溶菌酶的分離方法及進展

(泰州學院，江蘇 泰州 225300)

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溶菌酶的分離方法及進展

宋娟

(泰州學院，江蘇 泰州 225300)

溶菌酶是一種生物酶，可選擇性地分解微生物的細胞壁。作為一種天然安全的殺菌劑、防腐劑，溶菌酶在醫藥、食品行業、飼料工業得以廣泛的應用。本文綜述了溶菌酶生產工藝中各種分離方法及其進展，對未來溶菌酶的分離純化進行了展望。

溶菌酶 ； 分離 ； 純化

Keywords:lysozyme ； separation ； purification

溶菌酶又稱胞壁質酶，是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶，廣泛存在于人和高等動物的組織、分泌物及體液中，鳥類和家禽的蛋清以及微生物中也含此酶，其中以新鮮雞蛋清中含量最為豐富[1]。溶菌酶本身無毒，它可以在不破壞其他組織的前提下，選擇性地分解微生物的細胞壁。這一特性使其成為一種天然安全的殺菌劑、防腐劑，在醫藥、食品行業、飼料工業得以廣泛的應用[2-7]。此外，溶菌酶還可以被用作基因工程和細胞工程中細胞融合操作必不可少的工具酶，應用價值極高[8]。近年來，隨著生物分離技術的不斷推陳出新，溶菌酶分離純化的方法也愈來愈多，從傳統的結晶法到離子交換法和色譜法，再到后來的新技術如膜分離技術、超濾法和親和—膜過濾技術等[9]。本文就近年來常用的一些分離純化方法進行綜述。

1 分離純化方法

1.1結晶法

結晶法是制備溶菌酶晶體最傳統的一種方法，1937年MayerAbraham等獲得結晶溶菌酶之后，Alderton等[10]在1945年提出了直接結晶法。該法根據溶菌酶耐熱、耐酸，在鹽溶液中易溶且穩定性好的特性，加入中性鹽使其溶解。然后利用溶菌酶和其他物質等電點的差異，調節溶液的pH值使其析出。結晶法操作簡單但生產周期長，雖然經過重結晶可得到高純度的溶菌酶，不過原料損耗相對較大，產率一般為60%～80%。楊景芝等[11]對傳統方法進行改進，在加入中性鹽之前用724樹脂進行吸附，隨后將洗脫液進行鹽析，透析后調整透析液pH值，二次調整其pH值，加入磷酸緩沖溶液，最后離心去除雜質得到純化液。經過改進，從雞蛋清中提取溶菌酶的產率提高，并且活性增加。因為結晶法要求溶菌酶的含量相對較高，對于微量的溶菌酶分離效果較差，所以目前除了蛋清，其他來源的溶菌酶分離純化一般不采用結晶法。

1.2離子交換法

離子交換法一直是分離純化溶菌酶常用的方法，是利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異來分離純化物質的一種方法。因為溶菌酶為堿性蛋白質，最適宜酸度pH值為6.5，故可利用弱酸型陽離子交換樹脂對其進行分離，然后再用氯化鈉或硫酸銨溶液洗脫，達到分離的目的。該法簡便、高效、成本低，可實現自動化連續操作。常用的離子交換劑有Duolite-464、羧酸纖維素(PC)、羧甲基纖維素(CMC)和羧甲基瓊脂糖等[12]。李蓉等[13]選擇硅膠基質交換柱，建立了比傳統的軟基質離子交換分離速度快、純化效率高的新方法。將蛋清樣品勻漿后，用NaCl初步純化，然后用硅膠基質弱陽離子交換柱XIDACE-WCX分離，溶菌酶純化倍數提高了5.6倍。溶菌酶活性回收率為107%，蛋白的比活為15 467 U/mg。余海芬等[14]探索出一種高收率、高活性的雞蛋清溶菌酶提取技術，選用D152陽離子交換樹脂，確定了最佳提取條件，得率為2.95 mg/mL，比活為9 500 U/mg左右，純度為96.3%。趙林等[15]將蛋清稀釋后先利用等電點沉淀去除部分雜質，然后利用快流速羧甲基—瓊脂糖凝膠柱層析進行純化。得到的溶菌酶純度達到95%以上，比活達到17 600 U/mg，收率達到4.2 mg/mL，比余海芬等收率高約42.4%，比活也提高很多，高效快速地完成了蛋清溶菌酶的純化。離子交換法提取分離蛋清中溶菌酶，設備簡單成本低，操作方便周期短，且所得溶菌酶活力和收率較高，適合工業化生產。

