紫娟茶中花青素的抑菌性研究

戴妙妙，馬紅青，王婷婷，張曉峰

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海201114）

紫娟茶中花青素的抑菌性研究

戴妙妙，馬紅青，王婷婷，張曉峰

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海201114）

紫娟茶由含酸甲醇提取后，經(jīng)過乙醚、氯仿的液液分配以及AmberliteXAD-7HP樹脂的吸附洗脫，得到花青素粗提物。針對花青素提取物，采用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌對花青素提取物的抑菌作用進行了檢測。試驗結(jié)果顯示，紫娟茶中花青素提取物濃度達到10%～20%時對金黃色葡萄球菌抑菌能力較強，其次是大腸桿菌，但對酵母菌無效果。本研究的結(jié)果為紫娟茶花青素的深入研究與有效開發(fā)利用，提供了必備的表征條件和理論依據(jù)，并有助于食品原料的深度加工和功能性檢測方法的應(yīng)用與開發(fā)。

紫娟茶；花青素；抑菌性

近年來隨著合成與半合成抗菌素的增多和廣泛使用，細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，已成為21世紀(jì)全球關(guān)注的熱點。尤其是，食品在加工生產(chǎn)、運輸儲藏過程中極易受到食源性疾病的致病菌的污染。出于對食品安全的考慮食品行業(yè)一向反對在食品中添加化學(xué)合成抑菌劑，這使得業(yè)界對天然來源抑菌劑的應(yīng)用越來越重視。

國內(nèi)茶葉中罕見的品種——紫娟茶[1]，干茶色澤為紫色，湯色也為黑紫色，香氣純正，滋味濃強。其茶樹是具有紫莖、紫葉、紫芽（紫色的芽尖）等特征的一種特異植株。紫娟茶中含有種類豐富的活性成分，其芽葉經(jīng)過蒸餾得到的浸出物含量為44.58%，茶多酚（Tea Polyphenols）的含量為35.52%，咖啡堿（Theine）31.01mg/g，花青素29.14mg/g，黃酮類化合物12.82mg/g，鋅30.25mg/kg，氨基酸總量346.19mg/g，兒茶素（Catechin）總量201.86mg/g，其中的花青素含量高出普通紅芽茶（5mg/g～10mg/g）兩倍[2]。根據(jù)云南茶研所研究分析證明，紫娟茶有降血壓、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病、抗高蛋白過敏及抗HIV宿主細(xì)胞功效等作用，并能緩解眼疲勞、預(yù)防視力下降等功效。其較高含量的鋅、黃酮類和豐富的花青素是其呈現(xiàn)上述功效的主要物質(zhì)。

當(dāng)前作為稀有品種的紫娟茶在國內(nèi)外少有研究報道，特別是其生理活性如抑菌性等鮮有具體的科學(xué)數(shù)據(jù)，本研究針對這些內(nèi)容進行了探討。以紫娟茶為原料，通過含酸甲醇提取后，經(jīng)過乙醚、氯仿的萃取，再通過Amberlite XAD-7HP樹脂的吸附洗脫，最后得到其花青素的粗提物，并對紫娟茶中花青素的抑菌性進行了研究，主要針對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌3種菌種。采用微生物檢測的經(jīng)典方法[3]抑菌圈測量進行檢測。抑菌圈是在涂布特定試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)用抑菌物質(zhì)行成立體球狀擴散，形成的一個透明圈，使試驗菌的繁殖受到抑制。抑菌性可以通過抑制細(xì)菌（革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌）、真菌、病毒等進行評價。這些方法都是目前國內(nèi)外使用較廣泛的研究手段，其穩(wěn)定性及廣泛的認(rèn)知度廣受研究者推崇。

希望通過本研究的試驗探討為我國茶產(chǎn)業(yè)的深加工以及功能性食品的研發(fā)提供一臂之力。

1 材料與方法

1.1 原料

紫娟茶（市售），于4℃冰箱保藏，待用。

1.2 儀器

CP214C電子天平：Ohaus；RE5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FE20精密pH計：Mettler Toledo；HHS-21-4孔型電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療機械五廠；SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；90-1恒溫磁力攪拌器：上海精科實業(yè)有限公司；LGJ-18C冷凍干燥機：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；P20、P100移液器：Gilson；XS105DU分析天平：Mettler Toledo；HZ-8812S水浴恒溫振蕩器：常州市凱航儀器有限公司；LT-CPS38D立式壓力蒸汽滅菌器：立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司；LHP-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱：常州冠軍儀器制造有限公司。

