基于PCR-DGGE技術輔助篩選氨氮降解菌株

張智超，孫 宏，吳逸飛，王 新，姚曉紅，柳 永，湯江武，*，葛向陽，*

(1.華中農業大學 微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430030； 2.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

基于PCR-DGGE技術輔助篩選氨氮降解菌株

張智超1，孫 宏2，吳逸飛2，王 新2，姚曉紅2，柳 永2，湯江武2，*，葛向陽1，*

(1.華中農業大學 微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430030； 2.浙江省農業科學院 植物保護與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

將PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)與傳統梯度濃度富集手段相結合，從不同氨氮濃度養殖污水中篩選高活性氨氮降解菌株。結果表明，經過不同氨氮濃度的馴化，初篩得到22株菌株，分別測定其氨氮降解能力，最終得到3株氨氮降解能力較強的菌株，分別命名為ZZC-3、ZZC-4和ZZC-14。經16S rDNA鑒定后，分別為戈登氏菌屬、反硝化菌屬和紅球菌屬細菌。PCR-DGGE結果表明，反硝化桿菌屬的微生物在富集液中的含量最高，因此選擇ZZC-4為目標菌株。經過污水降解效果驗證，添加ZZC-4菌株的處理在144 h后水中氨氮和化學需氧量降解率分別達到90.8%和94.7%，顯示該菌株具有良好的應用開發前景。

PCR-DGGE；氨氮降解；反硝化菌屬

1 材料與方法

1.1 污水來源與配比

活性污泥采集于以活性污泥法處理污水并穩定運行的污水處理廠。養殖污水采集自金華市金帆生豬養殖場，原水氨氮含量829.3 mg·L-1，化學需氧量(COD)13 410 mg·L-1。配置氨氮含量分別為100、300、500、700 mg·L-1的馴化梯度污水，其配比分別為：10 mL 活性污泥+12.5 mL養殖污水+77.5 mL純凈水，10 mL 活性污泥+37.5 mL養殖污水+52.5 mL純凈水，10 mL 活性污泥+62.5 mL養殖污水+27.5 mL純凈水，10 mL 活性污泥+87.5 mL養殖污水+2.5 mL純凈水。

1.2 污泥馴化與氨氮降解菌初步篩選

馴化按照以下2種方式進行。

方式1(水平馴化)：取10 mL活性污泥分別接入到所設置的馴化梯度污水中，于160 r·min-1、30 ℃下培養5 d，取出100 μL培養液涂布LB固體平板，37 ℃培養48 h，挑取單菌落，進行3次劃線分離純化后，保藏于新鮮的LB斜面。

方式2(垂直馴化)：取10 mL活性污泥先接入到含氨氮100 mg·L-1的污水中，于160 r·min-1、30 ℃下培養5 d后轉接至下一馴化梯度，直至700 mg·L-1的馴化濃度培養完畢，取出100 μL培養液涂布LB平板， 37 ℃培養48 h，挑取單菌落，進行3次劃線分離純化后，保藏于新鮮的LB斜面。

同時將上述每個馴化梯度的污泥懸浮液于5 000 r·min-1離心5 min，保存至-20 ℃，用于提取總DNA。

1.3 菌株氨氮降解性能的測定

將獲得的初篩菌株接一環到LB液體培養基中，培養48 h后，取出2 mL培養液于5 000 r·min-1離心5 min，以無菌水洗滌菌體3次，最后加入500 μL無菌水混勻備用。

配制模擬污水，配方為：氯化銨8 g，無水乙酸鈉2 g，七水合硫酸鎂0.05 g，磷酸氫二鉀0.2 g，氯化鈉0.12 g，四水合硫酸錳0.01 g，硫酸亞鐵0.01 g，水1 L，調節pH至7.2，121 ℃滅菌30 min后備用，其氨氮含量為1 033.6 mg·L-1。

將獲得的菌懸液取500 μL接入到100 mL模擬污水中。每個菌株設置3個平行，于160 r·min-1、30 ℃條件下培養144 h，每隔48 h測定一次各供試模擬污水中的氨氮含量，并將具有較優氨氮降解效果的菌株接種于LB斜面，4 ℃條件下保存。

