D-氨基酸氧化酶的分離純化及固定化研究

張軍耀，夏敬云

（1.新昌縣大眾化工有限公司，浙江紹興 312500；2.浙江來益生物技術(shù)有限公司，浙江嵊州 312400）

D-氨基酸氧化酶的分離純化及固定化研究

張軍耀1，夏敬云2

（1.新昌縣大眾化工有限公司，浙江紹興 312500；2.浙江來益生物技術(shù)有限公司，浙江嵊州 312400）

在工業(yè)生產(chǎn)的原料當(dāng)中，D-氨基酸氧化酶屬于一種具有重要的工業(yè)價(jià)值的原料，可以良好構(gòu)建出大腸桿菌中經(jīng)過乳糖誘導(dǎo)發(fā)酵的表達(dá)式，從而對(duì)其中的菌體進(jìn)行提取粗酶液，在進(jìn)行固化提純的過程當(dāng)中，需要保證其中的活性物質(zhì)的活性沒有明顯的損失，提升其底物部分的轉(zhuǎn)化率，因此就需要對(duì)氨基酸氧化酶的分離提純技術(shù)進(jìn)行研究。首先對(duì) D-氨基酸氧化酶進(jìn)行了概述，其次對(duì)其提純固化的方式進(jìn)行了研究。

D-氨基酸氧化酶；分離純化 ；固定化

隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，很多新型的原料被應(yīng)用在了工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中，在提高了工業(yè)生產(chǎn)效率的同時(shí)，也對(duì)于原料資源的利用程度進(jìn)行了不斷的提高。在這個(gè)過程當(dāng)中，氨基酸氧化酶便是一種相當(dāng)重要的原材料，可以利用其催化反應(yīng)進(jìn)行形成相對(duì)應(yīng)的酮酸和氧，并且將氧化氫等物質(zhì)進(jìn)行釋放。在對(duì)物質(zhì)進(jìn)行提純的過程當(dāng)中需要進(jìn)行不斷的深入研究，從而保證其提純過程當(dāng)中純凈程度，從而為工業(yè)生產(chǎn)提供更高純凈度的原材料。

1 D-氨基酸氧化酶概述

D-氨基酸氧化酶，屬于一種以黃素腺嗓吟二核昔酸為輔基的典型黃素蛋白酶類，在實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用當(dāng)中可以對(duì)其進(jìn)行催化，其中產(chǎn)生的氧化脫氧反應(yīng)可以生成相對(duì)應(yīng)的酮酸和氧，在其中會(huì)受到分子氧氣的還原影響，進(jìn)行氧化氫的釋放。在這個(gè)過程當(dāng)中，由于酶對(duì)于其催化反應(yīng)當(dāng)中底物的高度在選擇方面是具有相當(dāng)大的光譜性的，因此可以利用此種特點(diǎn)來對(duì)其進(jìn)行定量分析，在分析當(dāng)中，需要充分的實(shí)現(xiàn)兩步酶法進(jìn)行生產(chǎn)。在 D-氨基酸氧化酶的實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中，在工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中可以作為主要的工業(yè)用酶進(jìn)行實(shí)際的應(yīng)用，并且也受到了工業(yè)生產(chǎn)者的廣泛關(guān)注，因此需要對(duì)氨基酸氧化酶進(jìn)行基礎(chǔ)性的研究以及生物催化劑的研究開發(fā)。

2 提純固化的方式的實(shí)驗(yàn)研究

2.1 實(shí)驗(yàn)材料以及實(shí)驗(yàn)方法

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的過程當(dāng)中，首先需要對(duì)其材料進(jìn)行確定，在本實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，需要以自制的氨基酸氧化酶進(jìn)行為主要的研究對(duì)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)其大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)研究。