1.3 試劑

甲醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚均為AP純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸（TFA）為HPLC純（Aladdin）；Amberlite XAD-7HP大孔吸附樹脂（Rohm& Haas)；營養(yǎng)瓊脂斜面、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）：青島海博生物技術(shù)有限公司；84消毒液：北京柯林龍安醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

1.4 菌種

ATCC25923金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、ATCC25922大腸桿菌（Escherichia coli）、ATCC 18790酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）均采購于（美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC））。

1.5 花青素的制備[4]

稱取300 g紫娟茶葉于5 L燒杯中，加2%TFA甲醇浸提液至浸沒茶葉，4℃下避光靜置21 h，過濾收集濾液，殘渣繼續(xù)用2%TFA甲醇浸提液浸泡，4℃下避光靜置4 h，收集濾液，共重復(fù)3次。合并3次浸提濾液，得到紫娟茶浸提濾液約4 L。4 L紫娟茶浸提濾液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去甲醇，直至無甲醇?xì)埩簦玫阶暇瓴璐痔嵋杭s500mL，調(diào)節(jié)pH＜2。500mL紫娟茶粗提液，先用乙醚進行3次～5次萃取，每次乙醚使用100mL～ 200mL，直至有機層無色顯現(xiàn)，收集水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，乙醚能除去紫娟茶粗提液中的脂質(zhì)脂溶性色素等；再用氯仿進行3次～5次萃取，每次氯仿使用100mL～200mL，至有機相無色，取水層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，水溶液濃縮至300mL，調(diào)節(jié)pH＜2，氯仿能除去紫娟茶粗提液中的咖啡堿。將300mL紫娟茶粗提水溶液以16mL/min的流速，緩慢滴入層析柱（Φ2.5 cm× 60 cm）中，靜置20min～30min，使其充分吸附在樹脂上[4]。先用1 L 0.1%TFA水溶液洗脫，除去一些水溶性的單糖、氨基酸等小分子的雜質(zhì)；再用2 L 0.1%TFA甲醇溶液洗脫，直至無有色物質(zhì)洗脫下來，收集洗脫液。將紫娟茶粗提洗脫液在35℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去甲醇，直至無甲醇?xì)埩簦賹⑵渲糜?60℃冷阱中冷凍6 h，隨后在1.0Pa真空度下冷凍干燥18 h以上，得到紫娟茶粗提物27.6 g。稱取上述20.0 g紫娟茶粗提物于燒杯中，加400mL乙酸乙酯，磁力攪拌30min，進行3次固液萃取，收集不溶固體，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸去乙酸乙酯，直至無乙酸乙酯殘留，再將其置于-60℃冷阱中冷凍6 h，隨后在1.0Pa真空度下冷凍干燥18 h以上，得到花青素粗提物4.3 g，于4℃冰箱保藏備用。

1.6 抑菌性的評價

1.6.1 培養(yǎng)基的制作[5]

1.6.1.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

稱取營養(yǎng)瓊脂斜面23.0 g于三角瓶中，加1 L去離子水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH7.3±0.1，分裝三角瓶中，在121℃高壓滅菌15min，備用。該培養(yǎng)基中蛋白胨和牛肉粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配方見表1。

表1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的配方Table1 The formulation of the nutrient agar medium

1.6.1.2 PDA培養(yǎng)基

稱取PDA 46.0 g于三角瓶中，加1 L去離子水，攪拌加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH5.6±0.2，分裝三角瓶中，在115℃高壓滅菌20min，備用。滅菌好的培養(yǎng)基僅可重復(fù)加熱熔化一次。該培養(yǎng)基中馬鈴薯浸出粉有助于各種霉菌的生長；葡萄糖提供能源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。PDA培養(yǎng)基的配方見表2。

表2 PDA培養(yǎng)基的配方Table2 The formulation of the PDA medium

1.6.2 菌種的活化

1.6.2.1 細(xì)菌

G+菌（金黃色葡萄球菌）、G-菌（大腸桿菌）：直接用無菌接種環(huán)取數(shù)環(huán)菌種放在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基里，先在37℃，120 r/min轉(zhuǎn)速下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，再涂板，于37℃，120 r/min轉(zhuǎn)速下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，最后取單個菌落接在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基里，在37℃，120 r/min轉(zhuǎn)速下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，控制pH在7.2～7.4之間。