1.3色譜法

色譜法以親和力為基礎，制備具有特異親和性的分離介質，選擇性地吸附生物活性物質，再依據待分離物質的特性選擇適合的溶液洗脫而達到分離的目的，其中以20世紀80年代末發展起來的親和色譜技術應用最廣。親和色譜又稱為親和層析法，是根據酶與作用底物的特異性親和能力，利用酶分子獨有的專一性結合位點或結構性質的分離方法，它的選擇性好、高效快速，能夠滿足蛋清溶菌酶高效分離與純化的需要。HeL Z等[16]采用多步親和層析法分離純化溶菌酶，結果表明，利用三步親和層析系統對溶菌酶進行純化，可以將產率從一步法的61%提高到96%。王建山等[17]利用一種新型的強陽離子交換/疏水色譜(SCX/HIC)雙功能色譜柱構建了在線單柱二維液相色譜(2DLC-1C)，利用在線2DLC-1C技術在70 min內完成了對雞蛋清中溶菌酶、卵清蛋白和卵轉鐵蛋白三種活性蛋白的快速分離純化，其純度分別為95%、93%和97%。該分離系統實現了自動控制，操作簡單，易于放大，純化速度快，有望廣泛應用于活性蛋白的快速分離制備和工業化生產。

1.4膜分離技術

膜處理技術是指在一定的驅動力下，使溶液通過一定孔徑的膜，達到濃縮溶質或凈化溶劑的效果，通稱為膜分離技術。工業化的膜分離過程主要有：微濾、超濾、反滲透、滲析、電滲析、氣體分離和滲透汽化。近來，研發人員以傳統的膜處理為基礎，將親和配基結合在分離膜上，利用親和配基與目標分子進行特異性結合，雜質則大部分透過膜孔流出，通過洗滌除去膜上殘留的雜質，然后將目標分子從膜上洗脫下來。它具有耗時短、反應溫和、純化效率高等特點，可作為分離、純化DNA和蛋白質等生物大分子的新型技術手段，現已廣泛運用。李靜等[18]用金屬螯合物作為配基的親和膜分離純化溶菌酶，實驗結果表明，親和膜對溶菌酶的選擇吸附性能良好，可以用親和膜直接從蛋清(殼)中分離提純溶菌酶，純度達17 500 U/mg。Bayramoglu G等[19]采用一種新型親和染料—配基復合膜對溶菌酶的吸附及動力學特征進行了研究。他們還將活性綠19固定在甲基丙烯酸羥乙酯殼聚糖復合膜上，使得溶菌酶在上面的吸附量相比于普通復合膜的提高了9倍[20]。

1.5超濾法

超濾是一種新興的分離純化物質的技術，它以壓力為動力，利用超濾膜不同孔徑對液體進行分離的物理篩分過程，具有產品得率高、雜質少、純度高等優點，一般應用在反滲析和濃縮等方面，近來也在蛋白質的分離純化中得到越來越多的應用。在無菌條件下操作，可以直接生產無菌的溶菌酶溶液，直接用于臨床治療[21]。如果在原料液中加入親和載體，再與傳統超濾技術相結合，而實現特異性分離目標產物的技術叫作親和—膜過濾技術。這項技術由Medda于1981年首次提出，它是首先利用相對分子質量較高的水溶性分子化合物為載體基質，在基質上耦連一定量能夠特異性結合目標分子的親和配基以獲得親和載體[22]。再利用親和載體親和吸附目標蛋白質分子結合形成大分子復合物，通過超濾膜進行超濾分離。此時超濾膜可以完全截留大分子復合物，而雜質分子則透過濾膜，接著用洗脫液解吸大分子復合物，使親和載體和目標分子分離后再次通過超濾膜。這次大分子親和載體將被截留，而目標蛋白質分子則通過濾膜得以純化[23]。陳萍等[24]以200 kDa的水溶性葡聚糖為基質，Cu2+做親和配基的大分子水溶性葡聚糖親和—超濾載體對溶菌酶的吸附分離特性。結果表明親和—超濾載體與溶菌酶的吸附能夠在短時間內達到吸附平衡，擬合最大理論吸附量為13.65 mg/g，親和—超濾載體有良好的重復使用特性，且平均洗脫率約達92%。

2 展望

溶菌酶由于其廣泛用途，成為生化領域研究的熱點，而溶菌酶的分離與純化方法更是研究的重點。目前因為雞蛋清中溶菌酶的含量較高，國內外主要從雞蛋清中提取溶菌酶，但是，即使在雞蛋清中的溶菌酶含量較高，也相當有限。為了滿足人們對溶菌酶越來越大的需求，探討高效的溶菌酶分離技術，提高溶菌酶生產質量，降低生產成本，適應各種應用的需求，勢在必行。單一分離純化方法往往存在純度不高、回收率低和自動化難以實現的問題，因此需要建立多階段復合的分離純化體系，再結合基因工程及蛋白質工程，建立重組溶菌酶的微生物表達系統，獲得能夠穩定表達出高活性溶菌酶的高產表達菌株，來提高溶菌酶產量和效率滿足大規模生產的需求。

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SeparationMethodsandProgressofLysozyme

SONGJuan

(Taizhou University，Taizhou 225300 , China)

Lysozyme is a kind of biological enzyme,which can selectively decompose cell wall of microorganisms.As a kind of natural and safe baltericide and antiseptic,lysozyme is widely used in medicine,food industry and feed industry.In this paper,the separation methods and progress of lysozyme production are reviewed.The separation and purification of lysozyme in the future is prospected.

2017-04-10

宋 娟(1977-)，女，副教授，從事應用化學方面的工作，電話：13912193222。

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