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程當(dāng)中，首先需要對(duì)其活力進(jìn)行不斷的測(cè)定，需要以D-甲硫氨酸為底物，來進(jìn)行檢測(cè)DAAO的活力，并且在檢測(cè)的過程當(dāng)中還要根據(jù)酶和 D-甲硫氨酸底物反應(yīng)生成相應(yīng)的酮酸，但是而在堿性條件下酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)，并且有可溶性棕色生成物出現(xiàn)，因此還要在550nm 處進(jìn)行定量測(cè)定。酶的活力可以定義為在 pH 值為8.5的情況下，并且其周圍的環(huán)境溫度保持在37℃的情況下可進(jìn)行每分鐘產(chǎn)生1μg 的酮酸所需要的酶的含量為一個(gè)活力單位。

在對(duì)氨基酸氧化酶的分離純化的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，需要對(duì)其中存在的菌體按照3∶1的比例加入磷酸緩沖液當(dāng)中，在對(duì)其進(jìn)行攪拌均勻之后，就可以實(shí)現(xiàn)在冰浴當(dāng)中進(jìn)行超聲，最終使得菌體當(dāng)中得到充分的破碎。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，需要將氨基酸氧化酶無細(xì)胞提取液按照規(guī)定的比例加入到載體當(dāng)中，在保證和載體進(jìn)行充分融合之后，就可以充分地對(duì)其實(shí)驗(yàn)洗白，最終得到純酶液，來進(jìn)行固定化的研究。

最后在對(duì)DAAO進(jìn)行固定化的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，可以利用純酶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，用環(huán)氧活化的聚丙烯酸載體來進(jìn)行固定化，并且按照載體和純酶的科學(xué)的比例下利用磷酸來進(jìn)行緩沖液的洗滌，在4℃的溫度下得到保存?zhèn)溆弥螅涂梢匀〉霉潭ɑ拿福缶涂梢詫?duì)其中的蛋白吸附率以及活力回收率進(jìn)行計(jì)算，最終對(duì)其固定效果進(jìn)行考察。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論

經(jīng)過上述的實(shí)驗(yàn)方式，可以得出超聲破壁的最適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，在經(jīng)過不同時(shí)間的超聲破壁的實(shí)驗(yàn)下，可以發(fā)現(xiàn)其超聲在16min 的工作時(shí)間之內(nèi)，其中酶的活力是處于最高的狀態(tài)當(dāng)。如果時(shí)間過長(zhǎng)的話，酶的活力反而會(huì)下降，在這個(gè)過程當(dāng)中超聲的時(shí)間在過長(zhǎng)的情況下，會(huì)在很大程度上引起酶液的溫度的升高，而對(duì)酶的活力造成不利的影響，最終影響其蛋白的增多。

在載體當(dāng)中投入不同比例的酶的時(shí)候，在對(duì)載體自身的吸附率也會(huì)產(chǎn)生一定程度的影響，一般情況下，載體自身吸附量會(huì)隨著粗酶液當(dāng)中蛋白量的增加而得到不斷的增加現(xiàn)象的，如果載體達(dá)到一定程度的飽和狀態(tài)的時(shí)候，吸附量就會(huì)停止增加，如果酶自身和載體的比例在增加的情況下，酶活的概率和純化的倍數(shù)也會(huì)不斷的增加，但是在得到一定程度的參數(shù)值之后，就會(huì)出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，其中的原因主要是由于載體當(dāng)中吸附量如果達(dá)到了一定的數(shù)值之后，酶的吸附力就需要兩者之間產(chǎn)后更大的吸附能力，如果產(chǎn)生了接近或者達(dá)到載體的飽和程度的情況下，酶自身當(dāng)中的吸附能力就很難增加，因此就會(huì)造成殘留的酶酶不斷增加的現(xiàn)象。