1.6.2.2 酵母菌

先恢復(fù)培養(yǎng)，將深凍菌種在水浴中溶解，用接種環(huán)接種到PDA培養(yǎng)基中，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，這個步驟也稱為“復(fù)壯”。再從平皿中挑取菌種，接到PDA培養(yǎng)基中，于28℃，180 r/min轉(zhuǎn)速下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。最后以1∶100（質(zhì)量比）比例，將種子液接到PDA培養(yǎng)基中，以實施擴大培養(yǎng)。

1.6.3 菌種的培養(yǎng)

1.6.3.1 細(xì)菌

金黃色葡萄球菌（G+菌）、大腸桿菌（G-菌）：將活化后的菌種，用接種環(huán)挑取一環(huán)于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃，120 r/min轉(zhuǎn)速下恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。再用適量滅菌生理鹽水洗下，作為細(xì)菌107CFU/mL菌種液備用。

1.6.3.2 酵母菌

將活化后的菌種，用接種環(huán)挑取一環(huán)于PDA培養(yǎng)基上，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d～3 d，至菌種生長良好。再用適量滅菌生理鹽水洗下，作為酵母菌106CFU/mL菌種液備用。

1.6.4 樣液配制

1%、10%、20%花青素水溶液：稱取0.05、0.5、1 g花青素于燒杯中，加滅菌生理鹽溶解至5 g，混勻備用。1.6.5濾紙片的制備

將吸水力較強而質(zhì)地均勻的雙層定型濾紙用打孔機打成直徑6mm的圓形濾紙片，置潔凈干燥的培養(yǎng)皿中，121℃高溫滅菌20min，備用。

1.6.6 抑菌圈的測定

圖1 抑菌試驗的流程圖Fig.1 The flow chart of antibacterial test

將高溫蒸汽滅菌后的固體培養(yǎng)基加熱熔化后，冷卻至45℃～50℃，倒入培養(yǎng)皿中。待重新冷卻凝固，正置在烘箱內(nèi)烘干瓊脂表面水分。把配制好的菌種液，振蕩均勻，用無菌移液器吸取0.1mL菌種液滴加在培養(yǎng)基表面，將其均勻地涂布于平板表面。取無菌并干燥的濾紙片放在每個平皿中心，然后再用無菌移液器分別吸取10μL 1%、10%、20%花青素水溶液樣液，垂直滴加到濾紙片上。再放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌在37℃恒溫培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)1 h后倒置培養(yǎng)24 h；酵母菌28℃恒溫培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)1 h后倒置培養(yǎng)48 h。觀察抑菌情況，并測量抑菌圈大小，每種菌種做2次平行試驗，以抑菌圈的大小表征抑菌活性的強弱。以浸有無菌水濾紙片作空白對照，以浸有10% 84消毒液濾紙片作為陽性對照。以上操作均在無菌條件下進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 花青素的制備

300 g紫娟茶葉，經(jīng)甲醇粗提→濃縮→乙醚、氯仿萃取→樹脂純化，獲得紫娟茶粗提物27.6 g深紅色多酚類物質(zhì)，提取得率為9.2%；再經(jīng)乙酸乙酯萃取→冷凍干燥，得到花青素粗提物4.3 g深紫色花青素，提取得率為2.0%。由于花青素粗提物經(jīng)過冷凍干燥的物理處理，所以隨后的保存也必須為低溫，用時方可恢復(fù)至室溫；其次，因為花青素光穩(wěn)定性較差，要保持鮮有的質(zhì)性，必須避光保存。

2.2 抑菌性的評價

抑菌圈法[6]是衡量殺菌防霉劑效果的一種方式，在抑菌物質(zhì)的周圍形成透明圈，通過透明圈大小來評價抑菌效果，主要用于測定殺菌防霉劑對細(xì)菌、酵母菌的抑菌作用，抑菌圈的大說明抑菌明顯，小則表示抑菌性較弱。抑菌效果比較見表3，抑菌圈直徑比較見表4。

表3 抑菌效果比較Table3 Comparison of antibacterial effect

表4 抑菌圈直徑比較Table4 Comparison of antibacterial ring

1%、10%、20%樣液濃度金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、酵母菌抑菌圈見圖2、圖3、圖4。