1.4 菌種鑒定

菌株DNA提取按照BioFlux細菌基因組抽提試劑盒(Cat.No：BSC12S1)說明書的步驟進行。PCR體系所用引物為27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-CTGAGCCAGGATCAAACTCT-3’)。PCR體系包括：10×transtaq buffer 2.5 μL(含有15 mmol·L-1的Mg2+)，dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL，上下游引物(10 μmmol·L-1)各0.4 μL，DNA模板1 μL(約30 ng)，用ddH2O補至25 μL。PCR程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，31個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物經1.5%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交生工生物工程(上海)有限責任公司測序。

1.5 污泥樣本的PCR-DGGE分析

取出1.2節所保藏的活性污泥樣本，以MOBIO Powersoil試劑盒(Cat.No：12888-50)提取總DNA，并擴增16S rDNA的V3區。所用引物為GC-341F(5’-CTACGGGAGGCAGCAG-3’)、517R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)。PCR體系同1.4節所述。PCR程序為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃45 s，72 ℃ 50 s，32個循環；72 ℃ 8 min。PCR產物經1.5%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，根據文獻的報道進行DGGE，分析其中細菌群落的變化。

1.6 DGGE條帶的測序分析

選取馴化結束時DGGE泳道中較亮的條帶放入無菌水中，4 ℃過夜后，以浸泡膠塊的無菌水為模板進行PCR擴增。擴增反應體系和程序同1.5節。擴增產物(約200 bp)經1.5%(m/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交生工生物工程(上海)有限責任公司測序。

1.7 菌株氨氮與COD降解能力驗證

將所獲得的復篩菌株接入LB液體培養基中，于30 ℃、160 r·min-1搖床培養2 d。取2 mL培養液， 5 000 r·min-1離心5 min后棄上清。無菌水洗滌3次后，取500 μL菌液接入至100 mL 模擬污水中(氨氮含量為1 027.3 mg·L-1，COD含量為1 545 mg·L-1)，30 ℃、160 r·min-1振蕩培養144 h，每隔48 h測定一次模擬污水中的氨氮和COD含量。

2 結果與分析

2.1 氨氮降解菌株的初篩分離與鑒定

通過2種方式的污水梯度馴化，共挑取22株菌株，依次命名為ZZC-1至ZZC-22。其氨氮降解能力檢測結果如表1所示。可以看出，有3株菌具有較強的氨氮降解能力，分別為ZZC-3、ZZC-4和ZZC-14。其中：ZZC-3和ZZC-4培養96 h后水中氨氮含量最低，氨氮降解率分別達到97.2%和97.8%；ZZC-14菌株在培養144 h后水中氨氮含量最低，氨氮降解率達到94.4%。

對ZZC-3、ZZC-4和ZZC-14菌株進行16S r-DNA測序后發現，3株菌的PCR產物長度均為1 500 bp左右(圖1)。將測序結果在GenBank中進行序列比對分析，ZZC-3屬于戈登氏菌屬(Gordoniasp.)，ZZC-4屬于反硝化菌屬(Denitrobactersp.)，ZZC-14屬于紅球菌屬(Rhodococcussp.)，相似度均達到99%。

2.2 馴化污泥樣品的PCR-DGGE分析

對馴化富集過程中的污泥樣本提取總DNA后進行PCR-DGGE分析，結果如圖2所示。6號和5號條帶所對應的菌株隨著馴化氨氮濃度的增加也逐漸增加。

表1 模擬污水中不同培養時間菌株對氨氮的降解效果

Table 1 Ammonia degradation rate of selected strains after different incubation time

