑活力

催化劑活力即MMO活力，MMO活力用每1 mg干重細胞、每1 min催化丙烯環氧化產生的環氧丙烷物質的量表示。將1 mL細胞懸液置于10 mL密封的玻璃瓶中，抽真空后充入丙烯和氧氣(體積比例1∶1)，30℃、180 r/min搖床振蕩30 min后，8 000 r離心15 min，迅速冷卻至4℃，進樣量1 μL進行氣相色譜分析，分析條件同2.5.1節。

2.6 數據處理

所有實驗重復3次，結果取平均值，數據處理和分析采用SPSS 13.0軟件，統計顯著性P<0.05。

3 結果與分析

3.1 時間對環氧乙烷生成量的影響

采用游離形式和固定化形式的催化劑制備環氧乙烷，環氧乙烷的生成量與時間的關系如圖3所示。

圖3 環氧乙烷生成量隨時間的變化Fig.3 Time course of epoxyethane formation

反應初期(0～4.5 h)環氧乙烷生成量不斷增加，采用游離形式催化劑時環氧乙烷生成量大于固定化形式；4.5～6 h采用2種形式催化劑時環氧乙烷生成量接近；6～9 h采用游離形式催化劑時環氧乙烷生成量不再增加，采用固定化形式催化劑時環氧乙烷生成量繼續增加直至9 h達到穩定。

游離形式催化劑直接與反應器液相中的乙烯接觸，反應初期(0～4.5 h)環氧乙烷生成量大，可能是由于輔酶NADH的耗盡和產物的抑制作用[19]，導致6 h后環氧乙烷生成量不再增加；反應器液相中的乙烯先擴散至固定化催化劑周圍的液膜，再擴散至固定化形式催化劑上的細胞表面[20]，因此，反應初期(0～4.5 h)環氧乙烷生成量小于采用游離形式催化劑，固定化催化劑以活性炭為載體，活性炭對非極性的乙烯有良好的吸附作用[21]，使得活性炭吸附的細胞周圍微環境中聚集乙烯氣體，因而4.5 h后環氧乙烷生成量繼續增加。

從圖3可以看出，采用游離形式和固定化形式催化劑制備環氧乙烷，適宜反應時間分別為6 h和8 h，環氧乙烷生成量分別為23 μmol/mg和27 μmol/mg。

3.2 乙烯初始體積分數對環氧乙烷生成量的影響

為研究乙烯初始體積分數對環氧乙烷生成量的影響，環氧乙烷反應器中充入的氣體成分為氧氣、乙烯、氮氣，其中氧氣體積分數50%，通過氮氣調整乙烯的初始體積分數為0～30%，反應8 h后測定樣品中的環氧乙烷生成量，結果如圖4所示。

圖4 乙烯體積分數對環氧乙烷生成量的影響Fig.4 Effect of ethylene concentration on formation of epoxyethane

環氧乙烷生成量與乙烯在液相的溶解度有關，乙烯初始體積分數增加，產生的環氧乙烷量也增加，當液相中溶解的乙烯達到飽和，氣相中乙烯的體積分數增加，環氧乙烷生成量也不會增加。由于活性炭對非極性氣體乙烯有良好的吸附能力[21]，且氣體易擴散至細胞周圍的微環境中，因此，固定化形式催化劑所在的液相能聚集更多的乙烯。

從圖4可以看出，制備環氧乙烷，采用游離形式和固定化催化劑，乙烯適宜的初始體積分數為20%，環氧乙烷生成量為29 μmol/mg和34 μmol/mg。

3.3 生物催化劑的再生

提供還原能量的輔酶NADH再生可以推動乙烯環氧化反應的持續進行[22]。直接加入外源物質可以再生輔酶NADH。向反應器中加入甲烷(氧氣50%、乙烯20%、甲烷10%、氮氣20%)、3 mmol/L甲醇、20 mmol/L甲酸鈉，2種形式催化劑的MMO活力如表1所示。

表1 輔因子對生物催化劑MMO活力的影響Tab.1 Effect of cofactors on MMO activity of free and immobilized biocatalysts nmol/(min·mg)

注：不同字母表示差異顯著。

不同的輔因子與酶的親和能力不同，導致再生輔酶的能力不同[23]。甲烷、甲醇和甲酸鈉的加入提高了游離形式催化劑的MMO活力，分別為空白組的1.4倍、1.6倍、6.4倍。

甲醇和甲酸鈉的水溶性好，能克服活性炭所產生的傳質限制，固定化形式催化劑的MMO活力分別為空白組的1.5倍和5.8倍。物理吸附的吸附力主要是范德華力，氣體的相對分子量越大，則范德華力越大，吸附能力越強，反應器中活性炭對乙烯的吸附力大于甲烷，因此，甲烷對固定化形式催化劑的再生效果不明顯。

外源物質的一次性加入不能滿足日后連續化工業生產的需要。因此，循環再生是有益的嘗試。每次循環再生后生物催化劑的MMO活力結果如圖5所示。

圖5 循環再生催化劑的MMO活力保留率Fig.5 Percent of initial MMO activity retained of free and immobilized biocatalysts in repeated regeneration

MMO在再生的過程中產生輔酶NADH，為制備環氧乙烷提供了還原能量，由于其自身的不穩定性，游離形式催化劑循環再生4次后其MMO活力不斷降低，循環再生到第8次，其活力基本為零。

對固定化形式催化劑的再生，由于其上吸附不牢固的細胞部分脫落[10]，導致前2次再生MMO活力下降，但下降程度較小，之后的循環再生MMO活力基本不變，再生8次后MMO活力仍保留89%，這體現了再生處理的作用以及固定化形式催化劑良好的操作穩定性。