在本文中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，所應(yīng)用到的粗酶和載體之間的比例為600U ∶ 1g，其中的超聲波破碎離心得50mL 的粗酶液，在經(jīng)過一定程度的分離純化之后就會(huì)得到相對(duì)應(yīng)的10mL的純酶液，其中純化倍數(shù)可以達(dá)到自身的 9.91 倍之多，并且酶活的率達(dá)到了38.35%。其中在 DAAO 分離純化流程當(dāng)中，ell-freeextract的數(shù)值分別在 50、1 504.8、262.78、5.73、1.0 以及 100 的情況下，相對(duì)應(yīng)的 PI-30-IDA-CoAffinitypurification 的數(shù)值分別為 10、577.15、10.717、56.742、9.91 以及 38.53。

最后，在對(duì)固定化酶和游離性質(zhì)的酶進(jìn)行比較的時(shí)候，經(jīng)過環(huán)氧載體的固定之后，其中的固定化的酶活力保持在9.996，并且其中的活力回收達(dá)到了42.44%，其中的蛋白吸附率達(dá)到了98%。對(duì)其最適合反應(yīng)的溫度進(jìn)行了確定，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)可以說明了游離情況下的酶最適反應(yīng)體系溫度為35℃，固定化酶的最適反應(yīng)溫度都有所提高到40℃。

在固定化酶的pH穩(wěn)定性的研究當(dāng)中，在本文當(dāng)中進(jìn)行了不同程度的研究，并且還要放置在2h以上，然后還需要其中的殘余的酶活力進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)過檢測(cè)證明，游離狀態(tài)下的酶的 pH 在 8.5～9.0 的穩(wěn)定性是相對(duì)較好的，但是固定化的酶 pH穩(wěn)定性是相對(duì)較寬的。

3 結(jié)束語

綜上所述，在進(jìn)行氨基酸氧化酶的提純過程當(dāng)中，和金屬離子有著相當(dāng)高的親和性，因此在進(jìn)行提純的時(shí)候可以利用其自制的金屬離子來實(shí)現(xiàn)對(duì)其的分離純化，最終保證酶的活性綜合可以在35% 以上。在進(jìn)行提純固化的過程當(dāng)中，需要利用一系列的載體來進(jìn)行固定化，保證其熱穩(wěn)定性以及pH的穩(wěn)定性可以在一定程度上得到不斷的提升，此種現(xiàn)象對(duì)于固定化酶的實(shí)際應(yīng)用方面是具有相當(dāng)有利的條件，在對(duì)酶進(jìn)行固定化之后，酶當(dāng)中的實(shí)際載體會(huì)實(shí)現(xiàn)多點(diǎn)結(jié)合地現(xiàn)象，最終保證酶的結(jié)構(gòu)可以更加牢固和穩(wěn)定，最大程度的提升其穩(wěn)定性，為工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供了相當(dāng)廣闊的前景基礎(chǔ)。

[1] 王筱蘭，孫兵兵，楊志平 ，等.D- 氨基酸氧化酶的 分離純化及固定化研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（工科版），2008，30（2）：112-115.

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[3] 鄧森文.D- 氨基酸氧化酶和青霉素G酰化酶的分子改造與應(yīng)用研究[D].上海：華東理工大學(xué)，2015.

[4] 李玲.L- 谷氨酸氧化酶發(fā)酵條件及分離純化的研究[D].濟(jì)南：山東輕工業(yè)學(xué)院，2012.

Study on Isolation，Purification and Immobilization of D-Amino Acid Oxidase

Zhang Jun-yao，Xia Jing-yun

In the raw materials of industrial production，D-amino acid oxidase belongs to a kind of raw material which has important industrial value.It can construct the expression of lactose-induced fermentation in Escherichia coli，so as to extract the bacteria In the process of curing and purification，it is necessary to ensure that there is no significant loss of the activity of the active substance，and the conversion rate of the substrate is improved.Therefore，it is necessary to study the separation and purification technology of amino acid oxidase The In this paper，the D-amino acid oxidase was first reviewed，and the practical application of the method was studied.

D-amino acid oxidase；isolation and purification；immobilization

Q814

B

1003-6490（2017）06-0175-02

2017-05-11

張軍耀（1966—），男，浙江紹興人，工程師，主要研究方向?yàn)獒t(yī)藥化工。