菌株編號StrainNo.經過不同培養時間(h)水中的氨氮含量Ammoniacontentafterdifferentculturetime(h)/(mg·L-1)04896144ZZC-11033.8899.8782.1803.4ZZC-21033.81040.7958.5935.9ZZC-31033.863.728.939.8ZZC-41033.859.522.440.3ZZC-5ZZC-6ZZC-7ZZC-81033.81033.81033.81033.8966.8936.1980.9848.9921.1900.2804.3754.8837.31074.2766.8811.8ZZC-91033.8682.1591.0605.9ZZC-10ZZC-11ZZC-12ZZC-131033.81033.81033.81033.8763.81109.31012.4988.4711.4983.1861.5971.3602.0925.2819.9890.4ZZC-141033.8156.577.457.6ZZC-15ZZC-16ZZC-17ZZC-181033.81033.81033.81033.8893.4905.2956.7968.7557.6889.1842.7854.0501.8819.7772.1691.4ZZC-191033.8673.7652.9606.0ZZC-20ZZC-21ZZC-221033.81033.81033.8586.8911.3890.8405.5818.2790.4671.8782.3634.1CK-11033.8947.2931.7894.5CK-21033.8969.6960.2913.4

圖1 所選菌株的16S rDNA PCR結果Fig.1 16Sr DNA PCR results of the selected strains

2.3 DGGE條帶的測序鑒定

將圖2所示的7條條帶(長度約200 bp)切取、測序，序列在NCBI上進行比對后，結果如表2所示。條帶1號、3號、6號和7號分別屬于假單胞菌(Pseudomonassp.)、溶桿菌屬(Lysobactersp.)、反硝化菌屬(Denitrobactersp.)及產微球莖菌屬(Microbulbifermarinus)；條帶2號、4號和5號則屬于未培養菌(uncultured bacterium)。

1～4泳道為污泥水平馴化試驗結果，其中1、2、3和4泳道氨氮馴化濃度分別為100、300、500和700 mg·L-1；5～7泳道為污泥垂直馴化試驗結果，其中5、6和7泳道氨氮馴化濃度分別為300、500和700 mg·L-1。圖中標記1～7條帶為切膠位點Lane 1-4 showed the results of level acclimation， in which the ammonia concentration of lane 1， 2， 3， 4 was 100， 300， 500 and 700 mg·L-1， respectively. Lane 5-7 showed the results of vertical acclimation， in which the ammonia concentration of lane 5， 6， 7 was 300， 500 and 700 mg·L-1， respectively. Band 1-7 showed the cutting sites圖2 水平以及垂直梯度濃度氨氮污水馴化活性污泥DGGE指紋圖譜Fig.2 DGGE fingerprint picture of strain acclimation with gradient concentrations of ammonia nitrogen

根據圖2可知，反硝化菌屬在氨氮馴化終濃度的活性污泥中為優勢菌株，因此選擇ZZC-4作為后續的主要研究菌株。

2.4 ZZC-4菌株降解氨氮能力復測

由圖3可知，氨氮和COD在ZZC-4培養48 h內降解迅速，之后降解速率趨于平穩。培養144 h后，菌株ZZC-4對模擬污水中氨氮和COD的降解率達到最高，分別為90.8%和94.7%。

圖3 ZZC-4菌株降解COD和氨氮的能力Fig.3 Degradation of ammonia nitrogen and COD by ZZC-4 strain

表2 DGGE條帶測序結果

Table 2 Sequencing and analysis result of DGGE band

條帶號BandNo.近親種屬與NCBI登錄號ClosestrelativeandNCBIaccessionnumber相似度Identity/%1Pseudomonassp.154B7_12AR2A(KU644293.1)952UnculturedbacteriumcloneBR2-20(JQ855798.1)923Lysobactersp.FJY8(KR698371.1)964UnculturedsludgebacteriumcloneASB92(FJ947148.1)1005UnculturedbacteriumcloneI3Q1XXJ01A92AS(KP954248.1)986Denitrobactersp.BBTR53(DQ337593.1)997MicrobulbifermarinusstrainHQB734(KT758589.1)94