圖2 1%、10%、20%樣液濃度金黃色葡萄球菌抑菌圈Fig.2 The antibacterial effect of 1%，10%，20% Staphyloccocus aureus

圖3 1%、10%、20%樣液濃度大腸桿菌抑菌圈Fig.3 The antibacterial effect of 1%，10%，20% Escherichia coli

圖4 1%、10%、20%樣液濃度酵母菌抑菌圈Fig.4 The antibacterial effect of 1%，10%，20% Saccharomyces cerevisiae

由表4所示，在對金黃色葡萄球菌的抑菌性試驗中，當(dāng)紫娟茶中花青素提取物濃度為1%時，抑菌圈大小無變化，說明無抑菌作用；當(dāng)濃度在10%～20%范圍時，抑菌圈大小為7.5mm和8mm，說明隨濃度增大抑菌圈增大抑菌作用增強。在對大腸桿菌的抑菌性試驗中，當(dāng)紫娟茶中花青素提取物濃度為1%時，抑菌圈大小也無變化，說明無抑菌作用；當(dāng)濃度在10%～20%范圍時，抑菌圈大小為6.5mm和7mm，說明隨濃度增大抑菌圈增大抑菌作用增強。在對酵母菌的抑菌性試驗中，當(dāng)紫娟茶中花青素提取物濃度為1%～20%時，抑菌圈大小都無變化，說明無抑菌作用。

此結(jié)果與J.C?té等[7]研究的蔓越莓汁對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯抑菌作用的結(jié)論相一致，并與Cigˇdem Uysal Pala等[8]研究的石榴汁對酵母菌無抑制作用但對大腸桿菌有強抑菌性的結(jié)論相一致。

3 結(jié)論

通過金黃色葡萄球菌（G+菌）、大腸桿菌（G-菌）、酵母菌3種不同的菌種進行抑菌試驗，證明紫娟茶中花青素具有一定的抑菌性。試驗結(jié)果表明，紫娟茶中花青素提取物濃度為10%～20%時對金黃色葡萄球菌（G+菌）的抑菌效果明顯；對大腸桿菌（G-菌）抑菌效果較明顯；對酵母菌抑菌作用幾乎沒有。

[1]楊興榮,包云秀,黃玫.云南稀有茶樹品種“紫娟”的植物學(xué)特性和品質(zhì)特征[J].茶葉,2009,35(1):17-18

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[3]G E Pantelidis,M Vasilakakis,G A Manganaris,et al.Antioxidant capacity,phenol,anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries,blackberries,red currants,gooseberries and Cornelian cherries[J].Food Chemistry,2007,102:777-783

[4]Cuevas-Rodríguez EO,Dia VP,Yousef GG,et al.Inhibition of proinflammatory responses and antioxidant capacity of Mexican blackberry(Rubus spp.)extracts[J].J Agric Food Chem,2010,58(17): 9542-9548

[5]周邦靖.常用中藥的抗菌作用及其測定方法[M].重慶:科學(xué)技術(shù)文獻出版社重慶分社,1987:291-298

[6]郝滌非.微生物實驗實訓(xùn)[M].武漢:華中科技大學(xué)出版社,2012: 157-159,81-82

[7]J C?té,S Caillet,G Doyon,et al.Antimicrobial effect of cranberry juice and extracts[J].Food Control,2011,22(8):1413-1418

The Study on the Antibacterial Activity of Anthocyanins from Zi juan Tea

DAI Miao-miao，MA Hong-qing，WANG Ting-ting，ZHANG Xiao-feng
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai201114，China）

Anthocyanins from Zi juan tea were exteacted by using acid-containing methanol as solvent and partitioned with ether and chloroform.The extract of anthocyanins was purified by Amberlite XAD-7HP chromatography.The antibacterial effects of anthocyanins extraction for Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae were also tested.The results were that the concentration of anthocyanins in Zi juan Tea extract reaches 10%-20%of Staphylococcus aureus antibacterial ability was stronger，followed by Escherichia coli，but Saccharomyces cerevisiae has no effect.This study will provide scientific basis for developing and utilizating of Zi juan tea and contribute the depth of processing of food materials and functional application.

Zi juan tea；anthocyanin；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.007

2016-03-11

戴妙妙（1984—），女（漢），工程師，工程碩士，研究方向：產(chǎn)品安全研究。