CHEN等[11]采用硅酸鈉溶膠包埋甲基單胞菌GYJ3催化丙烯環氧化反應，25批次再生-催化實驗中，MMO的活力基本不變，而游離細胞在第4次再生-催化實驗中，MMO活力保留率小于30%；KOVALENKO等[10]研究了甲基彎菌IMV 3011游離細胞催化丙烯環氧化反應的操作穩定性，結果表明連續催化7次后MMO的酶活力接近初始酶活力的10%。

3.4 不同形式催化劑對環氧乙烷生成量的影響

甲烷氧化菌細胞作為催化劑制備環氧乙烷，其參與反應有2種形式：游離形式、固定化形式。按照2.3節的方法，反應器中氣相的組成為氧氣50%、乙烯20%、氮氣30%，采用游離形式和固定化催化劑，循環再生8次后，環氧乙烷物質的量為2.2 nmol和3.4 nmol。

圖6反映了環氧乙烷對不同形式生物催化劑的產物抑制作用。

圖6 環氧乙烷對MMO活力的影響Fig.6 Effect of epoxyethane on MMO activity of free and immobilized biocatalysts

1.0 nmol/L環氧乙烷直接作用游離形式和固定化形式催化劑120 min，MMO活力保留率分別為2%、67%，可以看出，環氧乙烷對MMO活力有抑制作用。之前的研究證明：環氧丙烷對MMO活力有抑制作用，它可以結合MMO的催化位點，特別是MMOH[24]。環氧乙烷與環氧丙烷的結構相似，環氧乙烷環狀結構中氧的拉伸使碳原子更具有親電性，更易與MMO活性部位中的親核氨基酸殘基結合，這可能是環氧乙烷對MMO活力有抑制作用的原因。

固定化形式催化劑的載體活性炭對環氧乙烷的吸附能力較弱，環氧乙烷可以遠離固定化細胞周圍的微環境，能降低環氧乙烷對細胞MMO活力的抑制作用，同時結合環氧乙烷生成量，確定制備環氧乙烷的生物催化劑采用固定化形式。

4 結論

以MethylosinustrichosporiumIMV 3011細胞為生物催化劑，催化乙烯環氧化反應制備環氧乙烷。

(1)反應條件為：反應器中氣相的組成為氧氣50%、乙烯20%、氮氣30%，30℃、150 r/min振蕩反應8 h，采用游離形式和固定化形式催化劑，環氧乙烷生成量分別為29 μmol/mg和34 μmol/mg。

(2)生物催化劑的MMO活力需要再生，可采用甲烷培養實現循環再生，固定化形式催化劑再生8次MMO活力仍保留89%，環氧乙烷物質的量為3.4 nmol。

(3)生物催化劑采用固定化形式，以活性炭為載體，通過對乙烯的吸附作用提高細胞周圍的底物濃度，再生后可以持續催化環氧化反應，細胞的MMO活力穩定，具有良好的操作穩定性，不易吸附環氧乙烷，使環氧乙烷遠離細胞進而降低產物對細胞活性的抑制作用。與傳統的化學催化方法相比，本方法在常溫常壓下進行且反應條件溫和，一步生成環氧乙烷，反應工序少，副產物僅有水，無污染，腐蝕性小，具有工業上實際應用的潛力。

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Producing Epoxyethane as Food Fumigant Based on Biocatalysis

XU Ning1,2XIN Jiaying1WANG Yan1DOU Boxin1XIA Chungu3

(1.KeyLaboratoryforFoodScienceandEngineering,HarbinUniversityofCommerce,Harbin150076,China2.CollegeofFoodScience，NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China3.StateKeyLaboratoryforOxoSynthesisandSelectiveOxidation,LanzhouInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Lanzhou730030,China)

In addition to application in chemical manufacturing processes, epoxyethane is widely used in processes of food fumigating sterilization, particularly of grains and dried fruits. During the last decades, many research works have been focused on epoxidation reactions of ethylene by supported catalysts such as transition metal complexes and metal nanoparticles. In contrast with chemical synthetic methods, the biocatalytic reaction appears to be a mild and simple method. One biocatalytic method for producing epoxyethane is using methane monooxygenase (MMO) to insert oxygen across the carbon double bonds of ethylene. Epoxyethane synthesis byMethylosinustrichosporiumIMV 3011 whole cells which contains the MMO has significant application potential as it is performed at normal temperature and pressure and causes no pollution. The process for producing epoxyethane was described. The effect of initial ethylene concentration on production of epoxyethane was studied. Initial concentrations of oxygen, ethylene and nitrogen were 50%, 20% and 30%, respectively. The amount of epoxyethane formed by free biocatalyst was 29 μmol/mg in approximately 6 h. Moreover, the amount of epoxyethane formed by immobilized biocatalyst was 34 μmol/mg in approximately 8 h. In a batch reaction system, the regenerated immobilized biocatalyst can be repeatedly used for 8 times and 89% of initial MMO activity was retained, and the amount of epoxyethane formed was 3.4 nmol.

food fumigant; epoxyethane; methanotrophic bacteria; biocatalyst; epoxidation

10.6041/j.issn.1000-1298.2017.02.043

2016-09-29

2016-11-22

國家自然科學基金項目(21073050、21573055)

徐寧(1981—)，女，博士生，東北農業大學講師，主要從事食品生物技術研究,E-mail: xuningneau@163.com

辛嘉英(1966—)，男，教授，博士生導師，主要從事生物催化研究，E-mail: xinjiayingvip@163.com

TS255.1

A

1000-1298(2017)02-0322-05