3 討論

經過不同濃度氨氮污水馴化，本研究獲得3株降解氨氮能力較高的菌株，其對氨氮的降解率均達到95%以上。目前，常用的篩選氨氮降解菌的方法一般有3種：傳統培養法，改變培養條件法和指示劑法。胡君利等[6]比較了篩選氨氮降解菌的方法后發現，通過平板篩選往往無法得到目的菌株。改變培養條件是根據所要篩選的菌株生長特性，設計、優化一種或多種因素，使目的菌株迅速成為培養基中的優勢菌株。對于氨氮降解菌來說，溫度、溶氧、pH、游離氨濃度等條件的改變都有可能使氨氮降解菌成為混合培養物中的優勢菌株，從而更易被分離[7]。此外，也有研究通過在培養基中添加指示劑，來推測目的菌株的存在[8]。但上述方法均存在選擇性不強、工作量大的問題。本研究采取活性污泥進行梯度馴化，同時采用PCR-DGGE指紋圖譜技術輔助分析馴化時活性污泥中細菌豐度的變化。試驗表明，既具有較強氨氮降解能力，同時又是馴化活性污泥中的優勢菌的只有反硝化菌，因而可初步選擇反硝化菌為目標菌。DGGE膠圖中其他割取條帶所對應的可培養優勢菌株還包括假單胞菌屬、溶桿菌屬等。根據文獻報道，溶桿菌和假單胞菌在污水處理中也均可不同程度地降解氨氮[9-10]。此外，本試驗中水平和垂直馴化之間的反硝化菌含量有差異。這可能是由于垂直馴化時活性污泥需不斷轉接，培養周期較長而導致反硝化菌優勢喪失引起，需進一步研究。結果提示，PCR-DGGE技術可作為平板篩選的一種輔助手段，在處理養殖污水的活性污泥中獲得功能優勢菌。

本研究中，3株分離得到的氨氮降解菌經過測序后分別屬于戈登氏菌屬、反硝化菌屬和紅球菌屬。目前尚無這3屬細菌有氨氧化作用的報道。細菌降解氨氮通常有2條途徑，即同化吸收和氨氧化作用，其中氨氧化作用又分為自養氨氧化與厭氧氨氧化。陳元芬等[11]發現，自養氨氧化菌株或菌群在富含氨氮的水體中會迅速降解氨氮并積累亞硝酸鹽；喻其林等[12]發現，能進行厭氧氨氧化的菌株在培養過程中能同時利用氨氮和亞硝酸鹽，從而達到降解氨氮的效果。此外，部分微生物也能夠吸收環境中的氨氮來進行自身物質的合成[13]。本研究曾嘗試對ZZC-4菌株的培養液進行亞硝酸鹽和硝酸鹽檢測，但發現兩者均處于極低水平，且氨氮濃度已經大幅下降，故推測該菌株可能采用同化利用氨氮的方式降解污水中的氨氮，但其具體機制需要進一步驗證。

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(責任編輯 高 峻)

PCR-DGGE assisted selection of ammonia degrading bacteria

ZHANG Zhichao1， SUN Hong2， WU Yifei2， WANG Xin2， YAO Xiaohong2， LIU Yong2， TANG Jiangwu2，*， GE Xiangyang1，*

(1.StateKeyLaboratoryofMicrobiology，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430030，China;2.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

In the present study， strains able to efficiently degrade ammonia in livestock waste water were screened with traditional enrichment selection method combined with PCR-denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Twenty-two strains were screened out after domestication under different ammonia concentrations. Among them， 3 strains exhibited relatively higher ammonia degradation abilities， and were named as ZZC-3， ZZC-4 and ZZC-14， respectively， which were identified asGordoniasp.，Denitrobactersp. andRhodococcussp. by 16S rDNA sequence analysis. The PCR-DGGE results confirmed that theDenitrobactersp. had the highest concentrations in the enriched solution of waste water. Therefore， strain ZZC-4 was selected as the target strain. After incubation for 144 h， the treatment with strain ZZC-4 reached the highest degradation efficiency， which was 90.8% for ammonia nitrogen and 94.7% for COD, respectively.

PCR-DGGE; ammonia degradation;Denitrobactersp.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.15

2016-05-30

浙江省重點研發計劃項目(2015C03013)；浙江省農科院青年人才培養項目

張智超(1989—)，男，河南駐馬店人，碩士研究生，從事環境污染處理方面的研究。E-mail: 116113258@qq.com

*通信作者，葛向陽，E-mail: gxy@mail.hzau.edu.cn；湯江武，E-mail: tangjiangwu@gmail.com

X703

A

1004-1524(2017)02-0286-06